專利名稱：轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸b含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥用植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到在丹參中轉(zhuǎn)化擬南芥花青色 素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因提高丹酚酸B含量的方法。
背景技術(shù)：
丹參是我國常用大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Mlvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，對(duì)心腦血管疾病、癌癥及各種炎癥具有顯著的臨床 治療作用。丹參的主要活性成分分為兩大類一類為脂溶性的丹參酮類化合物，另一類為水 溶性的酚酸類成分，主要包括丹參素、迷迭香酸和丹酚酸B等。丹參水溶性化合物因與傳統(tǒng) 用藥多以水煎為主的一致性，越來越多地受到人們的關(guān)注。丹酚酸B是目前已知的抗氧化 作用最強(qiáng)的天然產(chǎn)物之一，也是丹參中含量最高、抗氧化活性最強(qiáng)的化合物，其結(jié)構(gòu)上含有 多個(gè)酚羥基，具有清除自由基、保護(hù)心腦血管、抗肝纖維化、抗腫瘤和抗衰老等功能，是《中 華人民共和國藥典》(2010年版)中丹參藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)性成分。據(jù)統(tǒng)計(jì)，丹參年 需求量近2. 4萬噸，銷售價(jià)格近年來一直維持在10元/千克左右，僅藥材生產(chǎn)銷售近2. 3 億元，以丹參為主要原料制成的中成藥有100多種，其產(chǎn)值超過100億元，其中以丹酚酸B 為藥效基礎(chǔ)的新藥研發(fā)倍受人們關(guān)注，蘊(yùn)藏著巨大的市場(chǎng)潛力。由于丹參野生資源幾乎耗 盡，目前藥用丹參以人工栽培為主，而栽培中人們對(duì)丹參優(yōu)良品種的選育重視不夠，導(dǎo)致丹 參質(zhì)量良莠差異較大。因此，提高丹參中有效成分，特別是丹酚酸B的含量，培育優(yōu)異的丹 參資源具有重要意義。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外科學(xué)家嘗試組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程的方法， 通過生物/非生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)、原位吸附、半連續(xù)培養(yǎng)等方式提高丹參酮類物質(zhì)的含量取 得了較明顯的進(jìn)展。然而這些手段僅在一定程度上能提高丹參某一時(shí)期酮類物質(zhì)的含量， 沒有涉及丹參酚酸類成分，特別是丹酚酸B含量的提高。另外，此類方法篩選帶有一定的 盲目性，很難獲得持續(xù)穩(wěn)定高產(chǎn)的丹參新品系，使其應(yīng)用受到了限制。在諸多方法之中，利 用基因工程技術(shù)對(duì)藥用植物次生代謝途徑的遺傳特性進(jìn)行改造，提高藥用植物有效成分含 量，培育能夠大量積累目標(biāo)次生代謝物的新品種，愈來愈受到人們的關(guān)注。以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為 核心的現(xiàn)代分子育種技術(shù)在改良藥用植物、豐富中藥資源、提高抗病性和抗逆性、培養(yǎng)高天 然藥物含量的新型轉(zhuǎn)基因藥材中有著誘人的應(yīng)用前景。但目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高丹參中 丹參酚酸類成分，特別是丹酚酸B含量的方法尚無報(bào)道。植物代謝途徑是由多種酶參與的多步反應(yīng)，受發(fā)育、環(huán)境等因素的影響，而對(duì)單個(gè) 基因進(jìn)行修飾有時(shí)難以奏效。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可調(diào)控植物次生代謝物合成途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶 基因的表達(dá)，有效地激活或抑制整條代謝途徑，從而調(diào)節(jié)特定次生代謝物質(zhì)的合成與否以 及積累量的多少。轉(zhuǎn)錄因子通常指由核基因編碼的一類蛋白質(zhì)，它們主要以同源或異源二 聚體的形式同順式作用因子發(fā)生特異性的結(jié)合，通過和某些輔助調(diào)控子發(fā)生作用而影響轉(zhuǎn) 錄復(fù)合體的形成，從而調(diào)節(jié)植物基因的特異性表達(dá)。改變轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)往往可導(dǎo)致植物 中該轉(zhuǎn)錄因子所控制性狀發(fā)生較大改變，因此，利用基因工程的方法調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子是具有應(yīng)用價(jià)值的植物遺傳操作手段。本發(fā)明通過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)載體，將擬南芥花青色素 生成轉(zhuǎn)錄因子1基因?qū)氲⒅?，提高丹參中丹酚酸B的含量，可以填補(bǔ)該領(lǐng)域研究的空 白，因而該技術(shù)路線具有較強(qiáng)的創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述技術(shù)中的不足，提供一種提高丹參中丹 酚酸B含量的新方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是由下述步驟組成1、采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA全長。2、把擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含有所述基 因的植物表達(dá)載體。3、將擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，獲得用于轉(zhuǎn)化 丹參的含有所述植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株。4、用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化丹參，培養(yǎng)并獲得經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的轉(zhuǎn) 基因丹參植株。5、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色素生成 轉(zhuǎn)錄因子1基因的表達(dá)。6、對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因丹參植株中丹酚酸B含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，篩選獲得丹 酚酸B含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因丹參植株。本發(fā)明的采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA全 長方法為設(shè)計(jì)可擴(kuò)增出擬南芥擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因完整編碼框的引物， 并在上游和下游引物上分別引入BglII和BstEII限制性酶切位點(diǎn)，上游引物為5’-AGATCT ATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3，，下游引物為 5，-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3，，以 擬南芥cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，回收連接，轉(zhuǎn) 入大腸桿菌DH5 α，測(cè)序驗(yàn)證并得到所述基因的cDNA編碼序列。本發(fā)明的把擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含有 所述基因的植物表達(dá)載體的方法為用BglII和BstEII雙酶切所述的擬南芥花青色素生成 轉(zhuǎn)錄因子1基因的pGEM T-easy載體和pCAMBIA1302植物表達(dá)載體，回收連接轉(zhuǎn)化，挑取單 克隆，提取質(zhì)粒做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)和酶切驗(yàn)證，得到含有所述基因的植物表達(dá)載體。本發(fā)明的將擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化 丹參的含有所述植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株的方法為將所述的含擬南芥花青色素生 成轉(zhuǎn)錄因子1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿EHA105，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證，獲得 含有所述植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株。本發(fā)明的經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因丹參植株為用所述的根癌農(nóng)桿菌菌株 轉(zhuǎn)化丹參葉片，置于由MS培養(yǎng)基、4. 4μ M ΒΑΡ、0. 5μΜ NAA、200mg/L頭孢霉素、5mg/L潮霉 素組成的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，長出抗性芽后將其轉(zhuǎn)入附加5mg/L潮霉素的V2MS 培養(yǎng)基上生根，獲得潮霉素抗性的再生丹參植株，用擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因 的特異性檢測(cè)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增再生丹參植株DNA，紫外線下觀察到747bp目的條 帶的陽性株系即為轉(zhuǎn)基因丹參植株。
本發(fā)明的半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色 素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的表達(dá)方法為用擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因和丹參管家 基因延長因子l-α的檢測(cè)引物，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，用相對(duì)定量法 分析擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明的對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因丹參植株中丹酚酸B含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定方法 為用Wienomenex硅膠基質(zhì)C18反向色譜柱，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液、乙腈和甲 醇為流動(dòng)相梯度洗脫，流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?. 01 5分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶 液體積由95%降為90%，乙腈體積由5%升至10%;5 25分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸 水溶液體積由90%降為67%，乙腈體積由10%升至30%，甲醇體積由0升至3% ；25 40 分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的醋酸水溶液體積由67 %降為60 %，乙腈體積由30 %升至35 %，甲 醇體積由3%升至5%。柱溫30°C，流速1. OmL/分鐘，檢測(cè)波長^Onm,進(jìn)樣量20 μ L，丹酚 酸B的含量根據(jù)其峰面積由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y = 5E-8x-0. 0134 (r2 = 0. 9997)進(jìn)行計(jì)算，式中χ表示樣品中丹酚酸B的峰面積，y表示丹酚酸B的濃度，單位mg/ mL，r表示相關(guān)系數(shù)。本發(fā)明將擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因轉(zhuǎn)入丹參植株，篩選獲得了丹酚酸 B含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因丹參植株。在生長165天的轉(zhuǎn)基因的丹參干燥根中，丹酚酸B的 含量高達(dá)73. 27mg/g，是同時(shí)期非轉(zhuǎn)化普通丹參干燥根中丹酚酸B含量(36. 98mg/g)的2. 0 倍，高于《中華人民共和國藥典》(2010年版)中規(guī)定的丹參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為提高丹參中丹 酚酸B含量提供了一種新方法，可在丹參的培育中推廣使用。


圖1是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因丹參植株的電泳圖。圖2是半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色素生 成轉(zhuǎn)錄因子1基因表達(dá)量的電泳圖。圖3是高效液相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因丹參植株中丹酚酸B含量的色譜圖。 具體實(shí)施方案下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照已知的方法進(jìn)行操作，例如 Sambrook 等〈〈分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)〉〉(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行操作。1、擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因cDNA全長的克隆(1)擬南芥總RNA的提取選取新鮮、健壯的擬南芥幼苗全株，利用杭州博日科技有限公司生產(chǎn)的Biozol總 RNA提取試劑盒分離提取其總RNA。提取方法參照Biozol總RNA提取試劑盒(Cat# BSC51S1) 說明書。(a)提取擬南芥總RNA的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作
所使用的各種玻璃儀器、槍頭、離心管、全部洗凈，浸泡于經(jīng)過夜搖勻的體積 分?jǐn)?shù)為0. 的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中，浸泡M小時(shí)以上，取出后在121°C， 1. 034X IO5Pa蒸汽滅菌40分鐘，50°C烘干備用。(b)向洗凈的研缽中加入適量酒精燒研缽和藥匙，待研缽冷卻后，取Ig丹參材料， 置于液氮中研磨成粉末，加入ImL Biozol RNA提取試劑，劇烈震蕩后室溫下孵育15分鐘， 使樣品充分裂解至透明。上述的Biozol RNA提取試劑由杭州博日科技有限公司生產(chǎn)。(c)將勻漿液4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清棄去沉淀。(d)按照氯仿與Biozol RNA提取試劑的體積比為1 5加入氯仿，蓋緊管蓋，顛倒 振蕩混勻，冰上孵育15分鐘。(e)4°C, 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清層。(f)將上清層轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，按Biozol RNA提取試劑與氯仿、水飽和酚 的體積比為5 1 1加入氯仿、水飽和酚，振蕩混勻15秒。(g)4°C, 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清層。(h)將上清層轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入等體積冰浴的異丙醇，溫和顛倒振蕩混 勻，_20°C條件下孵育20分鐘以上。(i) 40C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清，留沉淀，RNA沉淀通常形成片狀沉
淀附著于管壁或者管底。(j)用冰浴的ImL體積分?jǐn)?shù)為75 %的乙醇水溶液洗滌RNA沉淀，顛倒洗滌離心管
管壁，并渦旋振蕩樣品，盡可能讓沉淀懸浮。(k) 40C，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，再次去除上清，于陰涼處適度晾干沉淀。(1)加入100 μ L的無RNA酶水溶解沉淀，抽提好的RNA，保存于_80°C或者立即以 120伏電壓，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(2)cDNA第一鏈的合成選取質(zhì)量較好的RNA利用TaKaRa公司的M-MLV (RNase H-)反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第 一鏈。步驟如下(a)在反應(yīng)管中加入Ing-I μ g總RNA，以及1 μ L oligo (dT) 18 (50mM)，加入體積分 數(shù)為0. 1 %的DEPC水溶液至12 μ L，將反應(yīng)液混勻，70°C孵育10分鐘后迅速在冰上急冷2 分鐘以上。(b) 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集于反應(yīng)管底部。(c)反應(yīng)液中依次加入5 X M-MLVBuffer4 μ LdNTP Mixture (各 IOmM)1 μ LRNase Inhibitor (40U/ μ L)0. 5 μ LRTase M-MLV (RNase F) (200U/ μ L) 1 μ LRNase free dH20力口至 20 μ L(d)將反應(yīng)混合液混勻，42°C孵育60分鐘，70°C孵育15分鐘終止反應(yīng)；(e)將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋10倍，-20°C保存?zhèn)溆谩?3)擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增
根據(jù)所述的擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA序列(核苷酸序列表)， 利用I^emier Primer 5. 0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物，并在 上游和下游引物上分別引入BglII和BstEII限制性酶切位點(diǎn)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。構(gòu)建上 游引物 AtPAPl-F 為5’ -AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3，；下游引物 AtPAPl-R 為5’ -GG TAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3，。以擬南芥cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增， 將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物于的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，目標(biāo)片段回收后與pGEMT-easy載體 連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，隨機(jī)挑選所得陽性克隆經(jīng)菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)后送上海生 工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的擬南 芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA編碼序列(核苷酸序列表)一致。所述的采用基因克隆方法從擬南芥中獲得序列正確的擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄 因子1基因，為通過轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量提供了一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子基因。2、含擬芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建以pCAMBIA1302(為市場(chǎng)銷售的生物材料，由澳大利亞CAMBIA公司生產(chǎn))為植 物表達(dá)載體，用擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因替換其上的綠色熒光蛋白基因，即用 BglII和BstEII雙酶切含有擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的pGEM T-easy載體和 PCAMBIA1302植物表達(dá)載體，回收擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因和pCAMBIA1302大片 段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶切驗(yàn)證，得到含有所述基因的 植物表達(dá)載體。上述的將擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含有所 述基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過基因工程策略來提高丹參中丹酚酸B的含量。3、含擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株的獲 得將含擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105，根癌農(nóng)桿菌EHA105為市場(chǎng)出售的生物材料，由澳大利亞CAMBIA公司生產(chǎn)，菌株編 號(hào)為Gambarl，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明，含擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因 子1基因的植物表達(dá)載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。具體的構(gòu)建方法如下用氯化鈣法制備感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105，在50mL的無菌離心管中加入5mL LB液體 培養(yǎng)基(含利福霉素20mg/L)，用滅菌的牙簽從平板上挑取生長良好的EHA105單菌落接種 于該離心管中，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28V 180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)16 18小時(shí)，次日取2mL培養(yǎng)物 接種到含IOOmL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)180轉(zhuǎn)/分鐘快速培養(yǎng)至 OD600為0. 4 0. 6，無菌條件下轉(zhuǎn)移菌液至兩只高壓滅菌的50mL離心管中，立即冰浴30分 鐘，4°C 5000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘收集細(xì)胞，棄上清，加IOmL預(yù)冷的0. ImoL CaCl2溶液溫 和重懸菌體，冰浴20分鐘，4°C保存10小時(shí)備用。采用以下方法獲得含擬南芥花青色素生 成轉(zhuǎn)錄因子1基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株取一管EHA105感受態(tài)細(xì)胞置冰上溶化，將含擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因 植物表達(dá)載體30ng加入到100 μ L溶化后的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴40分鐘，42°C熱激90秒， 移至冰上放置1 2分鐘，向試管中加入400 μ L LB液體培養(yǎng)基，280C 100轉(zhuǎn)/分鐘恢復(fù)培 養(yǎng)3 4小時(shí)，將菌液均勻涂布于含有利福霉素G0mg/L)和壯觀霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 36小時(shí)，挑取抗性單菌落，接種于IOmL LB液 體培養(yǎng)基中(含壯觀霉素50mg/L，利福霉素20mg/L)J8°C 180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)16小時(shí)， 用菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因。結(jié)果表明，含有擬南芥 花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因植物表達(dá)載體已經(jīng)成功地構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。4、轉(zhuǎn)基因丹參植株的獲得(1)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因轉(zhuǎn)化丹參(a)外植體的預(yù)培養(yǎng)丹參種子用流水沖洗，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液表面滅菌20秒，二次蒸餾水 沖洗2次，每次4分鐘，用體積分?jǐn)?shù)為0. 1 %的升汞水溶液表面滅菌10分鐘，二次蒸餾水 沖洗5次，種子用濾紙吸干表面殘存的水分后置于MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，25°C，16小時(shí)/8 小時(shí)3000LUX光/暗培養(yǎng)，獲得的無菌試管苗，從節(jié)間切斷，將帶有2個(gè)腋芽的莖段扦插于 1/2MS培養(yǎng)基上，每四周繼代繁殖一次。轉(zhuǎn)化所用的材料均為繼代2 4次的丹參試管苗， 其中繼代培養(yǎng)20天的幼苗用于基因轉(zhuǎn)化，繼代培養(yǎng)30天的幼苗用于核酸提取及各種檢測(cè)。選取繼代培養(yǎng)20天的丹參無菌苗，將其葉片切成0. 5cmX0. 5cm的小塊，轉(zhuǎn)入預(yù)培 養(yǎng)培養(yǎng)基中(MS培養(yǎng)基附加4. 4 μ M BAP和0. 5 μ M NAA)，在正常培養(yǎng)條件下預(yù)培養(yǎng)1天。(b)浸染及共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)的丹參葉片取出，3/4丹參葉片放入含擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1 基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌液中浸染25 30分鐘，取出丹參葉片，將其表面的菌液 用濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 3天。1/4丹參葉片不在菌懸液中進(jìn)行浸染， 直接在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上生芽后，將芽剝落，置于1/2MS培養(yǎng)基上生根，作為實(shí)驗(yàn)未轉(zhuǎn)化的對(duì) 照植株。(c)選擇培養(yǎng)共培養(yǎng)2 3天后，將外植體從原培養(yǎng)基上取出，轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基上。選擇培養(yǎng) 基為預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基附加200mg/L頭孢霉素和5mg/L潮霉素。每10天更換一次選擇培養(yǎng)基。(d)不定芽生根及植株再生待抗性芽長到0.5cm左右時(shí)，將抗性芽切下，轉(zhuǎn)入附加5mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng) 基上生根，完整的植株從節(jié)間切斷，將帶有2個(gè)腋芽的莖段扦插于1/2MS培養(yǎng)基上繼代培 養(yǎng)，獲得潮霉素抗性的再生丹參植株。(2)轉(zhuǎn)基因丹參植株的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)采用改良的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)方法提取上述轉(zhuǎn)基因和對(duì)照丹參植株 的DNA，利擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因完整編碼框的上下游引物對(duì)目的基因進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)，電泳圖見圖1，在圖1中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為100， 250，500，750，IOOObp.第1泳道為非轉(zhuǎn)化丹參株系，第2泳道為陽性對(duì)照即含擬南芥花青 色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的植物表達(dá)載體，第3-16泳道為不同的轉(zhuǎn)基因株系，B為未加DNA 模板的陰性對(duì)照，由圖1可見，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異引物，能擴(kuò)增出747bp的特異DNA片 段，而以非轉(zhuǎn)化丹參基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段，說明所述的載體構(gòu)建和轉(zhuǎn) 化策略是正確的，目的基因已插入丹參基因組中。轉(zhuǎn)基因丹參植株的獲得為篩選較高丹酚 酸B含量的丹參株系提供了基本材料。5、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的表達(dá)(1)引物的設(shè)計(jì)與合成用I^emier Primer 5. 0軟件，設(shè)計(jì)合成擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因和和 丹參管家基因延長因子l-α的引物，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，聚合酶鏈 式反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳后與非轉(zhuǎn)化對(duì)照丹參株系比較目標(biāo)片段的擴(kuò)增。(2)丹參總RNA的提取采用OMEGA公司的植物RNA提取試劑盒按照試劑盒說明書進(jìn)行(a)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所用的玻璃、金屬制品于210°C烘烤12小時(shí)以上，塑料制品用 體積分?jǐn)?shù)為0. 的DEPC水溶液于37°C浸泡12小時(shí)以上，121 滅菌，50°C烘干。電泳緩 沖液用體積分?jǐn)?shù)為0. 1% DEPC水溶液配制。研缽用氯仿潤洗后加入1/3體積的無水乙醇， 充分燃燒，并加液氮冷卻。(b)取_80°C保存的丹參葉片用液氮迅速研磨，取IOOmg加入500 μ L提取緩沖液，
劇烈震蕩。(c)室溫14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至Homogenization Spin Column,室溫14000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘；(d)將收集液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0. 5倍體積的無水乙醇(室溫)渦旋20 秒；(e)將全部混合液加入HiBind RNA Mini column中，室溫10000轉(zhuǎn)/分鐘離心1 分鐘；(f)棄掉收集管中的液體，HiBind RNA Mini column中加入400 μ LRNA洗脫液I， 室溫10000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘；(g)將柱子轉(zhuǎn)移至新的收集管中，加入500 μ L RNA洗脫液II，室溫10000轉(zhuǎn)/分鐘 離心1分鐘；(h)重復(fù)步驟(g)；(i)將收集管中的液體倒掉，柱子放回空收集管中，室溫10000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分 鐘；(j)將柱子轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中，在柱子膜的中間部位加50 μ L體積分?jǐn)?shù)為 0. 1 %的DEPC水溶液，室溫靜置2分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，洗脫獲得的RNA溶液， 用于DNA酶消化；(k) DNase 消化
在離心管中依次加入
總RNA50 μ g
IOXDNase I Buffer5 μ L
DNase I(RNase-free,5U/μ L)2μ L
RNase Inhibitor(40U/μ L)0. 5μ L
RNase Free H2O加至50 μ L
37°C恒溫培養(yǎng)箱中放置1. 5小時(shí)
(1)加入50 μ L的體積分?jǐn)?shù)為0.1 %的DEPC水溶液至100 μ L，加入25 μ L苯酚、
24yL氯仿和1 μ L異戊醇，充分混勻，4 0C 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘，取上層移至另一離心管中；(m)加入96 μ L氯仿和4 μ L異戊醇，混勻，4°C 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘，上層移
至另一離心管中；(η)加入10 μ L的!BmoL醋酸鈉水溶液(ρΗ為5. 2)，250 μ L的預(yù)冷的無水乙 醇，-20°C放置1小時(shí)以上(ο) 40C，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄上清，沉淀用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶 液洗兩次，4°C 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清；(ρ)沉淀干燥后，用體積分?jǐn)?shù)為0. 的DEPC水溶液溶解，電泳檢測(cè)，_80°C保存?zhèn)溆谩?3)cDNA第一鏈的合成cDNA第鏈的合成利用Takara公司Prim必cript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。在反應(yīng)管中依次加入下列溶液5XPrimeScript Buffer (forreal time)2μ LPrimeScript RT Enzyme Mix10. 5 μ LOligo dT Primer (50 μ Μ)0. 5 μ LRandom 6 mers (100 μ Μ)0. 5 μ LTotal RNA(Iyg)1 μ LRNasefreedH2O力口至 10 μ L將反應(yīng)混合液混勻，37°C孵育30分鐘，85°C反應(yīng)5秒，將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋 10倍，-20°c保存?zhèn)溆谩?4)半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色素生成 轉(zhuǎn)錄因子1基因的表達(dá)用非轉(zhuǎn)化丹參株系為對(duì)照，用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定擬南芥花青色 素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的表達(dá)量。半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°c、2分 鐘，94°C、30秒，51 °C、30秒，72 °C、25秒，30個(gè)循環(huán)。結(jié)果見圖2，在圖2中，第1泳道為非轉(zhuǎn) 化丹參株系，第2 6泳道為不同的轉(zhuǎn)基因株系，由圖2可見，在相同的丹參管家基因延長 因子l-α基因(SmEFl-α)表達(dá)水平下，相比非轉(zhuǎn)化對(duì)照丹參株系，3、5、6泳道的轉(zhuǎn)基因丹 參株系中均有擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的轉(zhuǎn)錄，表明所述的目的基因已在丹參 中超量表達(dá)。6、利用高效液相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因丹參株系中丹酚酸B的含量(1)高效液相色譜條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(a)高效液相色譜條件采用日本SHIMADZU公司LC-2010高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè) 器，LCsolution色譜工作站等)，色譜柱為Phenomenex硅膠基質(zhì)柱(5 μ m C18反向柱， 4. 6mmX250mm)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液、乙腈和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，流動(dòng)相 梯度洗脫程序?yàn)?. 01 5分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液體積由95%降為90%， 乙腈體積由5%升至10% ；5 25分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液體積由90%降為 67%，乙腈體積由10%升至30%，甲醇體積由0升至3% ； 25 40分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4% 的醋酸水溶液體積由67%降為60%，乙腈體積由30%升至35%，甲醇體積由3%升至5%;柱溫30°C，流速1. OmL/分鐘，檢測(cè)波長280nm，進(jìn)樣量20 μ L。(b)對(duì)照品溶液的制備配制標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品10. Omg,置IOmL容量瓶，加體積分?jǐn)?shù)為70% 的甲醇水溶液定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，4°C冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別取標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋成濃 度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。本發(fā)明中采用的流動(dòng)相梯度洗脫程序，丹酚酸B保留時(shí)間為32. 8分鐘，峰形良好， 可保證丹酚酸B與丹參中其它酚酸類成分的分離。(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線吸取丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品10、20、40、60、80、10(^1^分置于具塞試管中，依次加蒸餾水 使最終體積均為2. OmL,在相應(yīng)的色譜條件下進(jìn)樣，記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以丹酚酸B 峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行回歸分析，得到丹酚酸B的線性回歸方程為y = 5E-8x-0. 0134 (r2 = 0. 9997)式中χ表示樣品中丹酚酸B的峰面積，y表示丹酚酸B的濃度，單位mg/mL，r表示 相關(guān)系數(shù)。(3)樣品溶液的制備將丹參干燥根30°C烘至恒重，置于研缽中磨碎，精密稱取20mg粉末于離心管中， 加入1. 5mL體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇水溶液，以功率800W、頻率750Hz的超聲提取30分鐘， 將提取液轉(zhuǎn)入新的離心管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，上清經(jīng)0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后 進(jìn)樣分析，記錄各樣品中丹酚酸B峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算即得丹酚酸B的含量。用高效液相色譜測(cè)定轉(zhuǎn)基因丹參株系中丹酚酸B的含量，結(jié)果見圖3，由圖3可見， 在生長165天的轉(zhuǎn)基因的丹參干燥根中，丹酚酸B的含量高達(dá)73. 27mg/g，是同時(shí)期非轉(zhuǎn)化 普通丹參干燥根中丹酚酸B含量(36.98mg/g)的2. 0倍，高于《中華人民共和國藥典》(2010 年版)中規(guī)定的丹參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)施例用轉(zhuǎn)化擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的基因工程策略獲得了丹 酚酸B高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因丹參植株，用高效液相色譜法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因丹參中丹酚酸B的含量，為 規(guī)?；a(chǎn)丹酚酸B并最終解決丹參資源緊缺問題提供了一種理想方法。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于該方法由下述步驟組成(1)采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA全長；(2)把擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含有所述基因 的植物表達(dá)載體；(3)將擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，獲得用于轉(zhuǎn)化丹 參的含有所述植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4)用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化丹參，培養(yǎng)并獲得經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的轉(zhuǎn)基 因丹參植株；(5)半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄 因子1基因的表達(dá)；(6)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因丹參植株中丹酚酸B含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，篩選獲得丹酚 酸B含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因丹參植株。
2.按照權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA全長方法為設(shè)計(jì)可擴(kuò) 增出擬南芥擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因完整編碼框的引物，并在上游和下游引物 上分別引入BglII和BstEII限制性酶切位點(diǎn)，上游引物為5，-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAA GG-3，，下游引物為 5，-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3，，以擬南芥 cDNA 為模板， 經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，回收連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，測(cè) 序驗(yàn)證并得到所述基因的cDNA編碼序列。
3.按照權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 把擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含有所述基因的植物表 達(dá)載體的方法為用BglII和BstEII雙酶切所述的擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的 pGEM T-easy載體和pCAMBIA1302植物表達(dá)載體，回收連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)和酶切驗(yàn)證，得到含有所述基因的植物表達(dá)載體。
4.按照權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 將擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化丹參的含有所述植 物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株的方法為將所述的含擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因 的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿EHA105，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證，獲得含有所述植物表達(dá) 載體的根癌農(nóng)桿菌菌株。
5.按照權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因丹參植株為用所述的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化丹參葉片，置 于由MS培養(yǎng)基、4. 4μ M ΒΑΡ、0. 5μΜ NAA、200mg/L頭孢霉素、5mg/L潮霉素組成的固體培養(yǎng) 基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，長出抗性芽后將其轉(zhuǎn)入附加5mg/L潮霉素的V2MS培養(yǎng)基上生根，獲得 潮霉素抗性的再生丹參植株，用擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的特異性檢測(cè)引物聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增再生丹參植株DNA，紫外線下觀察到747bp目的條帶的陽性株系即為轉(zhuǎn) 基因丹參植株。
6.按照權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參植株中擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基 因的表達(dá)方法為用擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因和丹參管家基因延長因子1-α的檢測(cè)引物，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，用相對(duì)定量法分析擬南芥花青色素 生成轉(zhuǎn)錄因子1基因相對(duì)表達(dá)量。
7.按照權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因丹參植株中丹酚酸B含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定方法為用Wienomenex 硅膠基質(zhì)C18反向色譜柱，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液、乙腈和甲醇為流動(dòng)相梯度洗 脫，流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?. 01 5分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液體積由95%降 為90%，乙腈體積由5%升至10% ;5 25分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%的醋酸水溶液體積由 90 %降為67 %，乙腈體積由10 %升至30 %，甲醇體積由0升至3 % ；25 40分鐘，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 4%的醋酸水溶液體積由67%降為60%，乙腈體積由30%升至35%，甲醇體積由3% 升至5 % ；柱溫30°C，流速1. OmL/分鐘，檢測(cè)波長^Onm，進(jìn)樣量20 μ L，丹酚酸B的含量根 據(jù)其峰面積由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 y = 5E-8x-0. 0134 (r2 = 0. 9997)進(jìn)行計(jì)算，式中χ表示樣品中丹酚酸B的峰面積，y表示丹酚酸B的濃度，單位mg/mL， r表示相關(guān)系數(shù)。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，由下述步驟組成采用基因克隆獲得擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的cDNA全長；構(gòu)建含有所述基因的植物表達(dá)載體；將上述載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，獲得含所述基因的根癌農(nóng)桿菌菌株；用根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化丹參，培養(yǎng)并獲得經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因丹參植株；半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參中擬南芥花青色素生成轉(zhuǎn)錄因子1基因的表達(dá)；對(duì)所述基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因丹參中丹酚酸B含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，篩選得到丹酚酸B含量提高的轉(zhuǎn)基因丹參植株。采用本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因丹參植株，生長165天的干燥根中，丹酚酸B的含量高達(dá)73.27mg/g，是非轉(zhuǎn)化普通丹參干燥根中丹酚酸B含量的2倍。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102061297SQ20101024582
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者張媛, 王喆之 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)