一種生態(tài)安全型轉(zhuǎn)基因熒光觀賞魚(yú)的研制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因重組載體、構(gòu)建方法、應(yīng)用。特別是一種熒光蛋白表達(dá)載體與一種 性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體，以及載體在培育生態(tài)安全型轉(zhuǎn)基因熒光觀賞魚(yú)中的應(yīng)用。 屬于基因工程、觀賞魚(yú)分子育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 如今養(yǎng)殖熒光觀賞魚(yú)在全球范圍內(nèi)形成了規(guī)模巨大的產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)。熒光觀賞魚(yú)有別 于傳統(tǒng)意義的觀賞魚(yú)類，其是在一定波長(zhǎng)光線照射的情況下，通過(guò)自身攜帶的熒光蛋白發(fā) 出不同熒光的人工培育觀賞魚(yú)品種。熒光觀賞魚(yú)具有更高的觀賞價(jià)值與試驗(yàn)研究?jī)r(jià)值。例 如全腎表達(dá)綠色熒光蛋白斑馬魚(yú)品系應(yīng)用于斑馬魚(yú)原腎功能的研究，利用綠色熒光蛋白在 活體魚(yú)中的表達(dá)可以隨時(shí)觀察在任何時(shí)期的原腎綠色熒光蛋白表達(dá)特征，可以滿足對(duì)斑馬 魚(yú)原腎功能研究的整體性與完整性要求。
[0003] 在熒光觀賞魚(yú)研究上，美國(guó)最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。其GloFish熒光斑馬魚(yú)在美國(guó) 境內(nèi)（除了加州外）已經(jīng)上市。幾乎同時(shí)，臺(tái)灣臺(tái)港科技推出了 TK系列熒光觀賞斑馬魚(yú)和 青鏘魚(yú)。目前的熒光觀賞魚(yú)由于性腺中存在轉(zhuǎn)基因成分，觀賞魚(yú)后代可以繁育并傳遞轉(zhuǎn)基 因元件，因此存在著一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是利用轉(zhuǎn)基因分子動(dòng)物育種技術(shù)構(gòu)建表達(dá)不同熒光蛋白的載體，同 時(shí)構(gòu)建出性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體。并將兩種表達(dá)載體應(yīng)用于培育轉(zhuǎn)基因熒光觀賞魚(yú) 品系。進(jìn)而，對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)基因熒光觀賞魚(yú)品系進(jìn)行誘導(dǎo)處理，除去熒光魚(yú)性腺中的轉(zhuǎn)基因 成分，以達(dá)到觀賞魚(yú)后代回歸野生型的目的，保證生態(tài)安全。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明分別提供一種熒光蛋白表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，該表達(dá) 載體在培育轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)品系中的應(yīng)用；一種性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體及其構(gòu)建方 法，該表達(dá)載體在培育轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)品系中的應(yīng)用；兩種載體在培育生態(tài)安全型轉(zhuǎn)基因熒 光觀賞魚(yú)中的應(yīng)用。各技術(shù)方案分別如下：
[0006] 一種熒光蛋白表達(dá)載體，其特征在于：是以全身性表達(dá)啟動(dòng)子CMV或PGK或SV40， 驅(qū)動(dòng)焚光蛋白eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、 mKate2、Kaede及其衍生物的任一表達(dá)，并且兩端帶有轉(zhuǎn)座子I-Scel和LoxP位點(diǎn)的質(zhì)粒 載體；熒光蛋白表達(dá)載體名稱為pIScel-LoxP-CMV-R，其中R是熒光蛋白eEBFP2、eCFP、 SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede及其衍生物的 任一。
[0007] 上述熒光蛋白表達(dá)載體中，熒光蛋白衍生物是不同顏色熒光蛋白經(jīng)堿基突變修飾 后，改良熒光性能的一類衍生物質(zhì)，采用FP表示。
[0008] 在優(yōu)先條件下，上述熒光蛋白表達(dá)載體的全身性表達(dá)啟動(dòng)子是CMV;上述熒光 蛋白表達(dá)載體的熒光蛋白是eCFP或eGFP或mCherry，分別是藍(lán)色熒光蛋白表達(dá)載體 pIScel-LoxP-CMV-eCFP、綠色熒光蛋白表達(dá)載體pIScel-LoxP-CMV-eGFP、紅色熒光蛋白表 達(dá)載體pIScel-LoxP-CMV-mCherry。三種馬魚(yú)熒光蛋白表達(dá)載體序列分別是：
[0009] 熒光蛋白表達(dá)載體 pIScel-LoxP-CMV-eCFP 序列如 SEQ ID NO. 1 ;
[0010] 熒光蛋白表達(dá)載體 pIScel-LoxP-CMV-eGFP 序列如 SEQ ID NO. 2 ;
[0011] 焚光蛋白表達(dá)載體 pIScel-LoxP-CMV-mCherry 序列如 SEQ ID NO. 3。
[0012] 熒光蛋白表達(dá)載體pIScel-LoxP-CMV-R的構(gòu)建方法，是以pIScel質(zhì)粒載體為出發(fā) 載體，構(gòu)建兩端帶有轉(zhuǎn)座子I-Scel和LoxP的熒光蛋白載體，其中導(dǎo)入載體的熒光蛋白分 別是eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、 Kaede及其衍生物的任一，所用到的啟動(dòng)子是在魚(yú)類全發(fā)育期以及所有組織中進(jìn)行穩(wěn)定驅(qū) 動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子CMV或PGK或SV40。在優(yōu)選條件下采用啟動(dòng)子CMV，其具體技術(shù)方案如下：
[0013] 熒光蛋白表達(dá)載體pIScel-LoxP-CMV-R構(gòu)建方法，依如下方法實(shí)施：
[0014] 制備插入片段：PCR 擴(kuò)增 CMV-R-SV40 片段，其中 R 是 eEBFP2、eCFP、SCFP3A、 eGFP、mNeonGreen、EYFP、mOrange、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede 及其衍生物的任一，在 CMV-R-SV40片段兩端引入LoxP序列，得到PCR產(chǎn)物，通過(guò)Kpnl與SacI雙酶切PCR產(chǎn)物，回 收得到插入片段；
[0015] 制備載體骨架：質(zhì)粒載體 pIScel-CMV-R，其中 R 是 eEBFP2、eCFP、SCFP3A、eGFP、 mNeonGreen、EYFP、m0range、TagRFP、mCherry、mKate2、Kaede 及其衍生物的任一；通過(guò) Kpnl 與SacI雙酶切質(zhì)粒載體pIScel-CMV-R，回收得到載體骨架；
[0016] 制備載體pIScel-LoxP-CMV-R:將插入片段連接入載體骨架，所得產(chǎn)物為載體 pISceI-LoxP-CMV-R〇
[0017] 上述熒光蛋白表達(dá)載體在培育熒光蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)品系中的應(yīng)用。具 體是，采用顯微注射法，分別將任一熒光蛋白表達(dá)載體pIScel-LoxP-CMV-R與I-Scel酶 注射入觀賞魚(yú)單細(xì)胞受精卵，選育得到表達(dá)熒光蛋白轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)品系。所得表達(dá)熒 光蛋白轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)品系分別對(duì)應(yīng)是Tg(CMV-eCFP)、Tg(CMV-eGFP)、Tg(CMV-mCherry)、 Tg(CMV-eEBFP2)、Tg(CMV-SCFP3A)、Tg(CMV-mNeonGreen)、Tg(CMV-EYFP)、 Tg(CMV-mOrange)、Tg(CMV-TagRFP)、Tg(CMV-mKate2)、Tg (CMV-Kaede)、Tg (CMV-FP)〇
[0018] 上述培育熒光蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)品系的方法中，選育過(guò)程采用常規(guī) 方法進(jìn)行。一般是，將獲得的任一熒光觀賞魚(yú)親本Tg (CMV-eCFP)、Tg (CMV-eGFP)、 Tg(CMV-mCherry)、 Tg(CMV-eEBFP2)、 Tg(CMV-SCFP3A)、 Tg(CMV-mNeonGreen)、 Tg(CMV-EYFP)、Tg (CMV-mOrange)、Tg (CMV-TagRFP)、Tg(CMV-mKate2)、Tg (CMV-Kaede)或 Tg(CMV-FP)的F0與野生型觀賞魚(yú)測(cè)交，產(chǎn)生熒光觀賞魚(yú)的雜合體Fl，從雜合體FI中篩選 出全身表達(dá)熒光蛋白的雜合體觀賞魚(yú)；選取單只全身表達(dá)熒光蛋白的雜合體F1與野生型 魚(yú)測(cè)交，產(chǎn)生熒光觀賞魚(yú)的雜合體F2,從雜合體F2中篩選出全身表達(dá)熒光蛋白的雌魚(yú)和雄 魚(yú)；將篩選出的所述雌魚(yú)和雄魚(yú)進(jìn)行雜交，得到熒光觀賞魚(yú)的F3,選取全身表達(dá)熒光蛋白 的F3與野生型觀賞魚(yú)進(jìn)行測(cè)交，得到F4,若其中F4全部為發(fā)熒光觀賞魚(yú)，則此魚(yú)的親本即 為純合體熒光蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)基因觀賞魚(yú)。
[0019] -種性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體，其特征在于：是觀賞魚(yú)性腺特異性啟動(dòng)子 kop或vasa或nanosl 3'UTR驅(qū)動(dòng)rtTA的表達(dá)，rtTA與四環(huán)素結(jié)合后，驅(qū)動(dòng)TRE啟動(dòng)子啟 動(dòng)下游Cre蛋白表達(dá)的質(zhì)粒載體；性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體名稱為pIScel-LoxP-Q. rtTA-TRE. Cre，其中 Q 是 kop 或 vasa 或 nanosl 3, UTR〇
[0020] 在優(yōu)選條件下，上述性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體的啟動(dòng)子是kop，性腺組織特異 性調(diào)控表達(dá)載體命名為pIScel-LoxP-kop. rtTA-TRE. Cre，其序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0021] 上述性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于：是將性腺特異性啟 動(dòng)子kop或vasa或nanosl 3' UTR串聯(lián)Tet-〇n系統(tǒng)的rtTA以及TRE啟動(dòng)子和Cre后導(dǎo)入 pIScel-LoxP-CMV-eGFP載體中，替換載體pIScel-LoxP-CMV-eGFP兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的原 件，構(gòu)建出性腺組織特異啟動(dòng)子kop或vasa或nanosl 3' UTR調(diào)控下的tet-on表達(dá)系統(tǒng)。 其具體技術(shù)方案如下：
[0022] 一種性腺組織特異性調(diào)控表達(dá)載體的構(gòu)建方法，依如下步驟實(shí)施：
[0023] 制備中間質(zhì)粒載體插入片段：PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pT2[kop:Cre-UTRnos，CMV:eGFP]的 Cre:UTRnos序列，通過(guò)Notl與PstI雙酶切PCR產(chǎn)物，回收得到插入片段；
[0024] 制備中間質(zhì)粒載體骨架：通過(guò)Notl與PstI雙酶切質(zhì)粒載體pT2-TRE. SB11-SV40. rtTA，回收得到載體骨架；
[0025] 制備中間質(zhì)粒載體：中間質(zhì)粒載體插入片段連接到中間質(zhì)粒載體骨架上，得到中