專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)熒光時(shí)實(shí)定量pcr建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)作物病害傳播菌的分子診斷技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
由于轉(zhuǎn)基因作物被導(dǎo)入人們所需要的特異性性狀，如使作物具有抗蟲(chóng)抗病的能力，提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，因此轉(zhuǎn)基因作物對(duì)于糧食生產(chǎn)具有重大的意義。而轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境生物是否構(gòu)成安全威脅，如轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的影響一直為人們所關(guān)注。但是，目前國(guó)內(nèi)外這方面報(bào)道較少。
鐮刀菌屬(Fusarium. sp)是土壤真菌的主要類(lèi)群。有50多個(gè)菌種，鐮刀菌可以侵染寄主植物的維管束系統(tǒng)和器官，從而引起植物萎蔫和根、莖、葉及果實(shí)腐爛等癥狀，因此該屬真菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物萎蔫病和根腐病的主要病原菌。其中，在谷類(lèi)作物、玉米穗端及莖根部的赤霉病有幾種鐮刀菌所引起。主要引起赤霉病的鐮刀菌，為禾谷鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、黃色鐮刀菌，此外，梨孢鐮刀菌、三線(xiàn)鐮刀菌、木賊鐮刀菌也較普遍。在我國(guó)，鐮刀菌對(duì)作物的危害很大，嚴(yán)重影響了作物質(zhì)量與產(chǎn)量，小麥赤霉病、小麥根腐病和玉米莖腐病就是典型的土傳鐮刀菌病害。
土壤中鐮刀菌的研究多采用稀釋平板法等傳統(tǒng)研究手段，然而傳統(tǒng)方法的局限性導(dǎo)致其無(wú)法全面反映自然條件下土壤鐮刀菌數(shù)量的分布，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏差。近年來(lái)，實(shí)時(shí)焚光定量PCR(Real-Time quantitative polymerase chain reaction，Real-Time QPCR) 技術(shù)的提出，為植物病菌檢測(cè)提供了全新的方法，和普通PCR方法相比，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、成本低、操作方便和直觀等優(yōu)點(diǎn)，它可以通過(guò)檢測(cè)病原菌目的序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)解析的目的。
目前，已有研究者選擇STOR GreenI和Eva Green等熒光染料對(duì)環(huán)境樣品中的鐮刀菌屬進(jìn)行絕對(duì)定量分析，然而對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥根際土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)的Real-Time QPCR 檢測(cè)體系建立及應(yīng)用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥根際土壤中鐮刀菌含量的絕對(duì)定量方法進(jìn)行了研究，旨在建立轉(zhuǎn)基因小麥根際土壤中鐮刀菌屬拷貝數(shù)定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法， 進(jìn)而研究轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)根際土壤微生物變化規(guī)律，進(jìn)而為后續(xù)對(duì)小麥各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期檢測(cè)做準(zhǔn)備工作。
近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的提出，為植物病菌檢測(cè)提供了全新的方法，和普通PCR方法相比，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、成本低、操作方便和直觀等優(yōu)點(diǎn)，它可以通過(guò)檢測(cè)病原菌目的序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)解析的目的
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種通過(guò)熒光時(shí)實(shí)定量PCR建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌(Fusarium. sp)拷貝數(shù)的方法，其特征在于
a)在田間建立對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)采樣取土點(diǎn)并標(biāo)記定位，將播種前的各點(diǎn)采集的土壤樣本為空白對(duì)照，田間播種轉(zhuǎn)基因小麥，在轉(zhuǎn)基因小麥的生育期中的苗期、返青期、拔節(jié)期、灌漿期、成熟期內(nèi)分別在上述各采樣取土點(diǎn)采集根際土壤樣本，每次在每個(gè)采樣取土點(diǎn)做四個(gè)重復(fù)；
b)將各采樣取土點(diǎn)采集的土壤樣本、根際土壤樣本通過(guò)UltraClean soilDNA Isolation Kit試劑盒分別提取樣本的總DNA，并將樣本的總DNA溶于ddH20中，以鐮刀菌特異性通用引物對(duì)SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3對(duì)每個(gè)時(shí)期的樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小在418bp的特異性片段；由熒光定量PCR儀根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)直接測(cè)出土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)；
c)將不同時(shí)期土壤樣本中鐮刀菌拷貝數(shù)匯總，形成轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根系土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)。
在本發(fā)明中所述的特異性片段測(cè)序?yàn)镾EQ ID No. 1;所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y1 =-3. 203X1+36. 956，R2 = 0. 999，其中Y1為熒光時(shí)實(shí)定量PCR反應(yīng)的Ct值，X1為鐮刀菌DNA 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)數(shù)值。
在本發(fā)明中PCR反應(yīng)的體系為20 μ L，其中10XPCR Buffer 10yL，其中包括 2 XMaster Mix,上、下游引物10 μ mol/L各0. 5 μ L，模板1 μ L，再加去離子水補(bǔ)足；熒光時(shí)實(shí)定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；95°C變性10s，55°C退火20s，72°C延伸20s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
在本發(fā)明中所述的熒光定量PCR儀為Mratagene公司或ABI公司或Eppendorf 公司或BioRad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所用的引物反應(yīng)得到的擴(kuò)增曲線(xiàn)、熔點(diǎn)曲線(xiàn)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均達(dá)到Real-Time QPCR反應(yīng)的理想條件。通用引物ITS-Fu擴(kuò)增無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，具有良好的特異性。然而建立實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)體系除了引物應(yīng)具有良好的特異性外，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立同樣至關(guān)重要。由于Real-TimeQPCR絕對(duì)定量是建立在模板的初始濃度與Ct值關(guān)系的基礎(chǔ)上，因此為保證樣本定量分析具有穩(wěn)定可重復(fù)的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)參數(shù)的要求非常嚴(yán)格。理論上合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)具有一致的重復(fù)反應(yīng)、高的線(xiàn)性(R2 > 0. 99)和高擴(kuò)增效率(E 90 ~ 105% ) ο
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于，應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究轉(zhuǎn)基因作物的安全性，建立了快速、簡(jiǎn)便的鑒定方法。轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生物的影響是安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要方面。本發(fā)明采用對(duì)土壤總DNA進(jìn)行提取，采用PCR方法對(duì)鐮刀菌ISsrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后，獲得大小為418bp的片段，再將此片段進(jìn)行Real-Time QPCR。此方法不僅鑒定了鐮刀菌，并且可準(zhǔn)確的對(duì)其進(jìn)行絕對(duì)定量，并得到在轉(zhuǎn)基因小麥各個(gè)生育期鐮刀菌的拷貝數(shù)。在小麥生育期，鐮刀菌拷貝數(shù)的變化呈正態(tài)分布曲線(xiàn)，在拔節(jié)期前，小麥根際土壤中鐮刀菌的變化呈遞增趨勢(shì)，在拔節(jié)期達(dá)到最大值，拔節(jié)期后，則驟降，呈遞減趨勢(shì)，在成熟期降為整個(gè)生育期的最小值。說(shuō)明在小麥整個(gè)生育期內(nèi)，根際土壤鐮刀菌的變化是隨著小麥生長(zhǎng)速度的變化而變化。本實(shí)驗(yàn)立足于國(guó)際轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展現(xiàn)狀，應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究轉(zhuǎn)基因作物的安全性，建立了快速、簡(jiǎn)便而精確的鑒定方法。為后續(xù)試驗(yàn)提供了理論和試驗(yàn)依據(jù)， 對(duì)進(jìn)一步評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性具有重要意義。
本發(fā)明與現(xiàn)有方法相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，操作方便，結(jié)果直觀。


圖1 土壤總DNA鐮刀菌引物的擴(kuò)增結(jié)果。
其中，M 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；1 土壤總DNA。
圖 2 :Real-time Q PCR 擴(kuò)增曲線(xiàn)。
圖 3 :Real-time Q PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
圖 4 :Real-time Q PCR 熔解曲線(xiàn)。
圖5 =Real-Time QPCR檢測(cè)五種真菌溶解曲線(xiàn)。
圖6 小麥土壤根系土鐮刀菌拷貝數(shù)。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是本發(fā)明的限制，僅僅作示例說(shuō)明。
實(shí)施例1
選擇鐮刀菌的特異性引物，該引物序列出自Kamel A. Abd-Elsalam等(PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data, African Journal of Biotechnology Vol. 2(4), pp. 82-85, April 2003)
SEQ ID No. 2 JTS-Fu-F :5，-CAACTCCCAAACCCCTGTGA-3，；
SEQ ID No. 3 JTS-Fu-R :5’ -GCGACGATTACCAGTAACGA-3，。
在江蘇農(nóng)科院轉(zhuǎn)基因小麥評(píng)價(jià)基地選擇64m2作為實(shí)驗(yàn)基地，并在田間建立對(duì)角線(xiàn) 5點(diǎn)采樣取土點(diǎn)，并設(shè)置實(shí)驗(yàn)期間的定位標(biāo)記，將播種前的各點(diǎn)采集的土壤樣本為空白對(duì)照每點(diǎn)每次取樣0.5g，田間播種轉(zhuǎn)基因小麥株系m2-l，在小麥的生育期中的苗期、返青期、 拔節(jié)期、灌漿期、成熟期內(nèi)分別在上述各采樣取土點(diǎn)采集根際土壤樣本，每次在每個(gè)采樣取土點(diǎn)做四個(gè)重復(fù)，每次每個(gè)重復(fù)取樣0. 5g。
采用UltraClean soil DNA Isolation Kit (Mo Bio, USA)提取土壤樣本和根際土壤樣本的總DNA溶于50 μ L ddH20中。
PCR 反應(yīng)體系為10XPCR Buffer 2. 5 μ L, dNTP 2mM 2. 5 μ L，正向引物 10 μ M O. 5 μ L，反向弓L 10 μ M 0. 5μ L, DNA 1. 0μ L, Taq DNApolymerase 5U/ μ L0. 2 μ L, Ckffl2O 16. 5 μ L，終體積為25 μ L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸8min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，電壓110V， 30分鐘后在紫外燈光下進(jìn)行產(chǎn)物觀察，結(jié)果(圖1)顯示，可以擴(kuò)增出單一條帶，片段的大小在400bp左右。
擴(kuò)增結(jié)果(見(jiàn)附圖1)所示，M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為土壤總DNA，擴(kuò)增條帶較清晰，無(wú)引物二聚體影響。擴(kuò)增的序列經(jīng)克隆、測(cè)序后，在GenBank中進(jìn)行核酸同源性的比對(duì)，結(jié)果顯示，獲得的序列與GenBank中鐮刀菌(JF740893)的序列同源性為100%。說(shuō)明引物及擴(kuò)增產(chǎn)物都正確，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。
將特異性片段進(jìn)行凝膠回收后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，將獲得的陽(yáng)性克隆交由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。SEQ ID No. 1 CMCTCCCAA ACCCCTGTGA ACATACCTAT ACGTTGCCTC GGCGGATCAG CCCGCGCCCC 60
GTAAAAAGGG ACGGCCCGCC CGAGGACCCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT 120
AMACAMCA MTAAATCAA MCTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGM 180
GMCGCAGCA MATGCGATA AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT 240
TGAACGCACA TTGCGCCCGC CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCM 300
CCCTCAAGCT CAGCTTGGTG TTGGGACTCG CGGTMCCCG CGTTCCCCAA ATCGATTGGC 360
GGTCACGTCG AGCTTCCATA GCGTAGTAAT CATACACCTC GTTACTGGTA ATCGTCGC418
該序列與 0，Donnell, K.等(0，Donnell, K.，Humber, R. A.，Geiser, D. M.，Kang, S. , Park, B. , Robert, V. A. R. G. , Crous, P. W. , Johnston, P. R. , Aoki, Τ. , Rooney, Α. P. and Rehner,S. Α. Phylogenetic diversity of insecticolous fusaria inferred from multi locus DNA sequence data and their molecular identification via the Internet at FUSARIUM-ID and Fusarium MLST. Bacterial Foodborne Pathogens and Mycology, 2011.)獲得的鐮刀菌序列(JF740893)的同源性為100%。說(shuō)明獲得的序列正確。
實(shí)施例2
引物的特異性檢測(cè)
選擇5種土壤中常見(jiàn)的病原真菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、雪腐鐮刀菌(Fusarium nivale)、尖抱鍵刀菌(Fusarium axysporum)、禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)及立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)進(jìn)行引物的驗(yàn)證，具體步驟為
(1)提取這幾種菌純培養(yǎng)物的總DNA為模板
(2)以構(gòu)建的質(zhì)粒DNA，由實(shí)施例1獲得的大小在400bp左右特異性片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后連接PMD-19T載體(TaKaRa，大連)，克隆轉(zhuǎn)化后獲得。
(3)以小麥根際土壤DNA為陽(yáng)性對(duì)照，參照實(shí)施例1條件進(jìn)行Real-Time QPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，只有在禾谷鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、尖孢鐮刀菌中DNA有擴(kuò)增產(chǎn)物，其他兩種菌都沒(méi)有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果說(shuō)明引物的特異性很好，可以用于鐮刀菌的特異性分析。
通過(guò)特異性檢測(cè)，禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌與雪腐鐮刀菌均出現(xiàn)了單一峰值(見(jiàn)附圖幻，且溶解溫度為88. 2士0. 4°C，而對(duì)照禾谷絲核菌與立枯絲核菌則無(wú)熔解溫度峰值， 表明了該Real-Time QPCR檢測(cè)為特異性擴(kuò)增。
通過(guò)特異性檢測(cè)，禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌與雪腐鐮刀菌均出現(xiàn)了單一峰值(見(jiàn)附圖幻，且溶解溫度為88. 2 士 0. 4°C，而對(duì)照禾谷絲核菌與立枯絲核菌則無(wú)熔解溫度峰值， 表明了該Real-Time QPCR檢測(cè)為特異性擴(kuò)增。
實(shí)施例3:
熒光定量PCR體系的建立及檢測(cè)分析
特異性引物對(duì)與實(shí)施例1相同
(1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所需鐮刀菌DNA模板的制備
將實(shí)施例1獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后連接PMD-19T載體(TaKaRa，大連)，克隆篩選后進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果(SEQ ID No. 1)顯示與GenBank中多個(gè)鐮刀菌的序列100%同源，說(shuō)明所獲得序列正確，陽(yáng)性質(zhì)?？捎糜谫|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制作。使用紫外分光光度儀測(cè)定該標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為4. 30X1010COpieS/y 1，將初始標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒溶液進(jìn)行10倍系列梯度稀釋。
(2)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度的計(jì)算
提取經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，將獲得的質(zhì)粒計(jì)算拷貝數(shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)的計(jì)算方法為
質(zhì)?？截悢?shù)(copy/μ 1)=質(zhì)粒濃度(g/ μ 1) Χ6. 023X IO23(copy/ μ 1) /MW(g/ mol)(其中麗=(克隆載體長(zhǎng)度+目的片段長(zhǎng)度)0^))\324\28/(!1101 bp)。
將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒進(jìn)行IO7-IO1c0Py/^ 1系列梯度稀釋?zhuān)@得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
取構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行IO7-IO1c0Py/^ 1系列梯度稀釋?zhuān)韵♂尯玫馁|(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR分析，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。20 μ 1反應(yīng)體系2XMaSter Mix 10 μ L，ddH20 8μ L，正向引物 lOymol/L 0. 5μ L，反向引物 lOymol/L 0. 5μ L, DNAl.OyL。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸20s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在Rotor Gene 6000儀器(Corbett，Australia)上進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)由儀器自動(dòng)生成。
Rotor-Gene 6000Series實(shí)時(shí)熒光定量分析軟件繪制出反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(xiàn)(見(jiàn)附圖 2)。擴(kuò)增曲線(xiàn)顯示，從左至右4條曲線(xiàn)依次代表標(biāo)準(zhǔn)品的1 102、1 IO3U IO4U 105、 1 IO6的梯度稀釋液的擴(kuò)增曲線(xiàn)，5個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)較光滑，呈現(xiàn)典型的S型曲線(xiàn)， 且各循環(huán)閾值(CT值)間隔均勻。
根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)提供的標(biāo)準(zhǔn)品各梯度濃度及反應(yīng)的循環(huán)閾值(CT值)，Rotor-Gene eOOOkries軟件自行繪制出反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)附圖3)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 99960，斜率為-3. 203，計(jì)算其擴(kuò)增效率E = 105 %，符合熒光定量分析對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的要求。
測(cè)定各濃度稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品在PCR過(guò)程中的溶解溫度并繪制溶點(diǎn)曲線(xiàn)(見(jiàn)附圖4)。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的熔解曲線(xiàn)峰型單一，且標(biāo)準(zhǔn)品及樣品熔解溫度相同 (88. 2士0. 40C )，表明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物熔解溫度較均一，特異性好且無(wú)引物二聚體影響。
實(shí)施例4
轉(zhuǎn)基因小麥主要生育期根際土壤中鐮刀菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析
采用實(shí)施例1的熒光定量PCR體系
熒光定量PCR儀采用Corbett公司(Australia)生產(chǎn)的Rotor Gene 6000熒光定量PCR進(jìn)行。
分別于冬小麥生長(zhǎng)的空白期、苗期、返青期、拔節(jié)期、灌漿期及成熟期在相同地點(diǎn)采集小麥根際土壤，提取DNA，利用實(shí)施例1提供的特異引物對(duì)采用實(shí)施例4的擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算即可獲得土壤樣本中初始鐮刀菌的含菌量。結(jié)果顯示在小麥生長(zhǎng)的各個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，土壤中的鐮刀數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在小麥拔節(jié)期土壤中鐮刀菌的數(shù)量最多。
應(yīng)用已建立的Real-Time QPCR，對(duì)小麥整個(gè)生長(zhǎng)期在建立的對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)分階段采樣取土點(diǎn)采集根際土壤，按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法對(duì)鐮刀菌的數(shù)量進(jìn)行了檢測(cè)，匯總后如圖6所示。由圖6可見(jiàn)，在小麥整個(gè)生長(zhǎng)期中，鐮刀菌的拷貝數(shù)呈對(duì)稱(chēng)單峰曲線(xiàn)，在苗期、 返青期、拔節(jié)期，小麥生長(zhǎng)較旺盛時(shí)期，根際土中的鐮刀菌較呈依次遞增的趨勢(shì)，而在空白期、灌漿期、成熟期，鐮刀菌的數(shù)量較少，其他時(shí)期數(shù)值較大。由此可見(jiàn)，鐮刀菌拷貝數(shù)的多少與小麥生長(zhǎng)階段有較大關(guān)聯(lián)。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)時(shí)實(shí)熒光定量PCR建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌 (Fusarium. sp)拷貝數(shù)的方法，其特征在于a)在田間建立對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)采樣取土點(diǎn)并標(biāo)記定位，將播種前的各點(diǎn)采集的土壤樣本為空白對(duì)照，田間播種轉(zhuǎn)基因小麥，在轉(zhuǎn)基因小麥的生育期中的苗期、返青期、拔節(jié)期、灌漿期、成熟期內(nèi)分別在上述各采樣取土點(diǎn)采集根際土壤樣本，每次在每個(gè)采樣取土點(diǎn)做四個(gè)重復(fù)；b)將各采樣取土點(diǎn)采集的土壤樣本、根際土壤樣本通過(guò)UltraClean soil DNA Isolation Kit試劑盒分別提取樣本的總DNA，并將樣本的總DNA溶于ddH20中，以鐮刀菌特異性通用引物對(duì)SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3對(duì)每個(gè)時(shí)期的樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小在418bp的特異性片段；由熒光定量PCR儀根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)直接測(cè)出土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)；c)將不同時(shí)期土壤樣本中鐮刀菌拷貝數(shù)匯總，形成轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根系土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)熒光時(shí)實(shí)定量PCR建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)的方法，其特征在于所述的特異性片段測(cè)序?yàn)镾EQ IDNo. 1 ；所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y1 = -3. 203X1+36. 956，R2 = 0. 999，其中Y1為熒光時(shí)實(shí)定量PCR反應(yīng)的Ct值，X1為鐮刀菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)數(shù)值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過(guò)熒光時(shí)實(shí)定量PCR建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)的方法，其特征在于PCR反應(yīng)的體系為20yL，其中IOXPCR BufferlOy L，其中包括2 XMaster Mix，上、下游引物10 μ mol/L各0. 5 μ L，模板1 μ L，再加去離子水補(bǔ)足；熒光時(shí)實(shí)定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；95°C變性10s，55°C退火 20s，72°C延伸20s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過(guò)熒光時(shí)實(shí)定量PCR建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)的方法，其特征在于，所述的熒光定量PCR儀為Mratagene公司或ABI公司或Eppendorf公司或BioRad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)時(shí)實(shí)熒光定量PCR建立轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤中鐮刀菌(Fusarium.sp)拷貝數(shù)的方法，是在田間建立對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)采樣取土點(diǎn)并標(biāo)記定位，在播種前和生育期分別在上述各采樣取土點(diǎn)采集根際土壤樣本；將各采樣取土點(diǎn)采集的土壤樣本提取總DNA，并將樣本的總DNA溶于ddH2O中，以鐮刀菌特異性通用引物對(duì)SEQIDNo.2和SEQIDNo.3對(duì)每個(gè)時(shí)期的樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小在418bp的特異性片段；由熒光定量PCR儀根據(jù)熒光信號(hào)的變化及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)直接測(cè)出相應(yīng)的鐮刀菌拷貝數(shù)；將不同時(shí)期土壤樣本中鐮刀菌拷貝數(shù)匯總，形成轉(zhuǎn)基因小麥生長(zhǎng)期內(nèi)根系土壤中鐮刀菌拷貝數(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102517385SQ201110419678
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者史建榮, 曹歡, 林凡云, 王秀宇, 祭芳, 董飛 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院