專利名稱：基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子vegf表位的疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長 因子VEGF的模擬表位及用該模擬表位構(gòu)建的在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)出針對VEGF分子自
身抗體的多肽表位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、 VEGF分子及其單克隆抗體的相關(guān)研究 1. 1 VEGF分子
VEGF相對分子量為34-42 KD，是由分子量為17-22KD的同源二聚體通過二 硫鍵聯(lián)接而成。人類VEGF的基因結(jié)構(gòu)位于染色體的6p21.3，該基因全長為28kb， 編碼VEGF的基因長約1.4萬個堿基對，由8個外顯子和7個內(nèi)含子交替構(gòu)成。 由于VEGF mRNA的不同剪切方式可使其有5種VEGF異構(gòu)體。根據(jù)氨基酸的 大小命名為V EGF206 (包含所有外顯子及部分第7個內(nèi)含子)、VEGF189 (包 含8個外顯子)、VEGF165(缺少外顯子6)、 VEGF145(缺少外顯子7)及VEGF121 (缺少外顯子6和7)，體內(nèi)以VEGF165較為常見。5種VEGF的異構(gòu)體都具有 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生的相對活性，其功能上的差異主要在于它們與細(xì)胞表面和細(xì)胞 外基質(zhì)中肝素的親和力不同。
VEGF分子通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。其主 要的生物學(xué)功能是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生長和增加血管通透性?，F(xiàn)己證 明，VEGF與受體結(jié)合后可以迅速增加細(xì)胞內(nèi)C^水平，通過磷酸肌醇特異性磷 酸脂酶C途徑，使細(xì)胞內(nèi)IP3水平升高，傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號，最終完成生物學(xué)效應(yīng)。
1. 2 VEGF單克隆抗體的發(fā)展現(xiàn)狀過去的大約30年中，由K6hler和Milstein提出的單克隆抗體技術(shù)己經(jīng)為一系 列疾病的的體外診斷提供了契機(jī)。然而，單克隆抗體的特異性識別抗原的特性在 人類疾病的免疫治療只是在近10年中才嶄露頭角。目前，單克隆抗體(mAbs) 在臨床中被用于癌癥的診斷和治療，控制自體免疫性疾病、移植物抗宿主反應(yīng)和 同種異體移植排斥，以及治療細(xì)菌感染引發(fā)的腦(脊)髓炎、心肌損傷和可逆的 藥物中毒等。
VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生長作用最強(qiáng)的分子之一，多種腫瘤都高分泌該分子; 因此該分子成為抗血管生成治療腫瘤方法中的重要耙標(biāo)。阿瓦斯汀(Avastin)是 一種人源化抗VEGF單克隆抗體，可與人VEGF結(jié)合，阻斷VEGF與受體結(jié)合后 介導(dǎo)的下游信號通路，從而抑制人VEGF的生物學(xué)活性，包括抑制內(nèi)皮細(xì)胞促有 絲分裂活性、血管通透性增加活性和促血管生成活性，達(dá)到抗腫瘤目的。
Avastin是第一個被FDA批準(zhǔn)用于抗腫瘤血管生成治療的單克隆抗體制劑， 2004年由FDA批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌的治療，它的出現(xiàn)為抗腫瘤血管 生成療法開創(chuàng)了新天地。Avastin優(yōu)勢有其作用靶點(diǎn)直接暴露于血液中，便于藥 物直接作用；靶點(diǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生抗藥性；無需考慮腫瘤組織學(xué)特性； 可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；有下游放大效應(yīng)；不良反應(yīng)相對小。Avastin與放、化療聯(lián)合具 有協(xié)同作用(1)可使腫瘤區(qū)血管生成正常化，組織間高壓減輕，利于化療藥向 腫瘤區(qū)輸送；(2)放、化療所致局部腫瘤區(qū)缺氧可促VEGF表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞 抵抗放、化療的凋亡誘導(dǎo)機(jī)制，而聯(lián)用Avastin將預(yù)防這種繼發(fā)的保護(hù)效應(yīng)，使治 療反應(yīng)增敏。
Avastin不良反應(yīng)主要是出血和胃腸穿孔，另外還有虛弱、疼痛、高血壓、腹 瀉、白細(xì)胞減少、腹痛、頭痛、惡心、嘔吐、食欲缺乏、口腔炎、深部靜脈血栓 形成、腹內(nèi)血栓、便秘、上呼吸道感染、剝脫性皮炎、呼吸困難、蛋白尿等。罕 見的嚴(yán)重不良反應(yīng)有腸梗阻、腸壞死、腸系膜靜脈閉賽、吻合處潰瘍、低鈉血癥 等。Avastin用藥量375mg/m2，每周1次靜脈滴注共4次為1療程，平均1療程費(fèi) 用為10萬人民幣左右，花費(fèi)高昂。2、噬菌體表面隨機(jī)呈現(xiàn)肽庫技術(shù)
1985年，Smith報道了外源多肽在單鏈?zhǔn)删w表面呈現(xiàn)的結(jié)果，由此發(fā)展起 來的噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)近幾年來得到迅速發(fā)展，成為生物學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域中 有效而重要的工具。該技術(shù)是將編碼外源多肽或蛋白的基因片斷插入噬菌體衣殼 蛋白的基因中，從而將外源多肽或蛋白呈現(xiàn)于噬菌體表面。由于構(gòu)成外源基因片 段的脫氧核苷酸可以隨機(jī)的排列組合，所以可以構(gòu)建呈現(xiàn)不同外源多肽或蛋白的 噬菌體表面呈現(xiàn)多肽或蛋白庫，進(jìn)而應(yīng)用于酶底物的篩選，抗體的篩選，配體的 篩選，蛋白間相互作用的研究，疾病的診斷等方面。
絲狀噬菌體是一類具有絲桿狀形態(tài)的噬菌體，在分類中屬于絲桿噬菌體科 (Inoviride)，絲狀噬菌體屬(Inovirus)。用于表面呈現(xiàn)的噬菌體為一類特異性 感染大腸桿菌的噬菌體，包括M13、 fd、 fl、 Ifl和Ike等，它們具有相似的結(jié)構(gòu)。 以M13噬菌體為例，它的楊L、為6000bp的環(huán)狀單鏈DNA，含10個基因，分別編 碼10種不同的蛋白。其中基因VIII編碼主要衣殼蛋白pVIII，基因III， VI， VII, IX分別編碼次要衣殼蛋白pIII、 pVI、 pVII、 pIX。 M13噬菌體以其次要衣殼蛋白 pIII僅感染具F纖毛的大腸桿菌。
絲狀噬菌體自身有許多適于構(gòu)建多肽庫的特點(diǎn)。如它能夠接受在衣殼蛋白中 插入外源多肽，并將外源蛋白表達(dá)后呈現(xiàn)于病毒顆粒表面，便于被相應(yīng)的受體或 抗體識別。即使外源序列干擾病毒的生活周期，也能通過雙基因或噬菌粒系統(tǒng)將 多肽表達(dá)于表面，產(chǎn)生攜帶野生型和重組衣殼蛋白的嵌合噬菌體。易于擴(kuò)增，重 組后的噬菌體能夠通過感染大腸桿菌得到擴(kuò)增。對于篩選到的能夠特異性結(jié)合某 一耙分子的多肽噬菌體也能夠再感染大腸桿菌，擴(kuò)增后測序分析其核苷酸序列。 噬菌體在各種洗脫條件(如低pH)下仍然很穩(wěn)定，可以感染形成很高的滴度(一 般達(dá)到1012)，這樣高的滴度足以代表庫中所有的克隆。
噬菌體顯示技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為人們大規(guī)模發(fā)展和篩選新型抗腫瘤藥物提供了強(qiáng)有力的手段。同時隨著噬菌體展示多肽庫技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用小肽模擬抗原抗 體反應(yīng)已成為發(fā)展的趨勢。這是因?yàn)?l)含有關(guān)鍵殘基的短肽能夠模擬蛋白質(zhì)上 的抗原決定簇；(2)多數(shù)情況下，幾個關(guān)鍵殘基與它的結(jié)合分子所形成的非共價鍵
構(gòu)成了全部結(jié)合的主要部分，即蛋白質(zhì)之間的相互作用是通過局部肽段間的相互 作用實(shí)現(xiàn)的。
從隨機(jī)肽庫中篩選與目的篩選物相結(jié)合的小肽，已有多篇文獻(xiàn)成功報道，篩 選的成功與否有賴于高質(zhì)量肽庫及高純度的篩選物。有文獻(xiàn)報道，將篩選方法稍 做修飾，即可用復(fù)合物如全血清或其他體液從肽庫中篩選與目的物結(jié)合的小肽。 己有多個研究小組證實(shí)，利用多克隆血清從隨機(jī)肽庫中篩選出疾病專一的模擬抗 原決定簇是可能的。這種方法在預(yù)先不知道抗原任何信息的情況下，從一個大的 肽庫中篩選出呈現(xiàn)特異性模擬抗原決定簇的噬菌體，這種特異性噬菌體只能與病 人血清反應(yīng)而不與正常血清反應(yīng)。并且模擬抗原決定簇的序列是否與原始分子相
似都不會影響它應(yīng)用于疫苗，因而在新發(fā)現(xiàn)的疾病方面更有意義。Cortese實(shí)驗(yàn)
小組進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，成功地篩選到能夠與某些疾病患者血清中抗體結(jié)合，而并
不與正常對照結(jié)合地小肽。Prezzi等用感染了人丙肝病毒(HCV)的人血清做為
篩選物，獲得的噬菌體小肽能夠與病人血清反應(yīng)，而與對照血清無反應(yīng)。以此類
肽為抗原免疫兔獲得的抗體可識別HCV蛋白?，F(xiàn)已商品化的人乙肝病毒疫苗，包
括純化的基因工程重組人乙肝疫苗都是通過此方法而制備的。
噬菌體短3太庫技術(shù)具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。在^f究蛋白間的相互識
別，蛋白折疊及空間構(gòu)象的預(yù)測，肽與有機(jī)物間的相互作用以及酶與底物的結(jié)合，
抗體與抗原的相互作用，激素與受體的結(jié)合等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。在諸
如疫苗的設(shè)計、基因定位、小分子藥物的開發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
3、治療性疫苗 3. 1研究進(jìn)展近年來，針對人類自身蛋白的單克隆抗體在治療急、慢性疾病的過程中顯示 出了良好的效果。但是，造價的昂貴和使用上的不便限制了單克隆抗體的廣泛應(yīng) 用，因此，由被動地接受這種抗體蛋白轉(zhuǎn)向?qū)で筢槍θ祟愖陨淼鞍椎闹鲃用庖咭?苗，既用主動免疫的治療方式替代被動免疫，成為蛋白藥物的發(fā)展方向。目前， 治療性疫苗的研究己成為一個熱點(diǎn)，涉及很多疾病，如慢性病毒感染、過敏、 腫瘤、阿爾海默茨病、糖尿病、高血壓、肥胖癥以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。
治療性疫苗使人的免疫系統(tǒng)發(fā)生有利于患者的反應(yīng)。大部分的疫苗可以分為 兩大類 一類是誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體；另一類是誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生 細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)。后一類治療性疫苗主要用于腫瘤和 病毒感染性疾病的治療。
誘導(dǎo)抗體來治療感染性疾病是一種有效的治療方法，絕大多數(shù)的預(yù)防性疫苗 都是通過誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生來保護(hù)機(jī)體的。與預(yù)防性疫苗相比，治療性疫苗的發(fā)展 就要緩慢的多，直到近幾年治療性疫苗才看到成功的希望。同時，單克隆抗體在 治療疾病方面所取得的巨大成功預(yù)示著能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的治療性疫苗有 著廣闊的發(fā)展前景。實(shí)際上，已經(jīng)有動物試驗(yàn)表明誘導(dǎo)出一定水平的內(nèi)源性特異
性抗體來治療疾病是可能的，如阻斷TNF- a以治療炎癥性疾病。人源化的抗 TNF- a單克隆抗體已經(jīng)被證明在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和Crohn， s病(節(jié)斷性回腸 炎)方面十分有效。目前已經(jīng)有幾種TNF- a的阻斷劑上市，包括兩種單克隆抗體 (infliximab, adalimumab)和一種受體阻斷劑(etanerc印t)，它們正在幫助 成千上萬的病人減輕痛苦，而且年收入達(dá)到20億美元。所以阻斷過量表達(dá)的TNF-ot能夠達(dá)到治療疾病的效果。在動物試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)通過主動免疫可以特異性誘導(dǎo) 出TNF- ot的中和性抗體，而且誘導(dǎo)的抗體滴度足以治療動物關(guān)節(jié)炎模型。
其他的動物試驗(yàn)表明可以通過誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生高滴度抗體來治療以下疾病針 對血管緊張素的疫苗可以治療高血壓；針對IL-9的疫苗可以治療病原體引起的嗜酸性細(xì)胞增多癥；針對IL-5的疫苗可以治療哮喘；針對N-methyl-D-aspartate rec印tor-1 (國〕AR1)的疫苗可以治療中風(fēng)。另外，針對一些性激素如人絨毛膜 促性腺激素(human chorionic gonadotro- pin HCG)的免疫可以降低婦女體內(nèi) 的激素水平而達(dá)到避孕效果；針對促性腺素釋放激素(GnRH)的疫苗可以用于治 療晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治療性疫苗誘導(dǎo)出針對胃泌素 (gastrin)的抗體可以延長病人的生命。
另一類稍有不同的疫苗對安全性的要求更低一些，那就是針對上癮藥物的疫 苗。在動物試驗(yàn)中針對可卡因和尼古丁的疫苗降低了這些藥物在大腦中的水平， 消除了它們的成癮癥狀，試驗(yàn)動物在接受了免疫后對藥物不再依賴。在臨床I期 試驗(yàn)中，可卡因疫苗，皮證明有良好的耐受性，并且可以誘導(dǎo)出良好的抗體反應(yīng)， 現(xiàn)在，人們正在翹首以待它的有效性結(jié)果。 2. 2誘導(dǎo)自身抗體的理論研究
要產(chǎn)生足夠高的滴度的特異性抗體以治療相關(guān)疾病，治療性疫苗必須克服三 個障礙T細(xì)胞耐受、B細(xì)胞耐受、在沒有佐劑和抗原長效制劑的情況下誘導(dǎo)出抗 體。眾所周知，人體免疫系統(tǒng)主要是對外來入侵者發(fā)動攻擊的，而對機(jī)體本身是 不攻擊的，這可能是由于機(jī)體具有能夠識別"非我"與"自我"的能力。免疫系 統(tǒng)的這種特性通常被稱為耐受或無反應(yīng)性，耐受發(fā)生在B細(xì)胞和T細(xì)胞水平。一 般來說，T細(xì)胞耐受更嚴(yán)格一些。對許多抗原來說，在發(fā)生T細(xì)胞耐受的同時，正 常的B細(xì)胞株卻在體內(nèi)存在。實(shí)際上，有三種機(jī)制導(dǎo)致了免疫耐受細(xì)胞株剔除， 即特異性的淋巴細(xì)胞從淋巴細(xì)胞群中被徹底剔除；免疫無能，即特異性的淋巴細(xì) 胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴細(xì)胞存在，但 是由于沒有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。對T細(xì)胞來說， 誘導(dǎo)耐受和無能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但誘導(dǎo)耐受也可以在外周進(jìn)行。 B細(xì)胞耐受主要在骨髓中誘導(dǎo)，但也可在外周誘導(dǎo)。通常，對于普遍表達(dá)的豐富抗原的免疫耐受更容易闡明。
在針對外來抗原的免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞和B細(xì)胞互相配合才能有效地產(chǎn)生抗
體當(dāng)受到外來抗原免疫時，特異性的B細(xì)胞結(jié)合抗原，產(chǎn)生起始的激活信號。
另外，B細(xì)胞內(nèi)吞抗原，在其表面呈現(xiàn)抗原肽和MHCII類分子的復(fù)合物。通常，B 細(xì)胞不能激活TH細(xì)胞。要激活TH細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞是必不可少的，樹突狀細(xì)胞 攝取抗原，并在其細(xì)胞表面呈遞抗原肽和MHCII類分子的復(fù)合物，激活TH細(xì)胞。 激活后的TH細(xì)胞識別B細(xì)胞表面呈現(xiàn)的抗原肽和MHC II類分子的復(fù)合物，弓胞B 細(xì)胞增殖、抗體的產(chǎn)生以及抗體類別的轉(zhuǎn)換。如果因?yàn)槊庖吣褪芏狈H細(xì)胞的 協(xié)同作用，那么就不會產(chǎn)生抗體。在針對自身蛋白的疫苗的設(shè)計過程中，如果將 自身抗原與外源蛋白或多肽載體融合，或偶聯(lián)在一起，就有可能繞過TH細(xì)胞耐受: 自身抗原特異性的B細(xì)胞就能夠攝取該自身抗原以及與其相聯(lián)的載體蛋白，并在 其表面呈現(xiàn)載體肽與MHCII類分子的復(fù)合物，由于TH細(xì)胞對載體蛋白沒有免疫耐 受，所以能夠被激活，從而協(xié)同自抗原特異性的B細(xì)胞產(chǎn)生針對自身抗原的特異 性抗體。
與T細(xì)胞耐受相比，B細(xì)胞耐受要寬松得多。實(shí)際上，在許多情況下，自身特 異性B細(xì)胞在體內(nèi)以正常的頻率出現(xiàn)，如果受到抗原和TH細(xì)胞的共同作用就會被 激活。所以對許多可溶性自身蛋白來講，體內(nèi)存在其特異性B細(xì)胞株，尤其當(dāng)這 種蛋白不是非常富余表達(dá)的時候更是這樣。對于這類蛋白或多肽，將其與載體蛋 白相聯(lián)，繞過T細(xì)胞耐受，就有可能產(chǎn)生有效的疫苗。實(shí)際上，利用這種策略， 針對多種自身激素的抗體反應(yīng)已經(jīng)被誘導(dǎo)出來了 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的 疫苗及其制備方法，利用噬菌體表面隨機(jī)呈現(xiàn)肽庫技術(shù)篩選出模擬VEGF表位的12 肽，在模擬表位的基礎(chǔ)上構(gòu)建在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)出針對VEGF分子自身抗體的多肽表位疫苗，提供以VEGF為靶點(diǎn)的腫瘤治療性疫苗開發(fā)和設(shè)計的策略。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克 隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位，其氨基酸序列為 Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro;所述的t莫擬表位與VEGF
的蛋白序列無同源性。
構(gòu)建能夠誘導(dǎo)針對VEGF分子產(chǎn)生自身抗體的疫苗，將上述的模擬表位化學(xué)偶 聯(lián)于蛋白載體鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)，其連接方式為 KLH -Asp—His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Hi s—Thr-His-Pro 。
所述的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位的制備方法，按以下步驟進(jìn)
行
a)噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)12肽庫的篩選 首先菌體滴度的測定
噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫(Ph.D. _12 Phage display p印tide library) 噬菌體感染宿主后，加入20 mg/mL的X-gal和50mg/mL的IPTG孵育過夜；觀察 平板，計數(shù)藍(lán)色噬斑并乘以該平板中噬菌體樣品的稀釋倍數(shù)，得到每10 pi Ph. D. 一12"噬菌體的滴度，以藍(lán)色噬斑形成單位表示(plaque forming units, pfu);
其次生物淘洗
(1) 接種噬菌體宿主細(xì)菌于含四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)；
(2) 以0. lmol/L的NaHC03為溶劑配制pH為8. 6、Avastin的濃度為100)iig/mL 的Avastin溶液，將Avastin溶液包被ELISA板孔過夜；將過夜后的96孔板倒扣 在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體，然后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% BSA的TBS溶液4'C孵 育2h;再采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween 20的TBST ^^條6次，每次均要將96孑L板 倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體;所述TBS溶液為50mM的pH值為7. 5的Tris 一HC1溶液；(3)加入200 fil質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. B的Tween 20的TBST稀釋的含2xlOupfu的 Ph.D.—12"噬菌體溶液，室溫孵育lh;傾去液體，去除未結(jié)合的噬菌體，再用質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為0. B的Tween 20的TBST洗滌10次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙 巾上，除盡殘余液沐用100ML洗脫液洗脫結(jié)合的噬菌體，并加入15ml中和液； 取1I4J則滴度，剩余液體加入20 mL處于對數(shù)生長早期的宿主培養(yǎng)物中，于37。C 劇烈振蕩培養(yǎng)4. 5h，得到擴(kuò)增的噬菌體；所述的洗脫液為含0. 2mol/L的 Glycine-HC1和pH值為2. 2的10g/L的BSA的混合溶液;所述的中和液為pH值為 9.1的lmol/L的Tris-HCl溶液；
(4)將擴(kuò)增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液轉(zhuǎn)入離心管，4。C條件下離心 10000rpm X10min;上清液轉(zhuǎn)入離心管，4。C條件下10000rpm X 10min再離心一 次；取80%的上清液轉(zhuǎn)入離心管，加入3ml的PEG8000/NaCl溶液4"C靜置過夜； 次日，4"C離心10000rpmX15min，傾去離心上清液；用lmL的TBS重懸沉淀，于 4。C離心10000卬mX5min，沉淀殘留的細(xì)胞；上清加入150ul的PEG-8000/NaCl 冰浴lh, 4。C離心10000rpmX15min，傾去上清，用200|uL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01%的 N我的TBS重懸沉淀，離心10000rpm Xlmin;上清液即為擴(kuò)增好的Ph. D. —12 噬菌體噬菌體洗脫液，liiL用于測滴度，余下的液體于4'C存放；所述的 PEG8000/NaCl溶液含200mg/mL的PEG-8000和2. 5M的NaCl;
(5) 按照上述第(2)步再包被ELISA板，進(jìn)行第二、三輪篩選；第二輪、 第三輪篩選中Avastin濃度分別降至為50^ig/m、 20|ig/mL，分別加入2xlOupfu在 第一輪、二輪篩選出的擴(kuò)增好的Ph. D. —12噬菌體，操作步驟按上述篩選步驟(l) -(4)進(jìn)行；TBST的Tween20濃度均提高至0. 5%;第三輪的洗脫產(chǎn)物不需進(jìn)行擴(kuò) 增，取lul測定滴度；(6) 從第三次篩選后噬菌體滴度測定中，菌斑數(shù)<100的平板上隨機(jī)挑取80 個分隔良好噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增和純化，挑取的噬菌斑培養(yǎng)的時間不超過18h;所述的擴(kuò)增和純化:用無菌牙簽蘸取的80個分隔良好的藍(lán)色噬菌斑分別放入對數(shù)中期
培養(yǎng)的宿主培養(yǎng)物中，37°〇劇烈振蕩培養(yǎng)4.5&后，12000rpm離心30s，將上清液 轉(zhuǎn)入新的離心管，12000rpm再離心30s，取80%的上清，即得擴(kuò)增的噬菌體懸浮 液；
b) 特異性噬菌體篩選
在上述選出的80個克隆中利用噬菌體ELISA進(jìn)一步挑選與Avast in高親和力 的克隆；
(1 )以100mg/L的Avastin包被96孔酶聯(lián)板，每孑L200fiL，同時對每個Avastin 孔設(shè)立白介素15 (IL-15)單抗為陰性對照，4。C孵育過夜；
(2) 傾去包被液，加入封閉液4。C封閉2h;傾去封閉液，TBST清洗6次， 每次均要將96 L板倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體；將80個純化的噬菌體 按1X 109/孔分別加入Avastin、 IL-15單抗包被孔中室溫孵育2h;所述的封閉液 含5mg/L的BSA和0. lmol/L的NaHC03的混合溶液，該封閉液的pH值為8. 6的；
(3) TBST清洗6次，每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的1:5000的小 鼠抗M13噬菌體抗體100 uL，室溫孵育lh; TBST清洗6次，鄰苯二胺
(0-Phenylenediamine )顯色后測定A490nm處的吸光值；
(4) 根據(jù)A490nm處的吸光值，篩選出42個與Avastin有較高親和力而與其 他對照親和力低的克隆進(jìn)行序列測定;篩選方法:噬菌體與Avastin結(jié)合后A490nm 吸光值大于0. 5，同時與對照組A490nm吸光值的比大于3;
c) 噬菌體呈現(xiàn)肽的序歹頓!l定 (1)噬菌體單鏈DNA的提取
噬菌體克隆的擴(kuò)增后，取噬菌體培養(yǎng)上清，用單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌 體單鏈DNA的提取，紫外定量其濃度大于100ng/ P L; (2 ) Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列以噬菌體單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的測序引物， 引物序列為ccctc atagt tagcg taacg，在DNA自動測序儀上進(jìn)行自動測序； (3)呈現(xiàn)隨機(jī)肽氨基酸序列的推導(dǎo) 根據(jù)DNA測序結(jié)果，得出噬菌體所呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列，得出序列如下: Asp-Hi s_Thr-Leu_Tyr—Thr-Pro-Tyr-Hi s-Thr-Hi s-Pro 。
所述的能夠誘導(dǎo)針對VEGF分子產(chǎn)生自身抗體的疫苗的制備方法，采用以下步
驟
(1) 化學(xué)合成如權(quán)利要求1所述的模擬表位多肽 Asp-Hi s-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr —Hi s-Thr-Hi s-Pro;
(2) 采用戊二醛法將合成多肽表位與KLH化學(xué)偶聯(lián)將KLH融于pH值為10 的硼酸鹽緩沖液中震蕩，加入步驟(1)合成的模擬表位多肽，緩慢滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 3%的戊二醛溶液，震蕩2小時，加入0. 25毫升lmol/L的甘氨酸，30分鐘后 終止反應(yīng)；分離，將偶ra在pH值為8. 5的硼酸鹽緩沖液中4X:透析過夜，更換 緩沖液繼續(xù)透析4小時以上得到純化的偶聯(lián)物;KLH與模擬表位多肽的質(zhì)量比為2: 3， KLH與戊二醛溶液的摩爾比為10: 3;
(3)打點(diǎn)印跡(Dot Blot)鑒定偶聯(lián)物，在打點(diǎn)印跡中能與Avastin結(jié)合的偶 聯(lián)物即為人VEGF模擬表位構(gòu)建的多肽疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)效果本發(fā)明利用己商品化的VEGF單抗Avastin為耙分子從噬 菌體隨即呈現(xiàn)肽庫中篩選出與Avastin結(jié)合的肽，化學(xué)合成該肽，并與鑰孔血藍(lán) 蛋白(Keyhole li即et hemocyanin， KLH)進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，成功的構(gòu)建疫苗。聯(lián)合弗 氏佐劑免疫健康成年BALB/c小鼠，誘導(dǎo)出針對人VEGF的抗血清，并且該抗血清 能夠發(fā)揮與Avastin —致的功能，制備的模擬表位多肽能夠與Avastin高親和； 構(gòu)建的模擬表位多肽疫苗使用篩選出的VEGF模擬表位結(jié)合載體蛋白KLH來突破自 體免疫耐受，產(chǎn)生針對VEGF的中和抗體；模擬表位多肽疫苗聯(lián)合弗氏佐劑免疫健康成年BALB/c小鼠，可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出針對該表位的抗血清；該抗血清能夠 與VEGF結(jié)合；能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。從而應(yīng)用主動免疫的方法來 替代Avastin單抗的被動免疫治療方式，減少了單抗副作用，減輕了病患負(fù)擔(dān)； 提供了以VEGF為靶點(diǎn)的腫瘤治療性疫苗新的開發(fā)和設(shè)計的策略。


圖1是篩選出42個與Avastin有較高親和力而與對照(人IL-15單抗)親和 力低的噬菌體克隆的ELISA結(jié)果黑色框?yàn)殛栃允删w與Avasdtin的結(jié)合結(jié)果; 白色框?yàn)榕c人IL-15單抗的結(jié)合結(jié)果，縱坐標(biāo)為490nm處的吸光值，橫坐標(biāo)為陽 性噬菌體編號；
圖2是KLH-模擬表位12肽(KLH-12P)與Avastin的Dot Blot鑒定圖。
圖3是ELISA檢測KLH-12P抗血清與VEGF的結(jié)合圖結(jié)果統(tǒng)計圖，黑色為 KLH-12P抗血清，白色為KLH抗血清，灰色為KLH-對照12P抗血清；1血清稀釋 100倍，2為血清稀釋50倍，3為血清稀釋25倍，縱坐標(biāo)為490nm處吸光值。
圖4是MTT法檢測抗血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖結(jié)果統(tǒng)計圖，黑色框?yàn)镵LH抗 血清，白色框?yàn)镵LH-對照12P抗血清、灰色框?yàn)镵LH-12P抗血清，1為血清稀釋 100倍、2為血清稀釋50倍、3為血清稀釋25倍，縱坐標(biāo)為490nm處吸光值。
圖5抗血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移結(jié)果統(tǒng)計圖，1為稀釋25倍KLH抗血清，2 為稀釋25倍的KLH-對照12P抗血清，3為稀釋25倍KLH-12P抗血清，縱坐標(biāo)為 細(xì)胞計數(shù)；
圖6是抗血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移電鏡圖，6a圖為稀釋25倍KLH抗血清， 6b圖為稀釋25倍KLH-對照12P抗血清，6c圖為稀釋25倍KLH-12P抗血清。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。依照本發(fā)明的技術(shù)方案制備的VEGF治療性自體疫苗首先應(yīng)用親和篩選的方法 利用Avastin為配體在噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)12肽庫(BioLabs , New England)中篩 選得到高親和力的 12 多肽模擬表位 Asp-Hi s-Thr-Leu_Tyr-Thr-Pro-Tyr-Hi s-Thr-Hi s_Pro (天冬氨酸-組氨酸-蘇氨酸 -亮氨酸-酪氨酸-蘇氨酸-脯氨酸-酪氨酸-組氨酸-蘇氨酸-組氨酸-脯氨酸)，化學(xué) 合成該表位以后，應(yīng)用戊二醛法將其與KLH進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，得到能夠打破自體免 疫耐受、產(chǎn)生自體抗體的疫苗。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的肽庫篩選，疫苗構(gòu)建，以及免疫動物，抗體檢定工作，按以下 步驟完成
3. 1.噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)12月太庫的篩選
噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫(Ph.D. —12 Phage display p印tide library) 購自美國New England Biolabs公司，其滴度為1. 5X10"噬斑形成單位(pfu) /mL;多樣性為2.7X109transformants。宿主菌為具有四環(huán)素抗性的攜帶有可被 噬菌體感染的F'因子的大腸桿菌E. coli ER2738,可與呈現(xiàn)了 12肽的噬菌體形成 ot互補(bǔ)。目的蛋白的DNA測序引物(-96gIIIsequencing primer)序列為ccctc atagt tagcg taacg。
3. 1. l噬菌體滴度的測定
(1) E. coli ER2738的培養(yǎng)以無菌操作從ER2738大腸桿菌的甘油凍存物 中挑取一接種環(huán)，接種于四環(huán)素抗性的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5 g/L，瓊月旨15 g/L， NaCllO g/L)上，37°C培養(yǎng)24 h，待平板上可見白色透亮 的菌落形成后，將基本培養(yǎng)平板置于4。C保存。
(2) 從上述步驟(1)的平板上挑取E.coli ER2738單菌落接種于含20mg/L 四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L， NaCllO g/L), 37°C 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD600約為0.5)。(3) 將Ph. D. —12"噬菌體用LB培養(yǎng)液進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋，對于擴(kuò)增 后的噬菌體培養(yǎng)上清液稀釋108-10H對于未擴(kuò)增的篩選洗脫液稀釋101-104倍。
(4) 稀釋后的Ph.D. —12"噬菌體樣品取10 pi,分別加入到步驟(2)培養(yǎng) 好200^1的細(xì)菌培養(yǎng)液中，快速混勻，室溫孵育l-5 min。
(5) 各感染噬菌體的細(xì)菌分別移入45°C預(yù)溫、含有頂層瓊脂3—5ml的培 養(yǎng)管中(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， NaCllO g/L， MgCl2 6H201 g/L， 瓊脂糖7 g/L)，加入40 |dl 20 mg/mL的X-gal和16 50mg/mL的IPTG，充分 混勻，然后迅速倒入預(yù)溫的LB平板，傾斜使頂層瓊脂均勻分布。
(6) 將平板放置5min，使溫度降低，然后反轉(zhuǎn)平板，37。C孵育過夜。 觀察平板，計數(shù)藍(lán)色噬斑并乘以該平板中噬菌體樣品的稀釋倍數(shù)，得到每10
III Ph. D. —12，噬菌體的滴度，以藍(lán)色噬斑形成單位表示(plaque forming units, pfu)。
3. 1. 2.生物淘洗
(1) 預(yù)先接種ER2738于10 mL (測滴度用)和20 mL (擴(kuò)增噬菌體用)的 含四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中，37。C培養(yǎng)。
(2) 在96孔板中加入200pL 100)ng/mL Avastin溶液(0. lmol/L NaHC03， pH8.6稀釋)，置于密閉的濕盒中輕輕搖動，4。C孵育過夜。
(3) 將(2)中的96孔板取出，傾去液體，將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，
輕扣除盡殘余液體。
(4) 加入200juL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA-TBS封閉液，4。C孵育2h，所述TBS 溶液為50mM的pH值為7. 5的Tris—HC1溶液；
(5) TBST(TBS+0. l%Tween 20)洗滌6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的 紙巾上，輕扣除盡殘余液體。(6) 加入200 jiL TBST (TBS+0. l%Tween 20)稀釋的含2xl0"pfu的Ph. D. —12 噬菌體溶液，室溫孵育lh。
(7) 傾去液體，去除未結(jié)合的噬菌體，TBST(TBS+O. l%Tween 20)洗滌10次， 每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，輕扣除盡殘余液體。
(8) 用100 [iL洗脫液(0.2mol/L Glycine-HC1， pH 2.2， 10g/L BSA)洗脫 結(jié)合的噬菌體，并迅速加入15毫升中和液(lmol/LTris-HCl， pH9. 1);取lpL 測滴度，剩余的中和后的洗脫液加入20 mL處于對數(shù)生長早期的R2738培養(yǎng)物中， 于37°C劇烈振蕩培養(yǎng)4. 5h，進(jìn)行擴(kuò)增。
(9) 將(8)中擴(kuò)增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液倒入離心管，于4。C， lOOOOrpm離心10min。將離心上清轉(zhuǎn)入新的離心管，同法再離心一次，取80。/0的 離心上清入新的離心管。
(10) 在離心管中加入3毫升PEG8000/NaCl (200 mg/mL PEG-8000, 2. 5M NaCl)，于4。C靜置過夜。
(11) 次日取出PEG8000/NaCl沉淀好的液體，4°C條件下離心lOOOOrpm X 15min，小心的傾去離心上清；再同法快速離心一下，用微量移液器吸盡殘留上清。
(12) 用1 mLTBS重懸離心沉淀，將重懸液轉(zhuǎn)入小離心管中，4°C條件下離 心lOOOOrpm X5min，將殘留的細(xì)胞沉淀。
(13) 將離心上清移入新的小離心管中，加入150ul的PEG8000/NaCl冰浴1 h。 4。C條件下離心lOOOOrpm X15min，小心的傾去離心上清；再同法快速離心一 下，用微量移液器吸盡殘留上清。
(14) 用200|nL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01%的NaN3的TBS重懸沉淀，離心lOOOOrpm Xlmin以沉淀分離。將上清液移入新的離心管，即為擴(kuò)增好的噬菌體，lpL用于 測滴度，余下的液體于4。C存放。(15) 用200 Avastin溶液新包被96孔板一孔，用于下一輪篩選，為了 提高篩選肽的嚴(yán)謹(jǐn)性，第二輪和第三輪篩選中，Avast in的濃度分別降至50pg/mL 、 20嗎/mL。
(16) 觀察步驟14中測滴度的結(jié)果，計數(shù)藍(lán)斑的數(shù)量以確定噬菌體的滴度， 該噬菌體用于第二輪的篩選。在第二輪的篩選中，加入的噬菌體量為2xl0"pfu， 體積根據(jù)步驟14所測定的滴度計算。
(17) 進(jìn)行第二輪篩選，重復(fù)步驟2-15，并將TBST中Tween20的濃度提高 至O. 5%。
(18) 用200pL目的蛋白溶液，濃度新包被96孔板一孔，用于第三輪篩選。 重復(fù)步驟2-8， TBST中Tween的濃度為0. 5%，第三輪的洗脫產(chǎn)物不需進(jìn)行擴(kuò)增， 取lluL進(jìn)行滴度測定，剩余存放于4。C。從滴度測定中，菌斑數(shù)<100的平板上隨 機(jī)挑取80個分隔良好噬菌斑按下列方法進(jìn)行擴(kuò)增和純化，此時應(yīng)注意挑取的噬菌 斑培養(yǎng)的時間不能超過18h。經(jīng)過三輪篩選，特異性噬菌體進(jìn)一步被富集，得到 的噬菌體滴度逐步升高。如表1所示。
表l:噬菌體篩選滴度測定結(jié)果
篩選次數(shù)平均滴度
第一輪1. 5X 109 pfu
第二輪4.3X 109 pfu
第三輪1.1X1010 pfu
(19) 陽性噬菌體的擴(kuò)增，將ER2738的過夜培養(yǎng)物用LB培養(yǎng)液進(jìn)行1:100 稀釋，lmL/管分裝于50mL的培養(yǎng)管中。
(20) 將用無菌牙簽蘸取的80個分隔良好的藍(lán)色噬菌斑分別放入上述(19) 培養(yǎng)管中，37。C劇烈振蕩培養(yǎng)4 5h進(jìn)行擴(kuò)增。(21)將擴(kuò)增好的噬菌體液體倒入離心管，瞬間離心30s (12000rpm)。將離 心上清轉(zhuǎn)入新的離心管，同法再離心一次。取80%的上清，即為擴(kuò)增的噬菌體液 體。4。C下可存放幾周，若要長時間保存，可加入終濃度為50%的無菌甘油存放于 -20oC。
3. 1. 3.噬菌體特異性篩選(噬菌體ELISA)
在這挑選出的80個克隆中利用噬菌體ELISA進(jìn)一步挑選與Avastin高親和力 的克隆。
(1) 以100mg/LAvastin (0. lmol/L NaHC03， pH8. 6稀釋)包被96孔酶聯(lián) 板，每孔200pL，同時對每個Avastin孔設(shè)立人白介素15 (IL-15)單抗為陰性對 照，4"C孵育過夜。
(2) 傾去包被液，加入封閉液(5mg/L BSA， 0. lmol/L NaHC03， pH 8.6)， 4 "C封閉2h。
(3) 傾去封閉液，TBST洗6次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上， 輕輕扣除盡殘余液體。
(4) 將80個純化的噬菌體(1X109/ L)分別加入步驟1設(shè)立的包被孔。
(5) TBST洗6次，每 L加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的小鼠抗M13噬菌 體抗體(l:5000稀釋)100yL，室溫孵育lh.
(6) TBST洗6次，鄰苯二胺(O-Phenylenediamine)顯色后測定A490nm處 的吸光值.
根據(jù)80個克隆的ELISA結(jié)果，以0D值大于0.5，目的OD值與對照OD值之 比大于3為基準(zhǔn)，篩選出42個與Avastin有較高親和力而與其他對照親和力低的 克隆，結(jié)果如圖l所示。
3. 1. 4.對篩選出42個與Avastin有較高親和力的噬菌體呈現(xiàn)肽的序列測
定(1)噬菌體單鏈DNA的提取 噬菌體克隆的擴(kuò)增同前，取噬菌體培養(yǎng)上清。用華舜公司生產(chǎn)的單鏈DNA提 取試劑盒進(jìn)行噬菌體單鏈DNA的提取，按操作說明書進(jìn)行操作在含有單個噬菌 體克隆的LB培養(yǎng)液中加入沉淀液，高速離心后得到噬菌體顆粒沉淀，加入裂解液 裂解噬菌體外殼蛋白，經(jīng)過樹脂純化，洗脫得到噬菌體單鏈DNA，紫外定量其濃 度大于100ng/pL。
(2 ) Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列
以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的領(lǐng),引物，弓嫩 序列為5'~CCCTCATAGTTAGCGTMCG—3，，在ABI 310 DNA自動測序儀上進(jìn)行自動 測序。
(3)呈現(xiàn)隨機(jī)肽氨基酸序列的推導(dǎo)及氨基酸同源性分析 根據(jù)DNA測序結(jié)果，推導(dǎo)出噬菌體所呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列，得出序列如
下
Asp-Hi s_Thr-Leu-Tyr_Thr—Pro_Tyr_Hi s-Thr—Hi s—Pro
3. 2.疫苗的構(gòu)建
3. 2. 1.表位的化學(xué)合成
按照上述的多肽表位氨基酸序列結(jié)果，采用固相合成法合成以上多肽，合成 工作由西安華辰生物科技公司完成，純度為98%以上。 3. 2. 2.多肽的化學(xué)偶聯(lián)
采用戊二醛法進(jìn)行多肽與蛋白載體KLH的化學(xué)偶聯(lián)。
10mg鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole li即et hemocyanin， KLH)融于2ml pHIO的硼酸 鹽緩沖液中，溫和震蕩，加入15mg十二肽，緩慢滴入lml 0. 3%戊二醛溶液，震蕩 2小時(溶液變?yōu)辄S色)，加入lmol/L的甘氨酸作用30分鐘終止反應(yīng)。將反應(yīng)物 在pH 8. 5的硼酸鹽緩沖液中4'C透析過夜，更換緩沖液繼續(xù)透析4小時以上即可。3. 2. 3.構(gòu)建疫苗的鑒定 以D0T Blot來確定偶聯(lián)效果
(1) 將偶聯(lián)的疫苗，以及KLH以相同量(約3iig)仔細(xì)點(diǎn)在硝酸纖維素膜 (NC膜)上。
(2) 以2% BSA-TBS (pH7.5)封閉NC膜2小時以上。
(3) TBST (0. 5%Tween20)洗滌NC膜3次，每次10分鐘。
(4) 加入TBST稀釋的Avastin (4"g/ml)，室溫輕搖孵育1小時。
(5) 以同樣方法洗去未結(jié)合的Avastin。
(6) 加入TBST稀釋的堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗人二抗，室溫孵育30辦中。
(7) TBST洗去二抗，再以TBS洗去Tween 20，以i^性磷酸酶底物顯色劑 (sigma)避光顯色。
結(jié)果如圖2所示，KLH-模擬表位12肽(KLH-12P)與Avastin特異性結(jié)合， sigma顯色表現(xiàn)抗原抗體結(jié)合，如圖2所示的圓形斑塊，而對照12肽(KLH-對照 12肽)，KLH均不能成功與Avastin結(jié)合，sigma顯色沒有表現(xiàn)抗原抗體結(jié)合(在 圖2中沒有任何顏色反應(yīng))，即不能模擬VEGF的表位，說明疫苗偶聯(lián)模擬表位成 功。
3. 3.動物免疫 3. 3. 1實(shí)驗(yàn)動物
BALB/c小鼠，4周齡，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分為4組，每 組6只。
3. 3. 2實(shí)驗(yàn)材料
弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑均購自北京鼎國生物制品公司。上述制備的 候選疫苗KLH-12P、 KLH-對照12P及對照蛋白KLH。 3. 3. 3免疫辦(1) 將小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只。
(2) 分別將疫苗蛋白及載體蛋白對照與弗氏佐劑混勻，并使之完全乳化。
(3) 每兩周背部皮下多點(diǎn)注射免疫小鼠一次。每次每只免疫劑量為50 "g蛋白。
(4) 共免疫四次，首次為弗氏完全佐劑乳化，后兩次為不完全佐劑的乳化， 最后一次不加佐劑，進(jìn)行腹腔注射。
(5) 末次免疫后10日，眼球取血，并分離血清。 3. 4.抗血清鑒定
3. 4. 1. ELISA測定抗血清與VEGF的結(jié)合 3. 4. 1. 1.材料與試劑
96孔酶聯(lián)板(Costar)， NaHC03pH8.6， KLH-12P， VEGF (sigma)， HRP (辣根 過氧化物酶)標(biāo)記的抗人，及抗小鼠二抗(武漢中山生物制品公司)，ABTS (2， 2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽，sigma)。
3. 4. 1. 2.實(shí)驗(yàn)方法
(1) 以VEGF蛋白包被ELISA板(O. lMNaHC03 pH8. 6)，包被的蛋白量為50ng/ 孔，4。C過夜。
(2) 次日，棄去孔內(nèi)溶液，使用1XBSA-TBS， 4t封閉2h。
(3) 充分洗滌(3min/次，共6次)后，按照血清含量1%、 2%、 4%的梯度加 入KLH-12P免疫的抗血清，室溫振蕩孵育2h，同樣梯度加入的KLH-對照12P免 疫的抗血清、KLH免疫的抗血清做為陰性對照。
(4) 充分冼滌后(3min/次，共6次)，加入HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗，室溫振 蕩孵育lh。
(5) 充分洗滌后(3min/次，共6次)，于各個孔中加入OPD顯色液，反應(yīng)5min 后，以1M的硫酸終止反應(yīng)，ELISA讀數(shù)儀490nm處讀數(shù)。
結(jié)果如圖3所示，KLH-12P抗血清在稀釋25倍后與VEGF結(jié)合最好，在490nm處吸光值最大，而KLH-對照12P抗血清、KLH抗血清在稀釋25倍、50倍、100倍 時與VEGF的結(jié)合基本不變，在490nm處吸光值基本一致。
3. 4. 2.抗血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用 3. 4. 2. 1.材料與試劑
(1) 細(xì)胞
血管內(nèi)皮細(xì)胞(EVC)均在RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO Co)中培養(yǎng)。i咅養(yǎng)基中 含有10%小牛血清(杭州四季青生物制品廠)和100U ml-1的青霉素、鏈霉素。
(2) 抗血清
抗血清為動物免疫實(shí)驗(yàn)中收集的抗血清，KLH免疫、KLH-對照12肽免疫為陰 性對照抗血清。
(3) 試劑
MTT(3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽)、1640培養(yǎng)液、VEGF。 3. 4. 2. 2.實(shí)驗(yàn)方法
(1) 接種細(xì)胞用0. 25%的胰酶消化單層培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，用1640培養(yǎng) 液配帝喊單個細(xì)胞懸液，以每孔104細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中。
(2) 培養(yǎng)12小時后換液，為含5ng/ml VEGF的1640培養(yǎng)液，再分為三組分 別加入Anti-KLH血清、Anti-KLH-對照多肽血清、Anti-KLH-12P血清，血清為三 個梯度即1%、 2%、 4%，繼續(xù)培養(yǎng)。
(3) 繼續(xù)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞72小時，然后每孔加入MTT溶液20ul，培養(yǎng)4 小時，終止培養(yǎng)，小心吸去上清，每孔加入150ulDMS0 (二甲基亞砜)，震蕩10 分鐘。
(4) 酶標(biāo)儀490nm處讀值。
結(jié)果如圖4所示，1%及2%的KLH抗血清、KLH-對照12P抗血清、KLH-12P抗 血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用均不明顯，4。/。的KLH抗血清、KLH-對照12P抗血清 仍不能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而4%的KLH-12P抗血清能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。3. 4. 3.抗血清抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用 3. 4. 3. 1.材料與試劑
(1) 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)及抗血清如3. 4. 2. 1.所述相同
(2) 試劑Mili-Cell, 1640培養(yǎng)液，2%多聚甲醛，VEGF。 3. 4. 3. 1.方法與步驟
(1) 1640培養(yǎng)液配制1X106 /ml血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液，分為三組，分別含 4Mnti-KLH-12P血清、4%Anti-KLH血清、4。/。KLH-對照多肽抗血清。
(2) 分別接種200ul上述細(xì)胞懸液于Mili-Cell上腔，下腔均加入600ul含 5ng/ml的VEGF的1640培養(yǎng)液，37°C， 5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時。
(3) 將MILICELL上腔取出，用2°/。多聚甲醛固定10分鐘，用棉簽輕輕拭去膜 上未遷移細(xì)胞，隨后用結(jié)晶紫染色5分鐘，純水漂洗后室溫干燥。
(4) 取下濾膜置于載玻片上，顯微鏡下觀察，隨機(jī)計數(shù)5個不重復(fù)200X的 細(xì)胞數(shù)，計算平均值。
結(jié)果如圖5、圖6所示，4%的KLH抗血清、KLH-對照12P抗血清不能抑制血 管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，鏡下(200X)觀察及細(xì)胞計數(shù)均未發(fā)生明顯變化，而4%的 KLH-12P抗血清能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，鏡下(200X)觀察及細(xì)胞計數(shù)均發(fā)現(xiàn)
細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
以KLH- A印-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro免疫BALB/c 小鼠，獲得抗血清，經(jīng)ELISA檢測可以與VEGF特異性結(jié)合，滴度可達(dá)到l: 6000, 稀釋25倍的KLH- Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro(KLH-12P)抗血清能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。 綜上所述，基于 模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的疫苗(KLH-12P)能夠應(yīng)用于人體的 VEGF自體疫苗，從而以主動免疫方式來替代或補(bǔ)充單抗被動免疫治療，為克服 單抗治療缺陷打下基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1. 一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位，其特征在于利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位，其氨基酸序列為Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro。
2、 一種人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF模擬表位的制備方法，其特征在于， 按以下步驟進(jìn)行a)噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)12肽庫的篩選 首先菌體滴度的測定噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)十二肽庫(Ph.D. —12 Phage display p印tide library) 噬菌體感染宿主后，加入20 mg/mL的X-gal和50mg/mL的IPTG孵育過夜；觀察 平板，計數(shù)藍(lán)色噬斑并乘以該平板中噬菌體樣品的稀釋倍數(shù)，得到每10 pi Ph. D. 一12"噬菌體的滴度，以藍(lán)色噬斑形成單位表示(plaque forming units, pfu);其次生物淘洗(1) 接種噬菌體宿主細(xì)菌于含四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)；(2) 以0. lmol/L的NaHC03為溶劑配制pH為8. 6、Avastin的濃度為100pg/mL 的Avastin溶液，將Avastin溶液包被ELISA板孔過夜；將過夜后的96孔板倒扣 在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體，然后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% BSA的TBS溶液4"孵 育2h;再采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween 20的TBST i^條6次，每次均要將96孔板 倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體;所述TBS溶液為50mM的pH值為7. 5的Tris —HC1溶液；(3) 加入200 |il質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. m的Tween 20的TBST稀釋的含2xlOupfu的Ph.D.—12m噬菌體溶液，室溫孵育lh;傾去液體，去除未結(jié)合的噬菌體，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween 20的TBST洗滌10次，每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體；用100叱洗脫液洗脫結(jié)合的噬菌體，并加入15ml中和液； 取1叱測滴度，剩余液體加入20 mL處于對數(shù)生長早期的宿主培養(yǎng)物中，于37。C 劇烈振蕩培養(yǎng)4. 5h，得到擴(kuò)增的噬菌體；所述的洗脫液為含0. 2mol/L的 Glycine-HC1和pH值為2. 2的10g/L的BSA的混合溶液;所述的中和液為pH值為 9. 1的lmol/L的Tris-HC1溶液；(4)將擴(kuò)增好的噬菌體和大腸桿菌的混合液轉(zhuǎn)入離心管，4'C條件下離心 10000rpm X10min;上清液轉(zhuǎn)入離心管，4。C條件下lOOOOrpm X lOmin再離心一 次；取80%的上清液轉(zhuǎn)入離心管，加入3ml的PEG8000/NaCl溶液4t:靜置過夜； 次日，4。C離心10000ipmX15min，傾去離心上清液；用lmL的TBS重懸沉淀，于 4。C離心10000rpmX5min，沉淀殘留的細(xì)胞；上清加入150ul的PEG-8000/NaCl 冰浴lh， 4。C離心10000rpmX15min，傾去上清，用200|iL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 01%的 NaN3的TBS重懸沉淀，離心10000rpm Xlmin;上清液即為擴(kuò)增好的Ph. D.—12 噬菌體噬菌體洗脫液，1^用于測滴度，余下的液體于4T:存放；所述的 PEG8000/NaCl溶液含200mg/mL的PEG-8000和2. 5M的NaCl;(5) 按照上述第(2)步再包被ELISA板，進(jìn)行第二、三輪篩選；第二輪、 第三輪篩選中Avastin濃度分別降至為50^ig/m、 20pg/mL，分別加入2xl0"pfu在 第一輪、二輪篩選出的擴(kuò)增好的Ph. D. —12，噬菌體，操作步驟按上述篩選步驟(l) - (4)進(jìn)行；TBST的Tween20濃度均提高至0. 5%;第三輪的洗脫產(chǎn)物不需進(jìn)行擴(kuò) 增，取lul測定滴度；(6) 從第三次篩選后噬菌體滴度測定中，菌斑數(shù)<100的平板上隨機(jī)挑取80 個分隔良好噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增和純化，挑取的噬菌斑培養(yǎng)的時間不超過18h;所述 的擴(kuò)增和純化:用無菌牙簽蘸取的80個分隔良好的藍(lán)色噬菌斑分別放入對數(shù)中期 培養(yǎng)的宿主培養(yǎng)物中，37。C劇烈振蕩培養(yǎng)4,5h后，12000rpm離心30s，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，12000rpm再離心30s，取80%的上清，即得擴(kuò)增的噬菌體懸浮 液；b) 特異性噬菌體篩選在上述選出的80個克隆中利用噬菌體ELISA進(jìn)一步挑選與Avast in高親和力 的克??；(1) 以100mg/L的Avastin包被96孔酶聯(lián)板，每孑L200nL，同時對每個Avastin 孔設(shè)立白介素15 (IL-15)單抗為陰性對照，4"孵育過夜；(2) 傾去包被液，加入封閉液4'C封閉2h;傾去封閉液，TBST清洗6次， 每次均要將96孔板倒扣在潔凈的紙巾上，除盡殘余液體；將80個純化的噬菌體 按1X 109/孔分別加入Avastin、 IL-15單抗包被孔中室溫孵育2h;所述的封閉液 含5mg/L的BSA和0. lmol/L的NaHC03的混合溶液，該封閉液的pH值為8. 6的；(3) TBST清洗6次，每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的1:5000的小 鼠抗M13噬菌體抗體100 PL，室溫孵育lh; TBST清洗6次，鄰苯二胺(0-Phenylenediamine)顯色后測定A490nm處的吸光值；(4) 根據(jù)A490nm處的吸光值，篩選出42個與Avastin有較高親和力而與其 他對照親和力低的克隆進(jìn)行序列測定;篩選方法:噬菌體與Avastin結(jié)合后A490nm 吸光值大于0. 5，同時與對照組A490nm吸光值的比大于3;c) 噬菌體呈現(xiàn)肽的序列測定 (1)噬菌體單鏈DNA的提取噬菌體克隆的擴(kuò)增后，取噬菌體培養(yǎng)上清，用單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌 體單鏈DNA的提取，紫外定量其濃度大于100ng/ u L; (2 ) Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列以噬菌體單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的領(lǐng)U序引物， 引物序列為ccctc atagt tagcg taacg，在DNA自動測序儀上進(jìn)行自動測序；(3)呈現(xiàn)隨機(jī)肽氨基酸序列的推導(dǎo) 根據(jù)DNA觀,結(jié)果，得出噬菌體所呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列，得出序列如下: Asp-Hi s-Thrleu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-Hi s-Thr-Hi s-Pro
3. —種基于權(quán)利要求1所述的人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF的模擬表位的 抗VEGF分子的疫苗，其特征在于，所述的模擬表位化學(xué)偶聯(lián)于蛋白載體鑰孔血藍(lán) 蛋白(Keyhole limpet hemocyanin， KLH)，其連接方式為KLH-Asp-Hi s-Thr-Leu—Tyr-Thr-Pro—Tyr-Hi s-Thr-Hi s-Pro c
4. 如權(quán)利要求3所述的抗VEGF分子的疫苗，其特征在于，該疫苗針對VEGF 分子產(chǎn)生自身抗體。
5. 權(quán)利要求3所述的抗VEGF分子的疫苗的制備方法，其特征在于，采用以 下步驟(1) 化學(xué)合成如權(quán)利要求1所述的模擬表位多月太 Asp-Hi s-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr _Hi s-Thr-Hi s-Pro;(2) 采用戊二醛法將合成多肽表位與KLH化學(xué)偶聯(lián)將KLH融于pH值為10 的硼酸鹽緩沖液中震蕩，加入步驟(1)合成的模擬表位多肽，緩慢滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 3%的戊二醛溶液，震蕩2小時，加入0. 25毫升lmol/L的甘氨酸，30分鐘后 終止反應(yīng)；分離，將偶聯(lián)物在pH值為8.5的硼酸鹽緩沖液中4T:透析過夜，更換 緩沖液繼續(xù)透析4小時以上得到純化的偶聯(lián)物;KLH與模擬表位多肽的質(zhì)量比為2: 3， KLH與戊二醛溶液的摩爾比為10: 3;(3)打點(diǎn)印跡(Dot Blot)鑒定偶聯(lián)物，在打點(diǎn)印跡中能與Avastin結(jié)合的偶 聯(lián)物即為人VEGF模擬表位構(gòu)建的多肽疫苗。
全文摘要
基于模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表位的疫苗及其制備方法，利用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)技術(shù)篩選出與人鼠嵌合單克隆抗體阿瓦斯汀(Avastin)特異親和的VEGF模擬表位，其氨基酸序列為Asp-His-Thr-Leu-Tyr-Thr-Pro-Tyr-His-Thr-His-Pro；所述的模擬表位與VEGF的蛋白序列無同源性，在模擬表位的基礎(chǔ)上構(gòu)建在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)出針對VEGF分子自身抗體的多肽表位疫苗，提供以VEGF為靶點(diǎn)的腫瘤治療性疫苗開發(fā)和設(shè)計的策略VEGF是促進(jìn)血管生長作用最強(qiáng)的分子之一，是抗血管生成治療腫瘤的理想靶點(diǎn)，從而以主動免疫方式來替代或補(bǔ)充單抗被動免疫治療，為克服單抗治療缺陷打下基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/577GK101429234SQ200810232718
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者冉永剛, 張英起, 葦 韓 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)