專利名稱：重組人血管內(nèi)皮生長因子165與免疫球蛋白Fc片段融合蛋白(VEGF165-Fc)的實驗技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將人重組人血管內(nèi)皮生長因子165與人免疫球蛋白IgGl的Fc段融合基因(VEGF165-FC)轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞以大規(guī)模生產(chǎn)其蛋白產(chǎn)物的技術(shù)。
背景技術(shù)：
1. VEGF的生物學(xué)作用與應(yīng)用前景血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowth factor，VEGF)，也稱血管滲透因子(vascular permeability factor, VPF)，是由 Ferrara N 等人于 1989 年在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中純化得到的一種糖蛋白。VEGF由單一基因編碼，經(jīng)過可變剪切可形成至少5種不同的同源二聚體糖蛋白產(chǎn)物，它們分別是VEGF121，VEGF145, VEGF165，EGF189 和VEGF206。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，通過結(jié)合其受體(主要是VEGFR2)激活胞內(nèi)酪氨酸激酶，啟動下游信號通路，進而促使新脈管生長、功能調(diào)節(jié)及腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞分化和新生脈管萌芽的關(guān)鍵性刺激因子，是針對內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高，促血管生長作用最強的有絲分裂原。VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞上的兩種受體KDR和Flt-I高親和力結(jié)合后，直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖分裂，并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形成脈管結(jié)構(gòu)；VEGF還可增加微血管通透性，引起血漿蛋白如纖維蛋白原外滲，并通過誘導(dǎo)間質(zhì)產(chǎn)生而促進體內(nèi)新生血管生成，在血管發(fā)生和形成過程中起著中樞性的調(diào)控作用，對于發(fā)育及損傷修復(fù)過程中血管的形成至關(guān)重要。VEGF誘導(dǎo)的血管形成和血管通透性增加對于腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移是必需的。腫瘤細(xì)胞通過釋放VEGF激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，內(nèi)皮細(xì)胞又能通過旁分泌效應(yīng)產(chǎn)生某些生長因子刺激腫瘤細(xì)胞的生長。另外，VEGF與其它因子還能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌某些蛋白酶類，水解血管下基質(zhì)，使內(nèi)皮細(xì)胞穿過基質(zhì)向腫瘤組織遷移，腫瘤細(xì)胞則通過這些蛋白酶向反方向運動從而使腫瘤細(xì)胞更易于發(fā)生浸潤。腫瘤組織的新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，血管基質(zhì)不完善，腫瘤細(xì)胞易發(fā)生滲漏，可直接穿透到血管內(nèi)進入血流并在遠(yuǎn)端形成轉(zhuǎn)移。研究還表明，新生血管的生長速度及其密集程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。VEGF在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，VEGF作為藥物作用的靶點抑制血管形成能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴散轉(zhuǎn)移。2004年，Genentech公司開發(fā)的VEGF單克隆抗體BevacizumaM商品名=Avastin)獲得了美國食品和藥物管理局的批準(zhǔn)上市用于一線治療晚期結(jié)直腸癌。Bevacizumab通過封閉VEGF阻止腫瘤細(xì)胞中新生血管的生成，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。除VEGF單抗之外，可溶性受體VEGFR的開發(fā)是針對VEGF進行靶向治療的另一途徑?？扇苄訴EGFR通過拮抗性結(jié)合VEGF或與膜結(jié)合型VEGFR結(jié)合形成異二聚體，抑制VEGF與膜結(jié)合型受體結(jié)合從而阻斷其下游的信號通路，產(chǎn)生抗腫瘤活性。VEGF還與其它疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，VEGF可作為其它疾病的診斷指標(biāo)和治療靶點。目前應(yīng)用VEGF抑制劑治療新生血管性眼病已受到越來越多的重視。2006年， Genentech公司開發(fā)的多克隆抗體片段Ranibizumab (商品名為Lucentis)，得到美國FDA 批準(zhǔn)應(yīng)用于眼科疾病的治療。Ranibizumab可與VEGF的所有異構(gòu)體結(jié)合并使其失活，從而抑制新生血管的形成。其它抑制VEGF的相關(guān)藥物如哌加他尼鈉(Pegaptanib sodium), VEGF-trap等也已獲得FDA審批或正在進入臨床試驗，用于眼科疾病的治療。除眼病外， VEGF還在高血壓病動脈粥樣硬化、糖尿病腎病等過程中發(fā)揮重要作用。VEGF相關(guān)蛋白產(chǎn)品和診斷試劑盒的開發(fā)有望為某些疾病提供早期診斷的依據(jù)和疾病靶向治療的基礎(chǔ)。VEGF自身作為藥物治療局部缺血性疾病前景廣闊。研究表明，用轉(zhuǎn)染的VEGF165 給藥治療缺血肢體，患處血管側(cè)枝數(shù)量明顯提高，且其數(shù)量與VEGF165劑量呈正相關(guān)；動物實驗結(jié)果證實VEGF165轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，損失部位內(nèi)皮再生加快、修復(fù)完整，血管舒張反應(yīng)恢復(fù)。1996年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)VEGF治療了 1例缺血性壞疽準(zhǔn)備截肢的患者。術(shù)后可見明顯的血管生成現(xiàn)象，形成了新生的血管側(cè)枝，有效地延緩了疾病的進程。另有報道用重組人 VEGF表達(dá)載體直接肌肉注射的方法治療難以治療性潰瘍患者能誘導(dǎo)側(cè)枝血管形成，部分患者潰瘍治愈或明顯改善。VEGF蛋白可用于手術(shù)及介入治療的替代方案。VEGF作為一種特異的多功能細(xì)胞因子，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，針對其展開的靶向研究及其相關(guān)藥物的開發(fā)對于相關(guān)疾病的診斷和治療有重要意義。開發(fā)與其配套的早期診斷試劑盒或?qū)ふ夷軌蚪档突蛞种破浔磉_(dá)和功能的藥物，將會為某些疾病的診斷和治療提供新的希望。重組VEGF蛋白的生產(chǎn)將為這些方面的研究提供更多的空間，在藥物研究及臨床檢驗中具有很大的市場潛力。2. Fc融合蛋白的表達(dá)免疫球蛋白IgG的Fc融合蛋白是指在基因水平將目的基因同IgG的Fc片段基因相連而表達(dá)的重組蛋白，同時具有目的蛋白及免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域，從而賦予了重組蛋白許多新的特性，拓展了蛋白在科研、制藥及臨床等方面的應(yīng)用。在重組蛋白表達(dá)的過程中，F(xiàn)c重組蛋白易于結(jié)合Protein A，從而簡化了蛋白的純化過程；Fc片段可以方便地進行流式、免疫組化和免疫共沉淀等方法檢測，可用于感興趣的基因研究；體外實驗中，F(xiàn)c融合蛋白可用于拮抗或激活細(xì)胞表面受體用來研究受體-配體反應(yīng)和信號通路；此外，F(xiàn)c重組蛋白還能應(yīng)用于噬菌體展示技術(shù)，如作為抗原制備人類全抗體庫。另外，F(xiàn)c片段還賦予了重組蛋白一些其它特性，增加了其在在制藥和臨床方面的應(yīng)用價值。融合蛋白中加入重鏈的恒定區(qū)，其半衰期明顯延長，延長了其在體內(nèi)的半衰期； Fc段能穿過胎盤、結(jié)合補體并介導(dǎo)補體依賴的細(xì)胞毒作用等；重組蛋白含有的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域使其形成二聚體或多聚體，增強了其抗原結(jié)合力。以上這些特點拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反應(yīng)的治療方面的臨床應(yīng)用前景。3.研究現(xiàn)狀目前國際上生產(chǎn)的VEGF165-FC重組蛋白基本都是采用大腸桿菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的，蛋白產(chǎn)物未經(jīng)糖基化或糖基化程度不高，活性和毒素含量難以滿足臨床診斷和治療的目的。用哺乳動物細(xì)胞生VEGF165-FC重組蛋白是生產(chǎn)科研和臨床用VEGF165的重要途徑，對于推動臨床診斷環(huán)節(jié)的新型生物技術(shù)發(fā)展和臨床藥物開發(fā)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的VEGF165-FC蛋白的方法。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)成本降低、簡化工藝流程、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的總體要求。本發(fā)明包括制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒和PEI、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和表達(dá)、蛋白純化及等四個步驟。用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑，其作為“質(zhì)子海綿”可以高效地結(jié)合雙鏈DNA，把其帶入目的細(xì)胞中，蛋白產(chǎn)物可在短暫的時間(一般可以表達(dá)一周的時間)內(nèi)獲得一過性表達(dá)從而獲得大量的蛋白。本發(fā)明所用的293T細(xì)胞是工業(yè)生產(chǎn)人臨床用蛋白最為常見的一種細(xì)胞。不僅表達(dá)水平高，蛋白翻譯后加工方式如糖基化等與體內(nèi)天然蛋白相似，而且無潛在的生物危害性，自身分泌的蛋白很少從而簡化了后續(xù)的純化過程，特別適于分泌型細(xì)胞因子或趨化因子等產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。而且這種細(xì)胞可以通過馴化在無血清培養(yǎng)基中生產(chǎn)，對于降低工業(yè)生產(chǎn)的成本是必需的。細(xì)胞密度能夠提高數(shù)十倍甚至數(shù)千倍，大大提高了蛋白產(chǎn)量。采用本方法，可以通過普通的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量高純度高生物活性的 VEGF165-FC蛋白。本項技術(shù)應(yīng)用于VEGF165_Fc蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，能夠明顯降低成本、簡化工藝流程，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。


圖1是SDS-PAGE鑒定Protein A親和層析柱純化后的VEGF165_Fc重組蛋白電泳結(jié)果圖(1.洗脫液E-I ;2.洗脫液E-2;3.洗脫液E-3 ；4.洗脫液E_4 ;5. Prestained Marker ；6.還原條件下的E-I ；7.還原條件下的E-2 ；8.還原條件下的E-3 ；9.還原條件下的 E-2)圖2是VEGF165-FC蛋白經(jīng)superdex 200純化柱純化的峰3是SDS-PAGE分析VEGF165_Fc經(jīng)superdex 200純化柱洗脫液蛋白電泳結(jié)果圖(非還原條件)圖4是SDS-PAGE鑒定經(jīng)superdex 200純化的VEGF165_Fc蛋白電泳結(jié)果圖，蛋白純度>95% (非還原條件下)
具體實施例方式1.轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的制備用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒(購自Qiagen公司)制備轉(zhuǎn)染所需連有 VEGF165-FC基因的表達(dá)質(zhì)粒pR-VEGF165-Fc。方法見說明書。用200 μ 1 TE緩沖液溶解質(zhì)粒，紫外分光光度計測其濃度。2.轉(zhuǎn)染用PEI的制備1)在500ml的燒杯中倒入450ml Milli-Q制備的超純水；2)天平稱量500mg線性PEI (購自Poly Science公司)，加入燒杯中，磁力攪拌器不斷攪動；3)逐滴加入預(yù)先配好的12M濃HCI使其pH < 2. 0 (大約需要800 μ 1)。攪動PEI 溶液約2-3小時；
4)加入預(yù)先配制的IOM NaOH溶液將pH調(diào)至7.0 (大約需要500 μ 1)。用Milli-Q 超純水將PEI溶液定容至500ml。5)0. 22-μ m濾膜過濾PEI溶液，分裝成Iml/管，-20°C保存。3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞1)轉(zhuǎn)染前1天(約24小時)，將293T細(xì)胞用無抗、含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，按照5 XlO5Ail鋪入150mm培養(yǎng)皿中，每瓶加入25mL，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將所需的Opti MEM培養(yǎng)基(或磷酸鹽緩沖液)預(yù)熱到25° _37°C。 冰上溶解連接VEGF165-FC基因的表達(dá)質(zhì)粒和PEI ；3)在 5ml 的 Ep 管中加入 2. 5ml Opti MEM/PBS,加入 43. 75 μ g 連有 VEGF165_Fc 基因的質(zhì)粒DNA(紫外分光光度計測其濃度后，加入洗脫緩沖液調(diào)整濃度至lug/ul)，在振蕩器上輕輕渦旋；4)加入262. 5 μ Llmg/ml的PEI，立即在振蕩器上振蕩3次，每次3秒鐘。室溫下將混合液孵育15分鐘；5)取出預(yù)先鋪入培養(yǎng)皿的細(xì)胞，將DNA/PEI混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶混勻；將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4.表達(dá)產(chǎn)物收集及純化1)轉(zhuǎn)染6小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿完全中培養(yǎng)基吸出，加入25ml無血清培養(yǎng)基 (serum free media, SFM)。同時加入4mM L-谷氨酰胺的和ImM的丙酮酸鈉后繼續(xù)培養(yǎng)；2)轉(zhuǎn)染后2天和4天分別換液并且加入新鮮的SFM及L-谷氨酰胺和ImM的丙酮酸鈉。收集細(xì)胞上清(注意不要把細(xì)胞去掉)，12，000rpm/min離心IOmin去死細(xì)胞和細(xì)胞碎片；3)將上清與等體積的結(jié)合/漂洗緩沖液(0. 15M NaCl, 20mM Na2HPO4, ρΗ8· 0)。與此同時，用超純水洗滌蛋白純化柱，再用Iml結(jié)合/漂洗緩沖液洗柱子；4)吸取Iml ProteinA的Resin加入純化柱，使其中的液體流盡；加入5mL結(jié)合/ 漂洗緩沖液平衡柱子，使其流速為lml/min ；5)將稀釋后的上清液上柱，調(diào)節(jié)流速為0. 5ml/min ；6) 20mL結(jié)合/漂洗緩沖液洗柱，調(diào)節(jié)流速為2ml/min ；7)最后用4X Iml 0. IM洗脫緩沖液(glycine，pH 2. 5)洗脫蛋白產(chǎn)物，用1. 5ml離心管收集液體，管中預(yù)先加入IlOul IM pH 8. 5的Tris-Cl調(diào)節(jié)pH值。紫外分光光度計及 SDS-PAGE測蛋白濃度及純度見附圖1。5.凝膠過濾層析進一步純化目的蛋白將洗脫的蛋白產(chǎn)物混合后濃縮至約0. 5ml，過superdex 20010/300純化柱進一步純化。上柱前先用 S200gel filtration column buffer (50mM Tris pH8. 0, IOOmM NaCl)平衡柱子，上樣后用相同的緩沖液淋洗蛋白，組分收集器收集洗脫液0. 5ml/管。 superdex 200純化峰圖見附圖2及SDS-PAGE分析純化柱洗脫液蛋白電泳結(jié)果圖見附圖3， 經(jīng)superdex 200進一步純化，SDS-PAGE驗證獲得的是高純度的蛋白見附圖4，蛋白純度> 95%。
權(quán)利要求
1.一種用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性V165-FC的蛋白的方法，其特征在于該方法通過如下步驟用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的V165-FC蛋白制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒和PEI、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和表達(dá)、蛋白純化及等四個步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的V165-FC蛋白， 特征在于所述的V165-FC是通過能穩(wěn)定生產(chǎn)的哺乳動物細(xì)胞中制備純化的。
3.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的V165-FC蛋白， 特征在于所述的V165-FC的表達(dá)為分泌性的可溶性蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的V165-FC蛋白， 特征在于所述的V165-FC作為生物制劑應(yīng)用于研究和臨床診斷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將人重組人血管內(nèi)皮生長因子165與人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合基因(VEGF165-Fc)轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞以大規(guī)模生產(chǎn)其蛋白產(chǎn)物的技術(shù)。本發(fā)明旨在建立用哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的VEGF165-Fc蛋白的方法。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)成本降低、簡化工藝流程、提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的總體要求。采用本方法，可以通過普通的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)獲得大量高純度高生物活性的VEGF165-Fc蛋白。本項技術(shù)應(yīng)用于VEGF165-Fc蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，能夠明顯降低成本、簡化工藝流程，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號C07K19/00GK102344937SQ201110274359
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者盧守英, 周慧芳, 朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅, 江永海 申請人:江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司