臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程、組織工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別設(shè)及利用廝帶間充質(zhì)干細(xì) 胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是膜島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足或膜島素受體等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 質(zhì)代謝素亂性疾病。臨床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射膜島素來(lái)治療。而細(xì) 胞治療是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治療策略，尤其對(duì)于已經(jīng)喪失膜島細(xì)胞功能的糖 尿病患者來(lái)說(shuō)，植入能分泌膜島素的膜島細(xì)胞或其替代物是最理想的治療方法。目前，膜島 細(xì)胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細(xì)胞來(lái)源不足、嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)等困難 極大的限制了該種療法的應(yīng)用。
[0003] 干細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我更新能力及多向分化潛能，是基因治療的理想祀細(xì)胞。干 細(xì)胞分為全能干細(xì)胞（如胚胎干細(xì)胞，可W分化為機(jī)體所有組織細(xì)胞）、多能干細(xì)胞胞（具 有多向分化潛能，可W分化為多種組織細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞等）和專(zhuān)能干細(xì)胞（維持某一 特定組織細(xì)胞的單一方向自我更新，如腸上皮干細(xì)胞等）。干細(xì)胞技術(shù)的不斷突破及干細(xì)胞 本身所具有的特性使人類(lèi)有可能在體外培養(yǎng)某些干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)其分化為我們所需要的 各種組織細(xì)胞，或作為種子細(xì)胞用于組織工程W供臨床所需，W此為目的的干細(xì)胞工程設(shè) 及人體幾乎所有重要組織器官及人類(lèi)面臨的大多數(shù)醫(yī)學(xué)難題，如屯、血管疾病、糖尿病、惡性 腫瘤、骨及軟骨缺損、老年性癡呆、帕金森病、燒傷、脊髓損傷和遺傳性缺陷等的治療。由于 人羊水、廝帶血、外周血和骨髓中的多能干細(xì)胞，具有增殖能力強(qiáng)、來(lái)源豐富、采集方便等優(yōu) 點(diǎn)，此類(lèi)干細(xì)胞移植在血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等的治療中發(fā)揮了重要的 作用。
[0004] 對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蛐揎?，使之成為能分泌膜島素的細(xì)胞，是治療I型糖尿 病的理想策略之一。目前，現(xiàn)有技術(shù)中已出現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法，即應(yīng)用 插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿共培養(yǎng)板體外誘導(dǎo)廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞向膜島樣細(xì)胞分化具體為；選取 第3代廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用含10%FBS(胎牛血清）的L-DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì) 胞密度為1X105個(gè)/ml,接種于普通6孔板，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，改為L(zhǎng)-DMEM/ RPMI1640(1:1)培養(yǎng)基（低糖型改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基與RPMI16401:1混合而成的培養(yǎng) 基）。同時(shí)將已分離獲得的膜島細(xì)胞，W50個(gè)/孔接種于共培養(yǎng)板的中，進(jìn)行廝帶間充質(zhì)干 細(xì)胞和膜島細(xì)胞兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)。然而，此種共培養(yǎng)方法不僅需要一定的膜島細(xì)胞源，過(guò) 程較繁瑣，花費(fèi)較大，而且所獲得的更多為散在膜島樣細(xì)胞，數(shù)量較少，膜島細(xì)胞團(tuán)幾乎沒(méi) 有，而且散在的膜島樣細(xì)胞相對(duì)較小，膜島素分泌量少難W達(dá)到臨床移植要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中干細(xì)胞與膜島細(xì)胞共培養(yǎng)方式所 獲得的膜島細(xì)胞較小，數(shù)量較少，且花費(fèi)較大等缺陷，提供一種高效的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn) 化為膜島細(xì)胞的方法，通過(guò)該方法不僅提高了膜島細(xì)胞的數(shù)量，也提高了膜島細(xì)胞的質(zhì)量。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是；提供一種廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 膜島細(xì)胞的方法，取第=代廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中，按W下步驟對(duì)第=代廝帶間 充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)：
[0007] 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入第一種誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至細(xì)胞完成增殖過(guò)程，獲得預(yù)轉(zhuǎn)化干細(xì) 胞體；
[000引并在含有膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸的DMEM/F12培養(yǎng)基中，加入第二種誘導(dǎo)液，培養(yǎng) 所述預(yù)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞體至細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)束，獲得膜島細(xì)胞液；
[0009] 其中，所述第一種誘導(dǎo)液包括5-15mmol/L巧克酷胺、15-30yg/L表皮生長(zhǎng)因子；
[0010] 所述第二種誘導(dǎo)液包括5-15mmol/L巧克酷胺和5-15yg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子。
[0011] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第一誘導(dǎo)液還 包括60yg/l-150yg/L0 -神經(jīng)生長(zhǎng)因子和1-lOnmol/L激活素A。
[0012] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第一誘導(dǎo)液還 包括還原劑。
[0013] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述還原劑為 0 -琉基己醇，且0 -琉基己醇為5-15yg/L。
[0014] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第一種誘導(dǎo)液 中巧克酷胺的濃度為5mmol/l，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為30yg/l，0 -神經(jīng)生長(zhǎng)因子的濃度 為150yg/l，激活素A的濃度為lOnmol/l，0 -琉基己醇的濃度為10yg/L。
[0015] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第一種誘導(dǎo)液 中巧克酷胺的濃度為15mmol/l，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為15yg/l，0 -神經(jīng)生長(zhǎng)因子的濃度 為60yg/l，激活素A的濃度為lnmol/1，0 -琉基己醇的濃度為15yg/L。
[0016] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第一種誘導(dǎo)液 中巧克酷胺的濃度為lOmmol/l，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25yg/l，0 -神經(jīng)生長(zhǎng)因子的濃度 為100yg/l，激活素A的濃度為4nmol/l，0 -琉基己醇的濃度為5yg/L。
[0017] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，DMEM/F12培養(yǎng)基中 含有的膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% -5%。
[0018] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第二種誘導(dǎo)液 中巧克酷胺的濃度為lOmmol/l，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為10yg/L。
[0019] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第二種誘導(dǎo)液 中巧克酷胺的濃度為5mmol/l，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為5yg/L。
[0020] 在本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法中，所述第二種誘導(dǎo)液 中巧克酷胺的濃度為15mmol/l，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為15yg/L。
[0021] 實(shí)施本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法，可W達(dá)到W下有益 效果；該方法不僅易操作，而且所獲得膜島細(xì)胞數(shù)量較多，且膜島細(xì)胞質(zhì)量較好，能夠分泌 較多的膜島素。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：
[0023] 圖1為本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞方法所獲得膜島細(xì)胞通 過(guò)雙硫腺染色得到的顯微鏡下的細(xì)胞分布圖；
[0024] 圖2為現(xiàn)有技術(shù)中廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞和膜島細(xì)胞共培養(yǎng)方式獲得的膜島細(xì)胞通 過(guò)雙硫腺染色得到的顯微鏡下的細(xì)胞分布放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中利用廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞與膜島細(xì)胞共同培養(yǎng)誘導(dǎo)廝帶間充質(zhì) 干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的膜島細(xì)胞較少，且數(shù)量較少等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種獨(dú)立培養(yǎng) 誘導(dǎo)廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成膜島細(xì)胞的方法，從而實(shí)現(xiàn)了提高廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 及提高轉(zhuǎn)化后膜島細(xì)胞質(zhì)量的目的。
[0026] 具體地，本發(fā)明提供的廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膜島細(xì)胞的方法為：
[0027] 取第=代廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中，并按W下步驟對(duì)第=代廝帶間充質(zhì) 干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)：
[002引 1)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入第一種誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至細(xì)胞完成增殖過(guò)程，獲得預(yù)轉(zhuǎn)化干 細(xì)胞體；
[0029] 2)并在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% -5%的膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸的DMEM/F12培養(yǎng)基中， 加入第二種誘導(dǎo)液，培養(yǎng)上述預(yù)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞體至細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)束，獲得膜島細(xì)胞液.
[0030] 其中，所述第一種誘導(dǎo)液包括5-15mmol/L巧克酷胺和15-30 y g/L表皮生長(zhǎng)因子；