高效分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種高效分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類(lèi)多能干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有以下特點(diǎn)；I造血支持作用。作為造血微環(huán)境主要細(xì)胞成分一基質(zhì)細(xì)胞系的干/祖細(xì)胞，13(；與造血干細(xì)胞共同移植可促進(jìn)造血干祖細(xì)胞的植入。2免疫調(diào)控。MSCs不表達(dá)⑶80，⑶86，HLA-DR等協(xié)同剌激分子，體外可抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)于預(yù)防和治療異基因造血細(xì)胞移植后引起的移植物抗宿主病，治療自身免疫系統(tǒng)疾病有重要意義。3基因治療。由于]\^(；體外擴(kuò)增、增殖能力強(qiáng)，可以作為基因操作的干細(xì)胞平臺(tái)，加之MSC具有對(duì)腫瘤的靶向性，在腫瘤的基因治療中有著十分誘人的前景。4多向分化潛能。在體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌臟、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于組織工程。
[0003]臍帶是連接胎兒與胎盤(pán)問(wèn)的索狀結(jié)構(gòu)，外被羊膜包圍，內(nèi)含茹液性的結(jié)締組織，該結(jié)締組織內(nèi)有臍動(dòng)脈和臍靜脈。血管周?chē)蝗榈鞍讟咏M織所包裹，后者被稱(chēng)為華通氏膠(Wharton S jelly)，它富含透明質(zhì)酸，形成了成纖維細(xì)胞周?chē)乃z結(jié)構(gòu)。目前己有眾多研宄組從臍帶中分離出能形成成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)的細(xì)胞，這些細(xì)胞符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(The Internat1nal Society for Cellular Therapy，ISCT)制定的最低標(biāo)準(zhǔn)【Cytotherapy (2006) Vol.8, N0.4,315-317】;(I)貼壁(塑料材質(zhì)培養(yǎng)器皿)生長(zhǎng)能力；(2)細(xì)胞表型:應(yīng)該表達(dá)的一類(lèi)表型CD73、CD90和⑶105必須陽(yáng)性，陽(yáng)性率不低于95%;同時(shí)為了確保MSC中沒(méi)有混雜原代分離培養(yǎng)物中存在的一些細(xì)胞，選取一組己去口的MSC不表達(dá)的表型做為輔助的排查標(biāo)準(zhǔn)，⑶34 (造血祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記)、⑶45 (白細(xì)胞標(biāo)記)、⑶14/⑶Ilb (單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞標(biāo)記)、⑶79 α /⑶19 (B細(xì)胞標(biāo)記)和HLA-DR陰性，陽(yáng)性率不高于2% ; (3)多向分化潛能，包括向骨、軟骨、脂肪分化的能力。
[0004]目前的研宄結(jié)果顯示，臍帶組織中的問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞主要分布在:①臍帶血管周?chē)瑥娜四殠а軆?nèi)皮和內(nèi)皮下分離出形態(tài)學(xué)和免疫表型類(lèi)似于BM-MSC的細(xì)胞，并表現(xiàn)出多向分化潛能；②華通氏膠(Wharton’ s Jelly)，在華通氏膠中發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞，具有較高的分化潛能，可向多個(gè)方向進(jìn)行分化。這兩種細(xì)胞均為間充質(zhì)干細(xì)胞，同樣具有多向分化能力，同樣具有免疫調(diào)節(jié)潔性。
[0005]目前，己經(jīng)有多個(gè)單位申請(qǐng)了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離的專(zhuān)利，這些專(zhuān)利從臍帶中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法多為用膠原酶或混合酶消化而獲得或者是組織塊貼壁法。這些方法的一個(gè)共同特點(diǎn)是需要將臍帶組織通過(guò)機(jī)械力破碎。由于產(chǎn)婦大部分生產(chǎn)方式為順產(chǎn)，在生產(chǎn)過(guò)程中，尤其是順產(chǎn)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致臍帶外表攜帶細(xì)菌等微生物。雖然在分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)程前會(huì)對(duì)臍帶進(jìn)行清洗，但這并不能完全去除臍帶表面攜帶的細(xì)菌等微生物，在機(jī)械力破碎臍帶的過(guò)程會(huì)導(dǎo)致分離的細(xì)胞被污染。目前，國(guó)內(nèi)外己經(jīng)建立了多個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)，對(duì)每個(gè)保存臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的儲(chǔ)戶(hù)來(lái)說(shuō)，干細(xì)胞資源是獨(dú)一無(wú)二的，細(xì)胞污染是很難被接受的，所以開(kāi)發(fā)新的工藝迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是:提供一種高效分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，它對(duì)細(xì)胞損傷小，能更快的得到完全來(lái)自母體的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:高效分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
1)華通氏膠的分離:將采集瓶中采集液倒出，僅保留臍帶在采集瓶中；加入質(zhì)量百分比為75%的酒精將臍帶完全浸沒(méi)，并浸泡2分鐘；再將臍帶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用生理鹽水清洗2次，直至臍帶表面不含血跡；將清洗過(guò)的臍帶兩端去除，并去除動(dòng)脈血管、靜脈血管和羊膜，分離出華通氏膠，放入培養(yǎng)皿中用生理鹽水清洗；清洗完成后將華通氏膠剪成1-4_3的小塊，并轉(zhuǎn)移至50ml離心管中；
2)將剪碎的華通氏膠接種到2個(gè)T-75培養(yǎng)瓶中，每瓶不少于1.0g，再向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入9ml完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶水平放入37°C，體積百分比為5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3)換液??每5天換液一次，直至達(dá)到60- 70%的融合率；然后將培養(yǎng)基分別倒入50ml離心管中，并標(biāo)記，在2000rpm下離心5分鐘，去除上清；向每個(gè)離心管中加入9ml新鮮的完全培養(yǎng)基，并充分混合均勻；將培養(yǎng)基從50ml離心管中轉(zhuǎn)移到原來(lái)的培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記換液日期；將培養(yǎng)瓶水平放入37°C，體積百分比為5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每4-5天在顯微鏡下觀(guān)察生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%-70%融合時(shí)進(jìn)行收集；
4)傳代:將用過(guò)的培養(yǎng)基收集到50ml離心管中，在2000rpm下離心5分鐘；再用10-20ml的生理鹽水清洗T-75培養(yǎng)瓶I次；向清洗后的每個(gè)T-75培養(yǎng)瓶中加入3ml預(yù)熱到室溫的質(zhì)量百分比為0.125%的胰酶；在顯微鏡下觀(guān)察，直至有80%的細(xì)胞變圓脫落漂浮，即用靜置后的培養(yǎng)基上清終止消化，消化過(guò)程在室溫條件下2分鐘；將離心管中剩余組織塊倒入I個(gè)新的T-75培養(yǎng)瓶中，加入8ml完全培養(yǎng)基作為備份；用10-20 ml的生理鹽水清洗一遍T(mén)-75培養(yǎng)瓶，洗液也倒入50ml離心管中；用細(xì)胞濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液去除細(xì)胞組織塊；將過(guò)濾好的細(xì)胞懸液收集到一個(gè)新的50ml離心管中；取0.5ml過(guò)濾后的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，測(cè)活力；根據(jù)計(jì)數(shù)和活力結(jié)果，按照8 X 1Vcm2-1 X 1Vcm2的接種密度選擇T-175培養(yǎng)瓶或T-75培養(yǎng)瓶；將需要的細(xì)胞離心300gl0分鐘，去除上清；在離心管中加入5ml的完全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，再加入20ml完全培養(yǎng)基充分混勻；將細(xì)胞懸液接種細(xì)胞到I個(gè)T-175培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶水平放入37°C，體積百分比為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天在顯微鏡下觀(guān)察生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合時(shí)進(jìn)行收集；
5)收集:將用過(guò)的培養(yǎng)基收集到50ml離心管中，將收集培養(yǎng)基300g離心5分鐘；用20ml的生理鹽水清洗T-175培養(yǎng)瓶I次，并向每瓶加入6ml預(yù)熱過(guò)的質(zhì)量百分比為0.125%的胰酶，在顯微鏡下觀(guān)察，直至有80%的細(xì)胞變圓脫落漂浮，即用離心后的培養(yǎng)基上清終止消化，消化過(guò)程室溫條件下2分鐘；將終止的細(xì)胞懸液收集到一個(gè)50ml離心管中；用20 ml的生理鹽水清洗一遍T(mén)-175培養(yǎng)瓶，洗液也倒入50ml離心管中，并將洗液300g離心10分鐘；
6)凍存:用5ml完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞團(tuán)塊，再加入20ml培養(yǎng)基混合均勻；從細(xì)胞懸液中取1-2滴進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測(cè)定，活力需達(dá)到85%以上，細(xì)胞數(shù)達(dá)到8x10s以上，取流式，流式檢測(cè)細(xì)胞數(shù)需達(dá)到2xl06;將300g細(xì)胞懸液離心5min ;在收集到的細(xì)胞團(tuán)中加入2ml完全培養(yǎng)基、并打散，再加入2ml 4°C預(yù)冷30分鐘的含質(zhì)量百分比20%的DMSO的凍存液，并混合均勻；將41111細(xì)胞懸液加入到3個(gè)凍存管中，每管1.3ml，每管的細(xì)胞數(shù)為2xl06;最后利用程序降溫盒或程控降溫儀凍存細(xì)胞。
[0008]由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明直接從臍帶內(nèi)分離華通氏膠，避免了雜細(xì)胞的污染，無(wú)需多次傳代，保證了細(xì)胞的純度和活力；能有效的減少臍帶分離過(guò)程的污染，且能降低分離的成本。在分離過(guò)程中不需要機(jī)械破碎臍帶，減少機(jī)械剪切力對(duì)細(xì)胞的損害，獲得的細(xì)胞活率更高；由于在分離過(guò)程中未采用異種消化酶和異種血清，所以所得到的細(xì)胞不含異種蛋白，也更安全，可以滿(mǎn)足臨床使用的需要，也為建立臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)提供了技術(shù)保障；采用組織塊法的方法，更加方便和快捷，對(duì)細(xì)胞損傷小，能最大可能的保護(hù)問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞，不受損傷，使其具有更高活率。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，成本低廉，使用效果好。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞快速增殖圖片；
圖2為本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明的實(shí)施例:高效分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
1)華通氏膠的分離:將采集瓶中采集液倒出，僅保留臍帶在采集瓶中；加入質(zhì)量百分比為75%的酒精將臍帶完全浸沒(méi)，并浸泡2分鐘；再將臍帶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用生理鹽水清洗2次，直至臍帶表面不含血跡；將清洗過(guò)的臍帶兩端去除，并去除