專利名稱：一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，具體說是涉及一種人臍帶間充 質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在人骨髓中除了存在人造血干細(xì)胞外，還有一類具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞
群體，被稱為人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。人間充質(zhì)干細(xì) 胞具有自我更新和多向分化的潛能，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為三胚層細(xì)胞， 如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。此夕卜，MSCs還表達(dá) IL6、 G-CSF和SCF等多種造血細(xì)胞生長所需要的因子，能夠維持長期培養(yǎng)的 造血祖細(xì)胞增殖，顯示MSC具有支持造血和促進(jìn)造血恢復(fù)的作用。同時研究 表明MSC具有免疫調(diào)節(jié)作用，在體外能夠抑制T淋巴細(xì)胞增殖，體內(nèi)動物實 驗發(fā)現(xiàn)MSCs移植可以抑制異體免疫反應(yīng)，減輕移植相關(guān)的排斥反應(yīng)，并延長 異體移植物的存活時間。最近的臨床試驗發(fā)現(xiàn)MSCs聯(lián)合造血干細(xì)胞移植可以 減輕GVHD并降低移植失敗率。MSC的多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)能力決定了 其在細(xì)胞治療、組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
目前MSC的來源主要為成人骨髓。然而研究同時發(fā)現(xiàn)，人骨髓中MSCs含 量極低，大約10^10S個單個核細(xì)胞中才含有1個MSC，并且隨著外科手術(shù)技 術(shù)水平的提高，大創(chuàng)傷性手術(shù)越來越少，骨髓MSC來源越來越困難；另外， 骨髓MSCs進(jìn)行移植中可能存在的免疫排斥反應(yīng)以及倫理道德將阻礙MSCs作 為組織工程種子細(xì)胞的臨床應(yīng)用，因此，尋找新的MSCs來源成為目前國內(nèi)外 研究的熱點。人臍帶由于細(xì)胞原始、來源廣泛、移植不涉及社會、倫理、法 律等方面的爭論，成為極好的MSC組織來源，本研究擬從人臍帶中分離培養(yǎng) MSCs，拓展MSCs新來源。
干細(xì)胞庫是在-196。C液氮中儲存干細(xì)胞或者相關(guān)資源的場所。目前干細(xì)胞庫主要分為中華骨髓庫和臍帶血造血干細(xì)胞庫。中華骨髓庫主要開展造血 干細(xì)胞捐獻(xiàn)和移植治療工作，負(fù)責(zé)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫總體規(guī)劃的制定
和實施，開展志愿捐獻(xiàn)者的宣傳、組織、動員、HLA (白細(xì)胞抗原)分型，
為患者檢索配型相合的捐獻(xiàn)者及移植相關(guān)服務(wù)等。臍帶血造血干細(xì)胞庫主要 以人體造血干細(xì)胞移植為目的將新生兒臍帶血采集后分離冷凍儲存的干細(xì)胞 庫。目前國際通行的保存臍血干細(xì)胞的模式分為公共庫和自體庫兩種模式。
公共庫的干細(xì)胞主要面向需要進(jìn)行移植但自體干細(xì)胞沒有被保存的病人；自 體庫則是在出生或健康時，將干細(xì)胞采集一部分予以保存，在自己或親屬生 病時用來治病。但是，對于隨同臍帶血一同產(chǎn)生的臍帶組織則被丟棄，其中 包含的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞這不可復(fù)得的重要資源則白白丟失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種步驟更少、操作更加簡單、容易的方法來構(gòu) 建利用新生兒臍帶為資源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
一種充分利用新生兒臍帶為資源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，由 下述步驟組成
(1) 取人臍帶進(jìn)行ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、微生物免疫檢測、 用緩沖液沖洗去除殘留血液，剪碎，獲得人臍帶組織；
(2) 向步驟(1)所獲得人臍帶組織中加入1-3倍體積的0.05%-0.2%膠 原酶消化，獲得消化后組織；
(3) 加入緩沖液稀釋步驟(2)消化后組織，混勻、離心，離心力為600g， 時間為15分鐘；
(4) 棄上清，加入緩沖液重懸步驟(3)沉淀，過200目篩網(wǎng)，收集濾液， 離心，離心力為450g，時間為10分鐘，重復(fù)兩次，即獲得人臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞；
(5) 將步驟(4)獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置液氮保存，按其ABO/Rh 分型和HLA分型進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫。上述步驟(4)所獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按2X10Vcii^接種塑料培養(yǎng) 皿，用含10。/。FBS (Gibco，BRL,USA)的LG-DMEM (Gibco，USA)培養(yǎng)基 置37"C、 5%(:02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d換 液，待細(xì)胞80%匯合，0.25%胰酶(Sigma，USA)消化，按l : 3傳代，可得 到大量(1X101Q)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于科學(xué)研究和臨床治療。
優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液pH值為7.2-7.4。
優(yōu)選地，所述膠原酶消化溫度為37"C，消化時間為l-3h。
進(jìn)一步地，所述膠原酶消化的同時，通過用轉(zhuǎn)子進(jìn)行攪拌來提高消化程度。
進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增后得到大量間充質(zhì)干細(xì)胞，用冷凍保護(hù)劑預(yù)處理， 分裝放入凍存管；所述冷凍保護(hù)劑由10% DMSO、 10%右旋糖苷和80% LG-DMEM組成。
上述全部過程均在無菌環(huán)境中進(jìn)行操作。
本發(fā)明所述的一種新的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，與現(xiàn)有建庫 方法相比，構(gòu)建方法更快捷、更方便、對細(xì)胞損傷更小。根據(jù)本發(fā)明方法， 儲存于庫內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)短期培養(yǎng)可獲得大量富有活性的MSC，并且 能夠長時間保存而不失活性，操作簡單易行，建庫成本低廉，富有應(yīng)用前景。


圖1、人臍帶來源的MSC細(xì)胞形態(tài)觀察(A)采用本發(fā)明方法獲得的MSC 原代培養(yǎng)第1 d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成短梭形;(B) MSC原代培養(yǎng)第5 d細(xì)胞形態(tài)， 細(xì)胞成梭形；(C)P1代MSC培養(yǎng)5d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形；(D)P3代MSC 培養(yǎng)5 d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形；(E) P6代MSC培養(yǎng)5 d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成 梭形；(F)P9代MSC培養(yǎng)5d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形。
圖2、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P3代細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原檢測取P3代 MSC消化，收集細(xì)胞，流式檢測CD29、 CD34、 CD44、 CD45、 CD106、 CD152、 CD166、 CD271。
具體實施例方式
6下面結(jié)合附圖和具體實例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于下 述實施例。
實施例1:
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建
(1) 將人臍帶經(jīng)過嚴(yán)格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、 梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、乙型肝炎抗原抗體檢測等) 確認(rèn)安全性后，由緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至 約1 mm3-1.5 mm3小碎塊；
(2) 取小碎塊10ml，置于50ml離心管中，加入0.05%的膠原酶10 ml， 置37 "C消化1 h獲得消化后混合物；
(3) 往消化后混合物中加入磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)至充滿50ml離心 管，混勻，600g離心15min;
(4) 棄上清，加入Mml磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)，重懸沉淀，過200 目篩網(wǎng)，收集濾液，450 g離心10min，重復(fù)兩次，即制備出建庫所需人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
(5) 干細(xì)胞入庫前，按2X10Vcn^接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10MFBS (GibcoBRL,USA)的LG畫DMEM (Gibco,USA)培養(yǎng)基，置37。C、 5%C02
培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶(Sigma, USA)消化，按1 : 3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充 質(zhì)干細(xì)胞，將所獲得細(xì)胞用10%DMSO、 10Q/()右旋糖苷和80。/()LG-DMEM冷 凍保護(hù)劑預(yù)處理，分裝放入2ml凍存管，-196匸液氮保存。留取小部分細(xì)胞 儲存在-8(TC冰箱，作為庫存產(chǎn)品的復(fù)查樣品。將其詳細(xì)信息(供者姓名、 供者父母姓名、地址、聯(lián)系方式、干細(xì)胞的配型信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫， 建立完善的數(shù)據(jù)檔案。 實施例2:
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建
(1)將人臍帶經(jīng)過嚴(yán)格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、 梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、乙型肝炎抗原抗體檢測等) 確認(rèn)安全性后，由緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至約1 mm3-1.5 mm3小碎塊；
(2) 取小碎塊10ml，置于50ml離心管中，加入0.1%的膠原酶20 ml, 置37 r消化2 h獲得消化后混合物；
(3) 往消化后混合物中加入磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)至充滿50ml離心 管，混勻，600 g離心15min;
(4) 棄上清，加入20ml磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)，重懸沉淀，過200 目篩網(wǎng)，收集濾液，450 g離心10min，重復(fù)兩次，即制備出建庫所需人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
(5) 干細(xì)胞入庫前，按2X10Vcn^接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10。/。FBS (GibcoBRL，USA)的LG-DMEM (Gibco,USA)培養(yǎng)基，置37。C、 5%C02
培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶(Sigma, USA)消化，按l : 3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充 質(zhì)干細(xì)胞，將所獲得細(xì)胞用10%DMSO、 10%右旋糖苷和80°/。 LG-DMEM冷 凍保護(hù)劑預(yù)處理，分裝放入2ml凍存管，-196"液氮保存。留取小部分細(xì)胞 儲存在-80。C冰箱，作為庫存產(chǎn)品的復(fù)査樣品。將其詳細(xì)信息(供者姓名、 供者父母姓名、地址、聯(lián)系方式、干細(xì)胞的配型信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫， 建立完善的數(shù)據(jù)檔案。 實施例3:
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建
(1) 將人臍帶經(jīng)過嚴(yán)格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、 梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、乙型肝炎抗原抗體檢測等) 確認(rèn)安全性后，由緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至 約1 mm3-1.5 mm3小碎塊；
(2) 取小碎塊10ml，置于50ml離心管中，加入0.2%的膠原酶30 ml， 置37 r消化3 h獲得消化后混合物；
(3) 往消化后混合物中加入磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)至充滿50ml離心 管，混勻，600g離心15min;
(4) 棄上清，加入Mml磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)，重懸沉淀，過200 目篩網(wǎng)，收集濾液，450 g離心10min，重復(fù)兩次，即制備出建庫所需人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
(5)干細(xì)胞入庫前，按2X10Vcri^接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10。/。FBS (Gibco BRL， USA)的LG-DMEM (Gibco, USA)培養(yǎng)基，置37 °C、 5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶(Sigma，USA)消化，按l : 3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充 質(zhì)干細(xì)胞，將所獲得細(xì)胞用10%DMSO、 10%右旋糖苷和80y。LG-DMEM冷 凍保護(hù)劑預(yù)處理，分裝放入2ml凍存管，-196匸液氮保存。留取小部分細(xì)胞 儲存在-8(TC冰箱，作為庫存產(chǎn)品的復(fù)查樣品。將其詳細(xì)信息(供者姓名、 供者父母姓名、地址、聯(lián)系方式、干細(xì)胞的配型信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫， 建立完善的數(shù)據(jù)檔案。 實施例4:
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建
(1) 將人臍帶經(jīng)過嚴(yán)格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、 梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、乙型肝炎抗原抗體檢測等) 確認(rèn)安全性后，由緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至 約1 mm3-1.5 mm3小碎塊；
(2) 取小碎塊10ml，置于50ml離心管中，加入0.05%的膠原酶30 ml， 置37 。C消化3 h獲得消化后混合物；
(3) 往消化后混合物中加入磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)至充滿50ml離心 管，混勻，600 g離心15min;
(4) 棄上清，加入20ml磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)，重懸沉淀，過200 目篩網(wǎng)，收集濾液，450 g離心10min，重復(fù)兩次，即制備出建庫所需人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
(5) 干細(xì)胞入庫前，按2X10Vcn^接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10。/。FBS (GibcoBRL，USA)的LG-DMEM (Gibco,USA)培養(yǎng)基，置37。C、 5%C02
培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶(Sigma, USA)消化，按l : 3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充 質(zhì)干細(xì)胞，將所獲得細(xì)胞用10%DMSO、 10%右旋糖苷冷凍保護(hù)劑和80% LG-DMEM預(yù)處理，分裝放入2ml凍存管，-196'C液氮保存。留取小部分細(xì)胞儲存在-8(TC冰箱，作為庫存產(chǎn)品的復(fù)査樣品。將其詳細(xì)信息(供者姓名、 供者父母姓名、地址、聯(lián)系方式、干細(xì)胞的配型信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫， 建立完善的數(shù)據(jù)檔案。
實施例5:
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建
(1) 將人臍帶經(jīng)過嚴(yán)格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、 梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、乙型肝炎抗原抗體檢測等) 確認(rèn)安全性后，由緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至 約1 mm3-1.5 mm3小碎塊；
(2) 取小碎塊10ml，置于50ml離心管中，加入0.2%的膠原酶10 ml， 置37 。C消化1 h獲得消化后混合物；
(3) 往消化后混合物中加入磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)至充滿50ml離心 管，混勻，600 g離心15min;
(4) 棄上清，加入20ml磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)，重懸沉淀，過200 目篩網(wǎng)，收集濾液，450 g離心10min，重復(fù)兩次，即制備出建庫所需人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
(5) 干細(xì)胞入庫前，按2X10Vct^接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10。/。FBS (GibcoBRL,USA)的LG隱DMEM (Gibco,USA)培養(yǎng)基，置37。C、 5%C02
培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶(Sigma, USA)消化，按1 : 3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充 質(zhì)干細(xì)胞，將所獲得細(xì)胞用10%DMSO、 10%右旋糖苷和80。/。LG-DMEM冷 凍保護(hù)劑預(yù)處理，分裝放入2ml凍存管，-196"C液氮保存。留取小部分細(xì)胞 儲存在-8(TC冰箱，作為庫存產(chǎn)品的復(fù)査樣品。將其詳細(xì)信息(供者姓名、 供者父母姓名、地址、聯(lián)系方式、干細(xì)胞的配型信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫， 建立完善的數(shù)據(jù)檔案。 實施例6:
人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建
(1)將人臍帶經(jīng)過嚴(yán)格檢測程序(ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、 梅毒抗體檢測、HIV免疫檢測、CMV抗體檢測、乙型肝炎抗原抗體檢測等)確認(rèn)安全性后，由緩沖液反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用無菌刀具將其切割至
約1 mm3-1.5 mm3小碎塊；
(2) 取小碎塊10 ml，置于50 ml離心管中，加入0.2%的膠原酶20 ml， 置37 x:消化2 h獲得消化后混合物；
(3) 往消化后混合物中加入磷酸緩沖液(PH-7.2-7.4)至充滿50ml離心 管，混勻，600 g離心15min;
(4) 棄上清，加入20ml磷酸緩沖液(PH=7.2-7.4)，重懸沉淀，過200 目篩網(wǎng)，收集濾液，450 g離心10min，重復(fù)兩次，即制備出建庫所需人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
(5) 干細(xì)胞入庫前，按2X10Vcm2接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10%FBS (GibcoBRL，USA)的LG-DMEM (Gibco，USA)培養(yǎng)基，置37。C、 5%C02
培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2d后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3d后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶(Sigma, USA)消化，按l : 3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充 質(zhì)干細(xì)胞，將所獲得細(xì)胞用10%DMSO、 10°/。右旋糖苷和80% LG-DMEM冷 凍保護(hù)劑預(yù)處理，分裝放入2ml凍存管，-196匸液氮保存。留取小部分細(xì)胞 儲存在-80 'C冰箱，作為庫存產(chǎn)品的復(fù)查樣品。將其詳細(xì)信息(供者姓名、 供者父母姓名、地址、聯(lián)系方式、干細(xì)胞的配型信息等)輸入電腦數(shù)據(jù)庫， 建立完善的數(shù)據(jù)檔案。
如圖1所示，為人臍帶來源的MSC細(xì)胞形態(tài)觀察圖(A)采用本發(fā)明方 法獲得的MSC原代培養(yǎng)第ld細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成短梭形；(B)MSC原代培養(yǎng) 第5d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形；(C)Pl代MSC培養(yǎng)5d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭 形；(D) P3代MSC培養(yǎng)5 d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形；(E) P6代MSC培養(yǎng)5 d 細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形；(F)P9代MSC培養(yǎng)5d細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞成梭形。
如圖2所示，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P3代細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原檢測取 P3代MSC消化，收集細(xì)胞，流式檢測CD29、 CD34、 CD44、 CD45、 CD106、 CD152、 CD166、 CD271，流式結(jié)果顯示CD29+、 CD34國、CD44+、 CD45-、 CD106畫、CD152+、 CD166+、 CD271-。
上述操作均在無菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，為保證細(xì)胞不受污染，所有使用的磷酸 緩沖液(PH=7.2-7.4)均加入了 1%青霉素和鏈霉素。
ii上述實施例所選用的膠原酶和胰蛋白酶來源如下
膠原酶II型Gibco公司，1000 mg包裝，溶液500 mlHBSS中制成質(zhì)
量體積比為0.2%酶溶液；
胰蛋白酶(l : 250): Gibco公司，1000 mg包裝，溶液400 ml磷酸緩沖 液(PH=7.2-7.4)中制成質(zhì)量體積比為0.25%。
權(quán)利要求
1.一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，由下述步驟組成(1)取人臍帶進(jìn)行ABO/Rh血型檢測、HLA分型檢測、微生物免疫檢測、用緩沖液沖洗去除殘留血液，剪碎，獲得人臍帶組織；(2)向步驟(1)所獲得人臍帶組織中加入1-3倍體積的0.05％-0.2％膠原酶消化，獲得消化后組織；(3)加入緩沖液稀釋步驟(2)消化后組織，混勻、離心，離心力為600g，時間為15分鐘；(4)棄上清，加入緩沖液重懸步驟(3)沉淀，過200目篩網(wǎng)，收集濾液，離心，離心力為450g，時間為10分鐘，重復(fù)兩次，即獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；(5)將步驟(4)獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟(4)與步驟(5) 之間加入如下步驟將步驟(4)得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按2X10Vcm2 接種于塑料培養(yǎng)皿，用含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，置37。C、 5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3天后換液，待細(xì)胞80% 匯合，0.25%胰酶消化，按1:3傳代，擴(kuò)增后得到大量間充質(zhì)干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述緩沖液為磷 酸緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液pH 值為7.2-7.4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述膠原酶消化溫度為37 °C，消化時間為1-3 h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述膠原酶消化 的同時，通過用轉(zhuǎn)子進(jìn)行攪拌來提高消化程度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述擴(kuò)增后得到大量 間充質(zhì)干細(xì)胞，用冷凍保護(hù)劑預(yù)處理，分裝放入凍存管。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述冷凍保護(hù)劑 由10%DMSO、 10°/。右旋糖苷和80。/。LG-DMEM組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用新生兒臍帶為資源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，目的在于構(gòu)建臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫時步驟更少、操作更加簡單、容易。本發(fā)明由下述步驟組成(1)取人臍帶進(jìn)行檢測，用緩沖液沖洗去除殘留血液，剪碎，獲得人臍帶組織；(2)加入膠原酶消化；(3)加入緩沖液稀釋消化后組織，混勻、離心；(4)棄上清，加入緩沖液重懸沉淀，過篩，收集濾液，離心，重復(fù)兩次，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；(5)將獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置液氮保存，按其ABO/Rh分型和HLA分型進(jìn)行保存，建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案，即構(gòu)建出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法更快捷、更方便、對細(xì)胞損傷更小。
文檔編號A01N1/02GK101608174SQ200910055219
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者錢燕翔, 峰 高 申請人:章 毅;上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司