專利名稱：一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種用于肝纖維化實(shí)驗(yàn)室檢測的試劑盒，特別涉及一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒。
背景技術(shù)：
目前，在肝纖維化的實(shí)驗(yàn)室診斷方面，多以檢測細(xì)胞外間質(zhì)(extracellulatrix,ECM)及其代謝產(chǎn)物作為輔助診斷指標(biāo)。目前，臨床較為常用的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有111型前膠原(Procollagen III, PC III )、IV型膠原(Collagen IV,CIV)、層粘蛋白(Laminin, LN)和透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid, HA)。但在臨床上，由于多種原因使得這些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目其診斷肝纖維化靈敏度與特異性均不夠理想。因此，對于肝纖維化的實(shí)驗(yàn)室診斷尋找新的指標(biāo)仍是臨床上亟待解決的問題。 肝纖維化的輔助診斷的另外一些重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，如細(xì)胞因子類項(xiàng)目可在大多數(shù)肝纖維化患者發(fā)生顯著變化，但是目前臨床實(shí)際應(yīng)用的并不普遍。所以，仍需探索在診斷肝纖維化方面特異性好、靈敏度高且操作方便的方法。發(fā)明內(nèi)容為了探索現(xiàn)有技術(shù)存在的診斷肝纖維化的特異性不好、靈敏度不高的缺點(diǎn)，本實(shí)用新型公開了一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，具有較好的特異性和靈敏度，操作簡便。本實(shí)用新型的技術(shù)方案為一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)分隔為試劑區(qū)和設(shè)備區(qū)，在試劑區(qū)設(shè)有9個(gè)試劑儲液單元，分別為CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元、1:100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液單元、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液單元、生物素化抗體稀釋液儲液單元、酶結(jié)合物稀釋液儲液單元、濃縮洗滌液儲液單元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設(shè)備區(qū)設(shè)有封口膜、若干包被板條和一個(gè)包被板條支架。所述的包被板條活動設(shè)于包被板條支架上。所述的包被板條為矩形板,板上設(shè)有12個(gè)盛液孔。所述的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元的容積為O. 5ml、所述的1:100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元的容積為150 μ I、所述的1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液單元的容積為150 μ I、所述的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的生物素化抗體稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的酶結(jié)合物稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的濃縮洗滌液儲液單元的容積為20ml、所述的TMB顯色劑儲液單元的容積為12ml、所述的終止劑儲液單元的容積為12ml。有益效果I.應(yīng)用CTGF診斷肝纖維化患者的靈敏度可以達(dá)到65. 5%，特異度達(dá)到91. 1%0CTGF為診斷肝纖維化較為敏感的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。操作簡便。
圖I為本實(shí)用新型試劑盒打開狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)示意圖。其中I為試劑區(qū)，2為設(shè)備區(qū)。
具體實(shí)施方式
檢測原理CTGF是ー種具有多種生理功能的細(xì)胞因子，作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的下游作用因子，它主要由成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，反過來又介導(dǎo)TGF-β對間質(zhì)細(xì)胞的作用，可促進(jìn)細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成、分泌膠原成份等。通過免疫組化和原位雜交等方法已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)肝纖維化時(shí)CTGF水平明顯增高，并可分泌進(jìn)入外周血中，血清中的
CTGF主要來自于肝臟。當(dāng)患者為肝纖維化患者時(shí)，患者的CTGF會出現(xiàn)大幅的升高。本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人結(jié)締組織生長因子(CTGF)水平。首先用純化的CTGF單體包被微孔板，制成固相抗體；向包被單抗的微孔中加入血清，血清中CTGF與單抗結(jié)合后，再與生物素標(biāo)記的CTGF單體結(jié)合，形成抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后，再加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物，最后形成抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體-鏈霉親和素標(biāo)記HRP的結(jié)合物。經(jīng)過再次徹底洗滌后，カロTMB底物，TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的CTGF呈正比。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(Α值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CTGF濃度。一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)分隔為試劑區(qū)和設(shè)備區(qū)，在試劑區(qū)設(shè)有9個(gè)試劑儲液單元，分別為CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元、I 100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液単元、生物素化抗體稀釋液儲液単元、酶結(jié)合物稀釋液儲液単元、濃縮洗滌液儲液単元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設(shè)備區(qū)設(shè)有封ロ膜、若干包被板條和ー個(gè)包被板條支架。所述的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元的容積為O. 5ml、所述的1:100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元的容積為150μ I、所述的1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元的容積為150 μ I、所述的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液単元的容積為16ml、所述的生物素化抗體稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的酶結(jié)合物稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的濃縮洗滌液儲液單元的容積為20ml、所述的TMB顯色劑儲液單元的容積為12ml、所述的終止劑儲液單元的容積為12ml。所述的包被板條活動設(shè)于包被板條支架上。所述的包被板條為矩形板，板上設(shè)有12個(gè)盛液孔。所述的包被板條一般每盒配置8條。包被板條和包被板條支架均為PP或是PE制成，包被板條支架的形狀與包被板條的形狀相適應(yīng)。試劑盒中的各個(gè)試劑儲液單元可以內(nèi)設(shè)具有不同顔色瓶蓋的試劑瓶，以示區(qū)分。具體使用方法為將標(biāo)本或是CTGF標(biāo)準(zhǔn)品以標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液稀釋到合適濃度，洗滌液以濃縮洗滌液按要求配制，I 100生物素標(biāo)記的CTGF單抗以生物素化抗體稀釋液稀釋到合適濃度，I 100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶以酶結(jié)合物稀釋液稀釋到合適濃度得到酶結(jié)合物工作液。從試劑盒中取出包被板條，將稀釋好的標(biāo)本或是CTGF標(biāo)準(zhǔn)品按50 μ I/孔加入到相應(yīng)的包被板孔中，空白孔除外。用封ロ膜封孔，37°C 60min后用洗滌液洗滌包被板條4次。再加入稀釋好的生物素化抗體100 μ I/孔。用封ロ膜封孔，37°C 30min后用洗滌液洗滌包被板條4次。加入酶結(jié)合物工作液ΙΟΟμ I/孔，用封口膜封孔，37°C 30min后用洗滌液洗滌包被板條4次。然后各孔加100 μ I的TMB顯色劑，37°C避光15min。每孔再加終止液50 μ 1，充分混合后以空白調(diào)零，在450nm波長處測量吸光度(A)值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)A值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的A值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品CTGF的實(shí)際濃度。采用本實(shí)用新型所述的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下I.檢測線性范圍0 64 ug/L范圍內(nèi)CTGF和A值呈良好的線性關(guān)系(R2=O. 995，P<Q. 001)。2.檢測靈敏度與精密度檢測靈敏度O. 2 ug/L ;高、低2 份不同CTGF標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)CV分別為4. 5%、9. 8%，批間CV分別為10. 1%、12. 8%，符合ELISA試驗(yàn)批內(nèi)、批間CV分別不超過10%和15%要求。3.回收實(shí)驗(yàn)低值、中值和高值的回收率分別為為98. 2%、101. 9%和103. 8%，均在95% 105%范圍內(nèi)。4.特異性試驗(yàn)結(jié)果按優(yōu)化的 ELISA 條件，取 10 ug/L LPDGF_BB、EGF、IGF_I、FGF以及10名健康人混合血清作為被檢標(biāo)本，所有孔的A45tl值與標(biāo)準(zhǔn)曲線上空白孔A值相近，與加入10 ug/L CTGF標(biāo)準(zhǔn)品孔的A450值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義U= 11. 321，P=O. 000)，表明未發(fā)生交叉反應(yīng)，該方法有較強(qiáng)的特異性。5.血清CTGF與4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性分析264例慢性肝病(CHB)血清CTGF和4項(xiàng)肝纖維化指標(biāo)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CTGF與HA、PCIII、CIV、LN均呈正相關(guān)(r值分別為O. 367,0. 424,0. 528和O. 434，產(chǎn)均〈O. 05)。CHB患者血清CTGF含量與其肝纖維化分期顯著相關(guān)(rM). 689，/X0. 001)。6. CTGF臨床應(yīng)用肝纖維化診斷效率分析將CTGF與HA、PCIII、LN和CIV實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過受試工作曲線(ROC)分析，結(jié)果經(jīng)ROC曲線分析比較，264例CHB患者CTGF及4項(xiàng)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的診斷性能顯示，CTGF區(qū)分輕度肝纖維化(S0 SI)和明顯肝纖維化組(S2 S4)的曲線下面積(AUC)為 0.841 (95% Cl O. 762 O. 920)，高于 HA 的 O. 797(95% Cl 0. 703 O. 891)，PCIII 的 O. 777 (95% Cl 0. 680 O. 873)，LN 的 O. 767 (95%Cl :0· 670 O. 863 )和 CIV 的 O. 744 (95 % Cl 0. 643- 0.845)。用 ROC 曲線分析比較CTCF, HA、PC III、C IV及LN在診斷最佳臨界值時(shí)的敏感度、特異度、預(yù)測值(陽性和陰性)和約登指數(shù)。當(dāng)CTGF在臨界值為10. 3 ug/L時(shí)，敏感度為70. 5%，其特異度(82. 4%)、陽性預(yù)測值(79. 8%)和約登指數(shù)(O. 53)在5項(xiàng)指標(biāo)中最高，且預(yù)測明顯纖維化的ROC曲線下面積最大。
權(quán)利要求1.一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)分隔為試劑區(qū)和設(shè)備區(qū)，在試劑區(qū)設(shè)有9個(gè)試劑儲液單元，分別為CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元、I 100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液単元、生物素化抗體稀釋液儲液単元、酶結(jié)合物稀釋液儲液單元、濃縮洗滌液儲液単元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設(shè)備區(qū)設(shè)有封ロ膜、若干包被板條和ー個(gè)包被板條支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述的包被板條活動設(shè)于包被板條支架上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述的包被板條為矩形板，板上設(shè)有12個(gè)盛液孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，其特征在于，所述的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元的容積為O. 5ml、所述的1:100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元的容積為150 μ I、所述的1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液単元的容積為150 μ I、所述的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的生物素化抗體稀釋液儲液單元的容積為16ml、所述的酶結(jié)合物稀釋液儲液単元的容積為16ml、所述的濃縮洗滌液儲液單元的容積為20ml、所述的TMB顯色劑儲液單元的容積為12ml、所述的終止劑儲液単元的容積為 12ml。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測血清結(jié)締組織生長因子用試劑盒，所述試劑盒由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)分隔為試劑區(qū)和設(shè)備區(qū)，在試劑區(qū)設(shè)有9個(gè)試劑儲液單元，分別為CTGF標(biāo)準(zhǔn)品儲液單元、1:100生物素標(biāo)記的CTGF抗體儲液單元、1:100鏈霉親和素-辣根過氧化物酶儲液單元、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本用稀釋液儲液單元、生物素化抗體稀釋液儲液單元、酶結(jié)合物稀釋液儲液單元、濃縮洗滌液儲液單元、TMB顯色劑儲液單元、終止劑儲液單元，在設(shè)備區(qū)設(shè)有封口膜、若干包被板條和一個(gè)包被板條支架。具有操作簡便，靈敏度高，特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/68GK202661471SQ20122034521
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者王念躍 申請人:南京市第二醫(yī)院