一種無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于干細胞技術領域，涉及一種無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術】
[0002]人臍帶間充質干細胞源自臍帶華爾氏通膠，是具有明顯可塑性和多向分化潛能的一種成體干細胞，在不同生長因子的調節(jié)下，可分化成來源于3個胚層的不同組織細胞類型，如脂肪細胞、成骨細胞、肝樣細胞、心肌樣細胞、神經(jīng)膠質細胞、神經(jīng)元細胞和胰島樣細胞等。除此，人臍帶間充質干細胞不表達主要組織相容性II類抗原，微量表達主要組織相容性I類抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫調節(jié)功效，移植后的人臍帶間充質干細胞分泌的營養(yǎng)因子，具有促血管生成、促細胞生長、抗炎癥和抗纖維化等作用。
[0003]傳統(tǒng)的含動物血清的干細胞培養(yǎng)基給干細胞的生產(chǎn)與科研帶來多種不利因素。血清能為干細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其它營養(yǎng)物質，但其存在諸多缺點:批間差異較大，來源不穩(wěn)定，需要大量驗證工作，價格昂貴，使用不方便，成分不明確，有抑制細胞生長的成分，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無血清培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基的基礎上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿足干細胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因此，發(fā)展無血清培養(yǎng)基是干細胞走向臨床應用的重要條件。
[0004]目前已有一些市售間充質干細胞無血清培養(yǎng)基，比如LifeTechnology的間充質干細胞無血清培養(yǎng)基StemP1 SFM。但是，現(xiàn)有市售無血清培養(yǎng)基存在細胞貼壁差、操作不便等缺陷。比如Gibco無血清培養(yǎng)基、Stem CELL無血清培養(yǎng)基的應用需要進行培養(yǎng)瓶包被。此外，這些培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞增殖速率不夠理想。
[0005]中國專利CN 102433302公開了一種無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以DMEM/F12為基礎培養(yǎng)基，但該發(fā)明培養(yǎng)基僅有一種貼壁因子，細胞貼壁性能不夠理想。中國專利申請CN104164404公開了一種人臍帶間質干細胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以a_MEM為基礎培養(yǎng)基，添加的細胞因子及其他組分多達29種，組分非常復雜。
[0006]因此，現(xiàn)有技術存在細胞貼壁性差，組分過于復雜，細胞增殖速率不夠理想等問題。

【發(fā)明內容】

[0007]為解決現(xiàn)有技術中存在的細胞貼壁性差，組分過于復雜，細胞增殖速率不夠理想等問題，發(fā)明人通過大量試驗篩選，得到一種新的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基無需進行培養(yǎng)瓶包被，操作簡便，細胞貼壁性和形態(tài)良好，細胞增殖速率高。
[0008]本發(fā)明的目的將通過下面的詳細描述來進一步體現(xiàn)和說明。
[0009]本發(fā)明提供一種無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~5mg/mL、重組轉鐵蛋白1~5 μ g/mL、維生素C5?50 μ g/mL、人血清白蛋白0.5?5mg/mL、成纖維細胞生長因子5?50ng/mL、血小板衍生生長因子5?50ng/mL、表皮生長因子5?50ng/mL、胰島素樣生長因子5?50ng/mL、轉化生長因子5?50ng/mL、纖維連接蛋白5?50ng/mL、胎球蛋白0.5?5mg/mL和β細胞素5?50 μ g /
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[0010]采用上述技術方案的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，無需添加動物血清，可以實現(xiàn)人臍帶間充質干細胞的快速增殖，維持良好的干細胞幼稚狀態(tài)，具有良好的細胞誘導分化潛能。
[0011]本發(fā)明提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基中，通過纖維連結蛋白(fibronectin)和胎球蛋白(Fetuin)的協(xié)同作用，大大增強了人臍帶間充質干細胞的貼壁性能；β細胞素(betacellulin)有助于維持人臍帶間充質干細胞的干細胞特性，并防止細胞老化。
[0012]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~2mg/mL、重組轉鐵蛋白1~4 μ g/mL、維生素C 5~30 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~2mg/mL、成纖維細胞生長因子5~20ng/mL、血小板衍生生長因子5~20ng/mL、表皮生長因子5~20ng/mL、胰島素樣生長因子5~20ng/mL、轉化生長因子5~20ng/mL、纖維連接蛋白5~20ng/mL、胎球蛋白0.5~3mg/mL和β細胞素5—20 μ g /mL。
[0013]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉鐵蛋白2.5yg/mL、維生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、成纖維細胞生長因子10ng/mL、血小板衍生生長因子10ng/mL、表皮生長因子10ng/mL、胰島素樣生長因子10ng/mL、轉化生長因子1ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL和β細胞素10 μ g /mL。
[0014]優(yōu)選地，所述成纖維細胞生長因子為堿性成纖維細胞生長因子，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1，所述轉化生長因子為轉化生長因子-β。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，還包括1%體積百分比的非必需氨基酸，例如購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司的非必須氨基酸，貨號ΝΕΑΑ-10201-100。
[0016]相應地，本發(fā)明還提供無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:向MDM基礎培養(yǎng)基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、成纖維細胞生長因子母液、血小板衍生生長因子母液、表皮生長因子母液、胰島素樣生長因子母液、轉化生長因子母液、纖維連接蛋白母液、胎球蛋白母液和β細胞素母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。
[0017]優(yōu)選地，所述成纖維細胞生長因子為堿性成纖維細胞生長因子，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1，所述轉化生長因子為轉化生長因子-β。
[0018]相應地，本發(fā)明還提供無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基在人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)中的用途。
[0019]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種新的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基和其他無血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人臍帶間充質干細胞能夠保持較好的干細胞幼稚形態(tài)，具有更好的細胞增殖速率、細胞干性和細胞誘導分化潛能。本發(fā)明提供的制備方法簡單，制得的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基用于人臍帶間充質干細胞的培養(yǎng)，表現(xiàn)出優(yōu)異的細胞性能。
【附圖說明】
[0020]圖1含不同濃度β細胞素的培養(yǎng)基對細胞增殖的影響。
[0021]圖2 Ρ5代人臍帶間充質干細胞在3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的形態(tài)。
[0022]圖3人臍帶間充質干細胞在3種培養(yǎng)基中的增殖曲線。
[0023]圖4 Ρ3代人臍帶間充質干細胞在3種培養(yǎng)基中的細胞克隆數(shù)量。
[0024]圖5培養(yǎng)基I培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞的表面抗原表達水平。
[0025]圖6培養(yǎng)基2培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞的表面抗原表達水平。
[0026]圖7培養(yǎng)基3培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞的表面抗原表達水平。
[0027]圖8 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞的成脂誘導分化染色結果圖。
[0028]圖9 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成脂誘導分化相關基因FABP4的表達結果圖。
[0029]圖10 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞的成骨誘導分化染色結果圖。
[0030]圖11 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的Ρ5代人臍帶間充質干細胞在誘導培養(yǎng)基中的成骨誘導分化相關基因OPN的表達結果圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0032]本發(fā)明中的各組分均為常規(guī)市售產(chǎn)品，例如β細胞素購自Sigma，貨號Β3670。本發(fā)明中，培養(yǎng)基1:本發(fā)明實施例二提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)基2:Life Tecnology公司的的StemPro MSC SFM無血清培養(yǎng)基，貨號A10332-01 ;培養(yǎng)基3:1MDM基礎培養(yǎng)基+10%體積百分比的FBS。
[0033]實施例一含不同濃度β細胞素的培養(yǎng)基對細胞增殖的影響
發(fā)明人進行大量試驗篩選得到本發(fā)明提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基配方，并進一步對β細胞素的濃度影響進行了考察。將Pl代HUMSC以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，分別用含不同濃度β細胞素的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基(與培養(yǎng)基I相比，區(qū)別僅在于β細胞素的濃度不同)培養(yǎng)，每3天將細胞用0.25%胰酶消化，收集細胞并計算數(shù)量，并以5000個/cm2的密度再次接種培養(yǎng)，直至P5代，根據(jù)每個代次的細胞收獲數(shù)量，繪制細胞增殖曲線，結果如圖1所示。
[0034]從圖1可知，β細胞素的濃度為10ng/mL時，細胞增殖速率最高，濃度為5ng/mL和20ng/mL時也具有較高的細胞增殖速率，但濃度達到30ng/mL時，不僅未提高細胞增殖速率，反而降低了細胞增殖速率。因此，β細胞素的濃度對本發(fā)明提供的無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基具有至關重要的影響。
[0035]實施例二無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基
無血清的人臍帶間充質干細胞培養(yǎng)基，包括MDM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉鐵蛋白2.5 μ g/mL、維生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白 lmg/mL、bFGF 10ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β1ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL和β細胞素10 μ g /mL。
[0036]制備方法:向MDM基礎培養(yǎng)基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、bFGF母液、PDGF