專利名稱：對(duì)dna目標(biāo)序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。具體來說，涉及一種基于單脫堿基熒光探針與內(nèi)切酶IV的放大體系，利用該放大體系實(shí)現(xiàn)高選擇性、高靈敏度的低豐度基因突變檢測(cè)。
背景技術(shù)：
基因突變與人類的癌癥密切相關(guān)，一些重要的突變可以作為癌癥診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物，所以基因突變的檢測(cè)有著重大的臨床意義。但是，由于腫瘤處在不同時(shí)期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞融合等因素的影響，基因突變通常表現(xiàn)為低豐度。 因而要求檢測(cè)方法既具有高靈敏度(檢測(cè)到很低的絕對(duì)量)，又要具有高選擇性(在眾多野生型鏈中選出突變鏈)。最常用的檢測(cè)基因突變的方法是測(cè)序，包括Sanger sequencing和 Pyrosequencing，測(cè)序方法能夠提供具體的序列組成，但是該方法的選擇性不夠，檢測(cè)限只能達(dá)到5% -20%，而且，樣品的前處理過程非常繁瑣復(fù)雜。基于PCR的序列特異性熒光探針法(實(shí)時(shí)熒光PCR)克服了檢測(cè)限低的問題，兼具高靈敏度和高選擇性，但是PCR過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)對(duì)探針的設(shè)計(jì)有很多限制性要求，包括探針3’末端不能與引物配對(duì)，探針與引物的距離受一定限制等等。近年來，發(fā)展了一些基于序列特異性探針的信號(hào)放大方法。主要包括限制性內(nèi)切酶放大體系和外切酶III信號(hào)放大體系。這兩種方法都具有很高的靈敏度，能夠檢測(cè)到 Ifmol的匹配DNA序列。但是它們也有一些缺陷限制性內(nèi)切酶放大體系由于使用的是限制性內(nèi)切酶，因而對(duì)待測(cè)目標(biāo)鏈有一定的序列要求，從而大大限制了該方法在實(shí)際中的應(yīng)用范圍。而外切酶III放大體系中的外切酶III無法在較高溫度(50°C以上)工作，體系的檢測(cè)溫度低于錯(cuò)配與匹配雙鏈的熔解溫度，從而使探針的區(qū)分能力大大喪失。因此，迫切需要開發(fā)出能選擇性放大突變信號(hào)的放大體系，用于高選擇性、高靈敏度的低豐度突變檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是建立一種可選擇性放大突變信號(hào)的放大體系，實(shí)現(xiàn)高選擇性、高靈敏度的低豐度基因突變檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案是，利用單脫堿基探針的區(qū)分作用，結(jié)合內(nèi)切酶IV的切割，達(dá)到信號(hào)放大的目的，從而檢測(cè)DNA目標(biāo)序列，尤其是含有特異性位點(diǎn)(如突變位點(diǎn))的目標(biāo)序列。在本發(fā)明的一方面，提供了一種對(duì)DNA目標(biāo)序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，包括如下步驟1)制備單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針，該探針為單鏈DNA，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，除脫堿基位點(diǎn)外，其序列與DNA目標(biāo)序列完全匹配，脫堿基位點(diǎn)距離探針5’末端和3’末端5個(gè)核苷酸殘基以上；2)將所述探針與待測(cè)體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV，在47-60°C的檢測(cè)溫度下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定，在檢測(cè)溫度下，探針與目標(biāo)序列特異性結(jié)合，所形成的雙鏈空位被內(nèi)切酶 IV識(shí)別并切割，切割后的探針?biāo)槠瑥哪繕?biāo)序列上解離下來，發(fā)出熒光，而釋放出的目標(biāo)序列繼續(xù)與另一個(gè)探針特異性結(jié)合，重復(fù)上述過程，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的信號(hào)放大和檢測(cè)，所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度越高表明待測(cè)體系中目標(biāo)序列的含量越高，其中，所述檢測(cè)溫度低于探針與目標(biāo)序列形成的雙鏈的熔解溫度，但高于探針與待測(cè)體系中其他序列形成的雙鏈的熔解溫度。本發(fā)明的探針是單脫堿基DNA探針，可以通過化學(xué)合成法直接制備得到單一位點(diǎn)脫堿基(嘌呤或嘧啶)的DNA單鏈，也可以通過其他途徑獲得，例如先制備含有單一尿嘧啶(U)脫氧核苷酸位點(diǎn)的雙標(biāo)記熒光探針，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶(toacil DNA-glycosylase, UDG)處理，切除尿嘧啶堿基，剩下脫氧核糖殘基，得到單脫堿基探針 (AP-probe)。上述方法所檢測(cè)的DNA目標(biāo)序列通常是指具有特異性位點(diǎn)(如突變位點(diǎn))的DNA 序列，下面以基因突變的檢測(cè)為例說明本發(fā)明的原理。在基因突變的檢測(cè)中，除脫堿基位點(diǎn)外，單脫堿基探針序列與突變體完全匹配，因此，與野生鏈有一個(gè)或多個(gè)堿基(針對(duì)單突變或多突變位點(diǎn))是錯(cuò)配的。由于錯(cuò)配的影響， 探針與突變鏈形成的匹配雙鏈(perfect-match duplex, PM)的熔解溫度(記作Tpm)比探針與野生鏈形成的錯(cuò)配雙鏈(mismatch duplex,MM)的熔解溫度(記作Tmm)高。于是，當(dāng)把檢測(cè)溫度(記作T)升至兩熔解溫度之間時(shí)，即Tmm < T < TPM，探針與野生鏈形成的雙鏈無法穩(wěn)定存在而解鏈，探針卻可以在該溫度下特異性地結(jié)合突變鏈?？紤]到區(qū)分能力和非特異性結(jié)合，探針的長(zhǎng)度一般設(shè)置為20-30核苷酸殘基，相應(yīng)的檢測(cè)溫度一般會(huì)在50-60°C。內(nèi)切酶IV是一種脫嘌呤/嘧啶(AP)核酸內(nèi)切酶，水解DNA上的完整AP位點(diǎn)，切割 5’端與AP位點(diǎn)相連的第一個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3’羥基和5’脫氧核糖磷酸末端。內(nèi)切酶IV 的推薦工作溫度為37°C，所以必須要探究酶在較高溫度(50-60°C)下是否具有活性。通過測(cè)試本發(fā)明的信號(hào)放大體系在47-60°C之間能否實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，證實(shí)內(nèi)切酶IV在47-56°C 之間具有很高的活性，60°C時(shí)具有一定的活性。因此，本發(fā)明的放大體系在47-60°C之間都能正常工作。在合適的溫度下，單脫堿基探針選擇性地與突變鏈雜交，形成雙鏈空位。內(nèi)切酶IV 具有切割雙鏈空位的性質(zhì)，并且其切割速率遠(yuǎn)大于切割單鏈空位的速率。因此，探針與突變鏈形成的雙鏈空位被內(nèi)切酶IV識(shí)別并切割。切割后的探針?biāo)槠捎陂L(zhǎng)度較短，無法在檢測(cè)溫度下與目標(biāo)鏈結(jié)合，于是從目標(biāo)鏈上解離下來。解離前，完整探針兩端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而處于猝滅狀態(tài)，解離后，兩基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光基團(tuán)不再被猝滅，從而發(fā)出熒光信號(hào)。同時(shí)，解離釋放出的目標(biāo)鏈可以繼續(xù)與另一個(gè)單脫堿基探針結(jié)合，重復(fù)上述過程，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大?？捎糜诒景l(fā)明的熒光基團(tuán)及其猝滅基團(tuán)應(yīng)當(dāng)滿足熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與猝滅基團(tuán)的吸收光譜有效重疊，從而發(fā)生高效率的FRET。常見的包括FAM與TAMRA ；FAM與BHQl ； TET與BHQ2等等。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種對(duì)DNA目標(biāo)序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，在一定檢測(cè)溫度下，利用內(nèi)切酶IV對(duì)特異性結(jié)合于DNA目標(biāo)序列上的單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針進(jìn)行切割，使探針?biāo)槠瑥哪繕?biāo)序列上解離下來，產(chǎn)生熒光信號(hào)，同時(shí)，解離后的目標(biāo)序列可以與另一個(gè)單脫堿基探針結(jié)合，重復(fù)上述過程，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的信號(hào)放大和檢測(cè)；該試劑盒包括單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針和內(nèi)切酶IV，其中所述探針為DNA單鏈，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，除脫堿基位點(diǎn)外，其序列與DNA 目標(biāo)序列完全匹配，脫堿基位點(diǎn)距離探針5’末端和3’末端5個(gè)核苷酸殘基以上。進(jìn)一步的，所述探針長(zhǎng)度一般設(shè)置為20-30核苷酸殘基。所述探針上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選自常用的FRET基團(tuán)對(duì)，如熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQl，熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)TAMRA，熒光基團(tuán)TET和猝滅基團(tuán)BHQ2。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明在檢測(cè)低豐度基因突變上具有一些顯著的優(yōu)點(diǎn)(1).普適性，由于內(nèi)切酶IV的識(shí)別位點(diǎn)僅僅是雙鏈空位，且空位的位置可以根據(jù)所要測(cè)定的目標(biāo)序列靈活的設(shè)計(jì)空位被切割后形成的兩個(gè)碎片短鏈的熔解溫度比完整單脫堿基探針的熔解溫度低10°c以上就可以達(dá)到較好的放大效果。一般而言，空位位置與探針5’末端和3’末端相距5個(gè)堿基以上可以滿足要求。所以，該信號(hào)放大和檢測(cè)方法可以適用于任何目標(biāo)序列。(2).高選擇性，內(nèi)切酶IV耐熱性使反應(yīng)體系能夠在相對(duì)高溫下工作，從而有效利用了錯(cuò)配熔解溫度差異的性質(zhì)，同時(shí)，一個(gè)目標(biāo)鏈與多個(gè)探針結(jié)合，實(shí)際上是進(jìn)行了多次選擇，選擇性也得到了放大，從而實(shí)現(xiàn)了超高選擇性的檢測(cè)，選擇性比其他信號(hào)放大方法高出
一個(gè)數(shù)量級(jí)。(3).低檢測(cè)限，由于在檢測(cè)過程中，一個(gè)目標(biāo)鏈與多個(gè)探針循環(huán)發(fā)生結(jié)合-切割-解離的過程，發(fā)出多個(gè)探針的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)鏈信號(hào)的放大，所以用本發(fā)明方法檢測(cè)低豐度突變，能夠檢測(cè)到低至的突變體，比其他PCR后檢測(cè)方法的檢測(cè)限都要低。(4).聯(lián)用性，本發(fā)明方法可以方便的與PCR聯(lián)用，包括選擇性PCR如AS-PCR， C0LD-PCR，實(shí)現(xiàn)更靈敏的檢測(cè)。與其他方法相比，聯(lián)用只需要加入相關(guān)的酶和探針，操作簡(jiǎn)單易行。


圖1是應(yīng)用本發(fā)明對(duì)DNA目標(biāo)鏈進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的原理示意圖。圖2是實(shí)施例1對(duì)低濃度DNA目標(biāo)序列進(jìn)行檢測(cè)的熒光值變化曲線。圖3是應(yīng)用本發(fā)明對(duì)低豐度突變進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的原理示意圖。圖4是實(shí)施例2對(duì)低豐度突變進(jìn)行檢測(cè)的熒光值變化曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，通過具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1<低濃度匹配DNA序列檢測(cè)>在該實(shí)施例中，目標(biāo)物為完全匹配的DNA單鏈，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置一系列DNA單鏈的濃度梯度，希望能檢測(cè)到盡可能少的目標(biāo)鏈。檢測(cè)原理參見圖1，具體步驟如下1.使用UDG酶處理含有尿嘧啶脫氧核苷酸殘基的雙標(biāo)記熒光探針，得到單脫堿基探針；2.將得到的單脫堿基探針與不同濃度的目標(biāo)DNA序列混合，然后加入內(nèi)切酶IV， 迅速測(cè)定混合溶液內(nèi)切酶IV熒光值隨時(shí)間的變化。在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)的探針序列如下5，-FAM-TCGTCTCCACUGAAACATACTCCATAA-TAMRA-3，(SEQ ID No. 1)目標(biāo)序列堿基組成如下5’-GTTTTAAATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3，(SEQ ID No. 2)不同濃度目標(biāo)序列的50 μ L反應(yīng)體系中探針量5pmol ；目標(biāo)序列量5pmol， Ipmol，0· lpmol，IOfmol，Ifmol ；各反應(yīng)體系中加入IU的內(nèi)切酶IV?？瞻讓?duì)照體系探針5pmol，目標(biāo)序列量0。熱程序53°C 900s,每k測(cè)定一次熒光值。熒光測(cè)定儀器為實(shí)時(shí)熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測(cè)時(shí)檢測(cè)器的靈敏度(gain level)為7. 33。檢測(cè)結(jié)果熒光值變化曲線如圖2所示，在反應(yīng)前100s，熒光值隨著時(shí)間逐漸增大，7min后，目標(biāo)序列量多于Ipmol的反應(yīng)體系中，熒光值達(dá)到平臺(tái)。實(shí)施例2<低豐度突變檢測(cè)>在該實(shí)施例中，待測(cè)體系為野生鏈、突變鏈的混合體系，兩種鏈的總量為5pmol，但設(shè)置一系列不同的突變比例，希望能檢測(cè)到盡可能低的突變比例。檢測(cè)原理參見圖3，具體實(shí)施步驟如下1.制備單脫堿基探針，方法同實(shí)施例1中步驟1 ；2.分別測(cè)定單脫堿基探針與野生鏈、突變鏈形成的雙鏈的熔解溫度，確定合適的檢測(cè)溫度；3.將單脫堿基探針與含有不同比例突變鏈的混合目標(biāo)體系混合，加入內(nèi)切酶IV， 迅速升溫至步驟2中確定的檢測(cè)溫度，測(cè)定熒光值隨時(shí)間的變化。在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)的探針序列如下5，-FAM-TCTCCACf/GA A ACATACTCCA-BHQ1-3，(SEQ ID No. 3)突變鏈序列組成如下5' -GTTTTAAATTATGGAGTATGT T TCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3 ‘ (SEQ ID No. 4)野生鏈序列組成如下5' -GTTTTAAATTATGGAGTATGT G TCTGTGGAGACGAGAGTAAG-3 ‘ (SEQ ID No. 5)(黑體下劃線標(biāo)記的是突變堿基的位置)不同比例突變體的50 μ L反應(yīng)體系探針量5pmol ；突變比例100%，10%，5%， 2. 5%，1%，混合鏈總量均為5pmol ；各反應(yīng)體系中加入IU的內(nèi)切酶IV?？瞻讓?duì)照組探針量5pmol ；突變比例0%。熱程序52. 50C 600s,每k測(cè)定一次熒光值。熒光測(cè)定儀器為實(shí)時(shí)熒光PCR儀rotor-gene 6000，檢測(cè)時(shí)檢測(cè)器的靈敏度(gain level)為6. 77。檢測(cè)結(jié)果熒光值變化曲線如圖4所示，熒光值隨著時(shí)間逐漸增大，突變體含量 100 %的體系中，熒光值迅速達(dá)到平臺(tái)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)DNA目標(biāo)序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，包括如下步驟1)制備單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針，該探針為單鏈DNA，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，除脫堿基位點(diǎn)外，其序列與DNA目標(biāo)序列完全匹配，脫堿基位點(diǎn)距離探針5’末端和3’末端5個(gè)核苷酸殘基以上；2)將所述探針與待測(cè)體系混合，然后加入內(nèi)切酶IV，在47-60°C的檢測(cè)溫度下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定，在檢測(cè)溫度下，探針與目標(biāo)序列特異性結(jié)合，所形成的雙鏈空位被內(nèi)切酶IV 識(shí)別并切割，切割后的探針?biāo)槠瑥哪繕?biāo)序列上解離下來，發(fā)出熒光，而釋放出的目標(biāo)序列繼續(xù)與另一個(gè)探針特異性結(jié)合，重復(fù)上述過程，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的信號(hào)放大和檢測(cè)，所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度越高表明待測(cè)體系中目標(biāo)序列的含量越高，其中，所述檢測(cè)溫度低于探針與目標(biāo)序列形成的雙鏈的熔解溫度，但高于探針與待測(cè)體系中其他序列形成的雙鏈的熔解溫度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)通過化學(xué)合成法制備所述單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)先制備含有單一尿嘧啶脫氧核苷酸位點(diǎn)的雙標(biāo)記熒光探針，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶對(duì)其進(jìn)行處理，切除尿嘧啶堿基，得到單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA目標(biāo)序列是指含有突變位點(diǎn)的DNA 序列。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針長(zhǎng)度為20-30核苷酸殘基。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)是下列基團(tuán)對(duì)之一 =FAM 和 TAMRA，F(xiàn)AM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
7.—種對(duì)DNA目標(biāo)序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的試劑盒，在一定檢測(cè)溫度下，利用內(nèi)切酶IV對(duì)特異性結(jié)合于DNA目標(biāo)序列上的單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針進(jìn)行切割，使探針?biāo)槠瑥哪繕?biāo)序列上解離下來，產(chǎn)生熒光信號(hào)，同時(shí)，解離釋放出的目標(biāo)序列繼續(xù)與另一個(gè)探針特異性結(jié)合，重復(fù)上述過程，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的信號(hào)放大和檢測(cè)；該試劑盒包括單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針和內(nèi)切酶IV，其中所述探針為DNA單鏈，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，除脫堿基位點(diǎn)外，其序列與DNA目標(biāo)序列完全匹配，脫堿基位點(diǎn)距離探針5’末端和 3’末端5個(gè)核苷酸殘基以上。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述探針長(zhǎng)度為20-30核苷酸殘基。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)是下列基團(tuán)對(duì)之一 FAM 和 TAMRA，F(xiàn)AM 和 BHQl，或者 TET 和 BHQ2。
10.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA目標(biāo)序列是指含有突變位點(diǎn)的 DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)DNA目標(biāo)序列進(jìn)行信號(hào)放大和檢測(cè)的方法，制備單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針，該探針一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，除脫堿基位點(diǎn)外，其序列與DNA目標(biāo)序列完全匹配；在一定檢測(cè)溫度下，該探針與目標(biāo)序列特異性結(jié)合形成雙鏈空位，利用內(nèi)切酶IV識(shí)別并切割該雙鏈空位，切割后的探針?biāo)槠瑥哪繕?biāo)序列上解離下來，產(chǎn)生熒光信號(hào)，而解離釋放出的目標(biāo)序列可以繼續(xù)與另一個(gè)探針結(jié)合，重復(fù)上述過程，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的信號(hào)放大和檢測(cè)。本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)高選擇性、高靈敏度的低豐度基因突變檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102296116SQ20111025911
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者宋晨, 張晨, 肖先金, 蘇昕, 趙美萍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)