專利名稱：轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及轉基因檢測技術，更詳細的是一種用于轉基因植物、轉基因糧食和轉基因食品檢測的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法及其裝置。
背景技術：
目前，基因檢測的方法主要有聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析；聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)性分析；熒光能量傳遞技術(Taqman探針技術，LightCycler探針技術，Amplisensor探針技術，復合探針技術)；分子燈塔技術；基因探針技術等。但是，這些技術都存在各自的不足有假陽性，靈敏度低，放射性元素，檢測時有熒光背景，操作繁瑣，檢測時間長等。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏度、安全、快速、準確的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，用于轉基因植物、轉基因糧食和轉基因食品的檢測。待測樣品可以不需要進行PCR擴增，直接利用熒光互相關譜技術檢測。
本發(fā)明的目的還在于提供實現(xiàn)所述方法使用的裝置。
本發(fā)明轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法包括以下步驟(1)用兩種限制性內切酶對樣品DNA進行酶切；(2)在(1)得到的酶切產物中加入DNA Marker混勻，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA片段；(3)根據(jù)DNA Marker指示的分子量，切下包含特定長度的CaMV35S啟動子或終止子片段在內的凝膠；(4)用DNA凝膠回收試劑盒將(3)中切下的凝膠純化回收包含CaMV35S啟動子或終止子片段在內的特定長度DNA片段；(5)用兩條熒光染料標記的寡核苷酸探針與純化DNA片段進行雜交；(6)用熒光互相關譜檢測雜交產物。
在第(1)步中，利用兩種限制性內切酶特異性地切割轉基因物種中的CaMV35S啟動子或終止子。
在第(2)步中，將DNA Marker與酶切產物混合后再做電泳，其中DNAMarker的分子量與第(1)步中得到的酶切產物分子量相等。
在第(3)步中，將DNA Marker所在位置的凝膠切下用于回收CaMV35S啟動子或終止子片段。
在第(5)步中，設計兩條熒光染料標記的寡核苷酸探針，同時與CaMV35S啟動子或終止子片段特異性地雜交。
在第(6)步中，利用熒光互相關譜來檢測同時雜交了兩條熒光探針的CaMV35S啟動子或終止子片段。
實現(xiàn)所述方法的裝置主要包括激光器、濾光片、分色鏡、針孔、顯微鏡物鏡、檢測樣品池、光纖、雪崩二極管、相關卡、計算機，其中入射激光經過主分色鏡反射，然后通過一高數(shù)值孔徑的物鏡聚焦后激發(fā)待檢測樣品，再利用同一物鏡收集熒光，經過第二級分色鏡分束后，不同波長的熒光分別經過濾光片過濾和小孔限制后，進入收集光纖，光纖與雪崩二極管連接，經過相關卡做互相關處理，結果在計算機上輸出。
本發(fā)明的基本原理為根據(jù)絕大多數(shù)轉基因植物種都采用了CaMV35S啟動子或終止子，針對其設計兩條寡核苷酸探針進行檢測，例如，其中一條標記羅丹明綠(Rhodamine Green)，另一條標記Cy5。提取轉基因物種基因組DNA，經過兩種限制性內切酶，例如可以用Fok I和BsrD I兩種限制性內切酶對CaMV35S啟動子進行酶切并回收目的片斷，加入兩種探針與目的片斷雜交。最終使只有同時雜交上兩種熒光標記探針的目標序列才能被檢測到。在熒光互相關譜技術中[1]，針對兩種熒光探針選擇兩種合適的激光波長和功率，并設定測量時間，然后激發(fā)樣品，同一個探測區(qū)域中不同波長的熒光分別被兩個通道探測器同時記錄，最后對這兩個通道的信號做互相關函數(shù)分析。如果兩種熒光分子的混合物沒有發(fā)生相互作用，它們將分別獨立做擴散運動，互相關函數(shù)的幅值將為零；相反，當一個粒子同時標記兩種熒光分子，它將同時發(fā)出兩種熒光波長，對熒光信號做互相關運算后，函數(shù)的幅值將不為零，利用這種方法，最終使只有同時雜交上兩種熒光標記探針的目標序列才能被檢測到。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點(1)熒光互相關譜技術可以對待測樣品進行準確的檢測。
(2)兩條熒光標記探針與待測樣品進行雜交，不僅可以提高檢測的靈敏度，而且可以提高檢測的特異性。
(3)熒光互相關譜技術檢測靈敏度很高，可實現(xiàn)單分子的測量，并且可以有效地去除PCR中假陽結果對檢測結果的干擾。
(4)非PCR檢測待測樣品，可以排除PCR操作的復雜性。
(5)該技術操作方便，安全，沒有同位素等有害物質的使用。
(6)該技術檢測樣品所需時間少，大約10秒一個樣品，可實現(xiàn)高通量轉基因物品檢測。


圖1是本發(fā)明裝置結構圖；圖2是圖1裝置的激發(fā)體積校準圖，其中圖2-1為Rhodamine G熒光染料溶液的自相關函數(shù)曲線，圖2-2為Cy5熒光染料溶液的自相關函數(shù)曲線；圖3是圖1裝置的靈敏度測試圖；圖4是實施例中用本發(fā)明方法檢測轉基因煙草中CaMV35S啟動子和非轉基因煙草的熒光互相關信號對照圖，其中圖4-1中的樣品為轉基因煙草(K306-2)，圖4-2中的樣品為非轉基因煙草(花葉青))。
具體實施例方式
圖1給出了對轉基因物種非PCR擴增直接檢測的方法及裝置，所述裝置包括激光器1、主分色鏡2、顯微鏡物鏡3、檢測樣品池4、二級分色鏡5、濾光片6、透鏡7、針孔8、光纖9、雪崩二極管10、相關卡11、計算機12等，其中入射激光經過主分色鏡反射，然后通過一高數(shù)值孔徑的物鏡聚焦后激發(fā)待檢測樣品，再利用同一物鏡收集熒光，經過第二級分色鏡分束，不同波長的熒光分別經過濾光片過濾和小孔限制后，進入收集光纖，光纖與雪崩二極管連接，最后經過相關卡做互相關處理，結果在計算機上輸出。
實施例將上述裝置應用于轉基因煙草的檢測轉基因煙草中都含有CaMV35S啟動子。
(1)提取非轉基因煙草(花葉青)，轉基因煙草DNA(K306-2)。
(2)用Fok I和BsrD I兩種限制性內切酶對樣品DNA進行酶切。
(3)在(2)得到的酶切產物中，加入DNA Marker混勻，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA片段；(4)根據(jù)DNA Marker指示的分子量，切下169bp附近的凝膠；(5)用DNA凝膠回收試劑盒將(4)中切下的凝膠純化回收169bp的DNA片段；(6)用一條標記有羅丹明綠(Rhodamine Green)熒光染料和一條標記有Cy5熒光染料的寡核苷酸探針與純化DNA片段進行雜交，非轉基因樣品DNA里面不含有169bp特異性序列，不能與探針雜交。
(7)收集雜交反應后的樣品并轉入檢測樣品池中；(8)利用熒光互相關譜檢測收集到的雜交樣品選取兩種合適的激光波長和功率大小，激發(fā)樣品，測量時間設為10秒鐘，對收集到的兩種不同波長的發(fā)射熒光光強做互相關處理；(9)根據(jù)測量結果對待測序列進行定量分析。
如圖2所示，圖2-1為Rhodamine G熒光染料溶液的自相關函數(shù)曲線，圖2-2為Cy5熒光染料溶液的自相關函數(shù)曲線，根據(jù)這兩個曲線，可以確定本發(fā)明裝置采用488nm和633nm波長激光激發(fā)時的有效激發(fā)體積分別為0.159fL和0.567fL，均小于1fL。
如圖3所示，采用熒光相關譜技術對Rhodamine G標記的26bp核酸片段測量，結果表明可以超靈敏地實現(xiàn)單分子探測，測得的平均粒子數(shù)為0.553。
如圖4所示，根據(jù)熒光互相關信號的有無，可以很容易地判斷是否為轉基因物品。圖4-1中互相關函數(shù)的擬合幅值為1.125，圖4-2中互相關函數(shù)的擬合幅值為零。
權利要求
1.一種轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)用兩種限制性內切酶對樣品DNA進行酶切；(2)在(1)得到的酶切產物中加入DNA Marker混勻，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA片段；(3)根據(jù)DNA Marker指示的分子量，切下包含特定長度的CaMV35S啟動子或終止子片段在內的凝膠；(4)用DNA凝膠回收試劑盒將(3)中切下的凝膠純化回收包含CaMV35S啟動子或終止子片段在內的特定長度DNA片段；(5)用兩條熒光染料標記的寡核苷酸探針與純化DNA片段進行雜交；(6)用熒光互相關譜檢測雜交產物。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，其特征在于在第(1)步中，利用兩種限制性內切酶FokI和BsrDI特異性地切割轉基因物種中的CaMV35S啟動子或終止子。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，其特征在于在第(2)步中，將DNA Marker與酶切產物混合后再做電泳，其中DNA Marker的分子量與第(1)步中得到的酶切產物分子量相等。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，其特征在于在第(3)步中，將DNA Marker所在位置的凝膠切下用于回收CaMV35S啟動子或終止子片段。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，其特征在于在第(5)步中，設計兩條熒光染料標記的寡核苷酸探針，同時與CaMV35S啟動子或終止子片段特異性地雜交。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法，其特征在于在第(6)步中，利用熒光互相關譜來檢測同時雜交了兩條熒光探針的CaMV35S啟動子或終止子片段。
7.實現(xiàn)權利要求1所述方法的裝置，其特征在于主要包括激光器、濾光片、分色鏡、針孔、顯微鏡物鏡、檢測樣品池、光纖、雪崩二極管、相關卡、計算機，其中入射激光經過主分色鏡反射，然后通過一高數(shù)值孔徑的物鏡聚焦后激發(fā)待檢測樣品，再利用同一物鏡收集熒光，經過第二級分色鏡分束后，不同波長的熒光分別經過濾光片過濾和小孔限制后，進入收集光纖，光纖與雪崩二極管連接，經過相關卡做互相關處理，結果在計算機上輸出。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于轉基因植物、轉基因糧食和轉基因食品檢測的轉基因物種的熒光相關光譜檢測方法及其裝置。所述方法是利用雙基因熒光探針，對轉基因物種非PCR擴增直接檢測，特點是待測樣品不需經過PCR擴增，雙基因熒光探針直接與原始DNA樣品中的目標片段進行雜交，然后進行熒光相關譜檢測，判斷待測樣品是否含有轉基因成分。所述裝置包括激光器、濾光片、分色鏡、針孔、顯微鏡物鏡、檢測樣品池、光纖、雪崩二極管、相關卡、計算機等。本發(fā)明方法和裝置檢測靈敏度高、安全、快速、準確、操作簡便。
文檔編號C12Q1/68GK1657916SQ20051003335
公開日2005年8月24日 申請日期2005年3月3日 優(yōu)先權日2005年3月3日
發(fā)明者邢達, 李軍鋒, 陳同生 申請人:華南師范大學