一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α -苯丙酮酸效率提高的重組菌，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] α -苯丙酮酸（PPA)有很多應(yīng)用，可用來合成抗腫瘤藥物的雜環(huán)化合物，可作為抗 氧化劑及促進(jìn)傷口愈合。是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性藥物中間體。 PPA還可用于制備苯乳酸，苯乳酸可作為抗菌物質(zhì)。目前PPA生產(chǎn)主要是化學(xué)合成法，主要 包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙內(nèi)酰脲與苯甲醛合成法和海因法。這些方法均需經(jīng)過多 步反應(yīng)，對反應(yīng)條件有較高要求，例如高壓、高溫等，產(chǎn)品得率低，對后期分離純化加大了難 度，易產(chǎn)生有毒有害產(chǎn)物。酶和全細(xì)胞生物催化劑越來越多的用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0003] L-氨基酸脫氨酶（EC1. 4. 3. 2)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應(yīng)α -酮酸和 氨，多為黃素蛋白，二聚體結(jié)構(gòu)。L-氨基酸脫氨酶主要存在于蛇毒和昆蟲毒素中，在細(xì)菌、 真菌、藻類中也存在。Proteus mirabilis KCTC2566有兩種L-氨基酸脫氨酶，一種具有廣 泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對L-苯丙氨酸具有較高催化活 性；另一種具有底物限制性，只對堿性氨基酸具有催化活性，尤其是L-組氨酸。大部分細(xì)菌 L-氨基酸脫氨酶是胞外分泌型，但是P. mirabilis中兩種L-氨基酸脫氨酶都是膜蛋白。
[0004] 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化相比分離酶具有如下優(yōu)勢：易制備，成本低；更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫 度、PH等因素影響，使用方便；無污染，副產(chǎn)物少。有望實現(xiàn)低能耗、高效率、高純度、無污染 的工業(yè)化PPA生產(chǎn)。之前的研宄中我們已經(jīng)成功構(gòu)建了大腸桿菌全細(xì)胞催化劑，表達(dá)來源 于P. mirabilis KCTC2566的脫氨酶基因，PPA的產(chǎn)量為3. 3g/L。本發(fā)明旨在進(jìn)一步提高 PPA產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α -苯丙酮酸效率提高的重組菌， 解除了菌株本身對PPA的降解，從而提高胞外轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸的效率。
[0006] 所述重組菌是將重組表達(dá)了 L-氨基酸脫氨酶基因的大腸桿菌的aspC(編碼天 冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，GeneID 8182318)、tyrB(編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，GeneID 8179723)和 ilvE (編碼異亮氨酸轉(zhuǎn)氨酶，GeneID 8182196)基因敲除，從而阻斷胞內(nèi)PPA的分解途徑。
[0007] 所述重組表達(dá)了 L-氨基酸脫氨酶基因的大腸桿菌的構(gòu)建方法參見發(fā)明名稱為 "一種全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α -苯丙酮酸的方法"，申請?zhí)枮?01310392427. 6的專利申請。
[0008] 所述aspC、tyrB和ilvE基因敲除方法：PCR擴(kuò)增aspC、tyrB和ilvE基因上下游 約1000 bp及抗性標(biāo)記片段約lOOObp，通過融合PCR制備打靶片段。將打靶片段轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選發(fā)生同源重組的菌株，再用溫敏型質(zhì)粒消去抗性。
[0009] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α -苯丙酮酸的方法，將L-苯 丙氨酸 4-6g/L、全細(xì)胞催化劑 L2-L5g/L，在 20mM Tris-HCKpH 8.0)中，于 36-37°C、 200-220rpm 轉(zhuǎn)化 6-10h。
[0010] 所述全細(xì)胞催化劑的獲得，是將含有L-氨基酸脫氨酶突變體的重組大腸桿菌 按1-2 %接種量到I. 8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和溫度分別為400rpm、l. Ovvm和 28°C，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0.6-0. 8,加入0.4mM IPTG誘導(dǎo)L-氨基酸脫氨酶表達(dá)。誘導(dǎo)5h后， 8, OOOrpm低溫離心10_15min，收集菌體，用20mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液洗兩遍菌體即 得。
[0011] 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷 卻到 60-80 °C，再加 IOOmL 滅菌的 17mmol/L KH2PO4和 72mmol/L K2HPO4的溶液（2. 31g 的 KH2POjP 12. 54g的K 2冊04溶于水中，終體積為100mL，高壓滅菌）。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為：L-苯丙氨酸4-5g/L，全細(xì)胞催 化劑 I. 2-1. 5g/L，反應(yīng)在 20mM Tris-HCl (pH 8. 0)中進(jìn)行，37°C，200rpm 轉(zhuǎn)化 6-10h。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明成功實現(xiàn)了大腸桿菌內(nèi)aspC、tyrB和ilvE基因的敲 除，從而阻斷了細(xì)胞對產(chǎn)物的降解，進(jìn)一步提高了胞外轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸的產(chǎn)量，PPA的產(chǎn) 量可達(dá)3. 9g/L。此全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了化學(xué)法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污 染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率低的問題，實現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn) PPA，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0014] 材料與方法
[0015] 種子培養(yǎng)基：蛋白胨lg，酵母粉〇· 5g，NaCl lg，自來水定容至100mL。
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷 卻到 60°C，再加 IOOmL 滅菌的 17mmol/L KH2PO4和 72mmol/LK2HP04的溶液。
[0017] PPA含量測定：將轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行離心，棄上清，離心向細(xì)胞中加入IOOyL L-苯丙 氨酸（IOOmM)，30min后，離心，取上清100 yL，加入3mL三氯化鐵，分光光度計測定640nm的 吸光度。
[0018] 表1PCR所用引物
[0019]
【主權(quán)項】
1. 一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)a -苯丙酮酸效率提高的重組菌，其特征在于，是將重組表達(dá)了 L-氨 基酸脫氨酶基因的大腸桿菌的編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因aspC、編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶 的基因tyrB和編碼異亮氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因ilvE進(jìn)行敲除，解除了菌株本身對PPA的降解。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，所示aspC的序列如GeneID 8182318所 示，tyrB的序列如GeneID 8179723所示，ilvE的序列如GeneID 8182196所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組表達(dá)了 L-氨基酸脫氨酶基因 的大腸桿菌的構(gòu)建方法參見發(fā)明名稱為一種全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)a-苯丙酮酸的方法，申 請?zhí)枮?01310392427. 6的專利申請。
4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述重組菌的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增aspC、tyrB和 ilvE基因上、下游各約1000 bp的核苷酸及抗性標(biāo)記片段，通過融合PCR制備打靶片段，將打 靶片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選發(fā)生同源重組的菌株，再消去抗性。
5. -種應(yīng)用1-3任一所述重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)a -苯丙酮酸的方法，其特征在于， 將1^-苯丙氨酸4-68/1、全細(xì)胞催化劑1.2-1.58/1，在？118.0的2〇11111^8-11(：1中，于 36-37 °C、200-220rpm 轉(zhuǎn)化 6-10h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述全細(xì)胞催化劑的獲得，是將重組大腸 桿菌按1-2 %接種量到I. 8L發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和溫度分別為400rpm、l. Ovvm 和28°C，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 6-0. 8,加入0. 4mM IPTG誘導(dǎo)L-氨基酸脫氨酶表達(dá)，誘導(dǎo)5h后， 8, OOOrpm低溫離心10_15min，收集菌體，用20mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液洗兩遍菌體即 得。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨12g，酵母提取物 24g，甘油4mL，各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60_80°C，再加IOOmL滅菌的17mmol/LKH 2P04 和 72mmol/L K2HPO4的溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為：L-苯丙氨酸4-5g/ L，全細(xì)胞催化劑I. 2-1. 5g/L，反應(yīng)在pH 8. 0的20mM Tris-HCl中進(jìn)行，37°C，200rpm轉(zhuǎn)化 6-10h〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明成功實現(xiàn)了大腸桿菌內(nèi)aspC、tyrB和ilvE基因的敲除，從而阻斷了細(xì)胞對產(chǎn)物PPA的降解，進(jìn)一步提高了胞外轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸的產(chǎn)量，PPA的產(chǎn)量可達(dá)3.9g/L。此全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了化學(xué)法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率低的問題，實現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)PPA，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1-21, C12R1-19, C12P7-40, C12N15-87
【公開號】CN104862264
【申請?zhí)枴緾N201510297149
【發(fā)明人】陳堅, 劉龍, 李江華, 堵國成, 侯穎, 顧漢章, 徐堃
【申請人】江南大學(xué), 江蘇漢光生物工程有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月2日