編碼tc嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及編碼含TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體及其構(gòu)建方法。編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體，所述真核表達載體命名為pcHBV1.3-TC，所述真核表達載體以pcDNA3.1+為基本骨架，所述的乙肝病毒真核表達載體含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上還同時含有TC標簽。pcHBV1.3-TC可穩(wěn)定結(jié)合在宿主細胞基因組形成穩(wěn)定表達的細胞，便于研究乙肝病毒的整個生命周期過程。
【專利說明】編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及編碼含TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)是一種含有雙鏈DNA的小包膜病毒，可以感染肝細胞，引起急慢性肝炎，最終導(dǎo)致肝硬化和肝細胞癌。HBV病毒體為雙層殼樣顆粒，直徑40nm到42nm。病毒體的外層脂質(zhì)蛋白包膜中含有三種相關(guān)的包膜糖蛋白。而在病毒體的外膜內(nèi)，則是一個由核心蛋白(21kD)組成的正20面體狀核心顆粒，直徑為34nm。核心顆粒中包含有病毒DNA聚合酶和病毒DNA基因組。除了病毒體顆粒以外，感染了 HBV的細胞還分泌兩種不同的亞病毒顆粒:17~25nm球型和管型的HBsAg顆粒。這些HBsAg顆粒只包含病毒的包膜蛋白和宿主細胞來源的脂質(zhì)。
[0003]HBV的復(fù)制和蛋白合成機制已經(jīng)被基本闡明，但是HBV生命周期中的動態(tài)過程，如病毒的入胞、胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運以及出胞等方面的研究仍然不足。目前對人HBV分子生物學(xué)的描述和理解，均是通過對鴨乙肝病毒、樹駒乙肝病毒等其他嗜肝病毒進行研究的，而且多數(shù)是借助生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法分析感染細胞的裂解物或通過免疫學(xué)方法和電子顯微鏡檢測被固定細胞樣本中的病毒顆粒，顯然這些應(yīng)用死細胞的研究方法都不能充分反映HBV生命周期中真實的動態(tài)過程，直接在活細胞中觀察HBV生命周期中的動態(tài)過程則是一種更為形象、真實、直觀的反映HBV在細胞中的天然過程，HBV的標記則是觀察其在活細胞內(nèi)動態(tài)過程的瓶頸。
[0004]迄今為止,病毒一般都是應(yīng)用綠色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP)進行標記的，組裝成的重組病 毒將帶上熒光標記，從而能夠被示蹤，進而可以直接在活細胞中觀察并研究病毒的生命周期。近年來，GFP已經(jīng)成功地用于標記艾滋病病毒(HIV-1)、腺相關(guān)病毒(AVV)以及皰疹病毒(HSV)等多種病毒。然而由于HBV病毒體積小而且空間利用率高，沒有足夠的內(nèi)部空間容納含有238個氨基酸的GFP的嵌入。至今尚無人乙肝病毒的標記技術(shù)并在活細胞中示蹤并對其生命周期進行研究的報道。
[0005]林園園在07年用含四個半胱氨酸(tetracysteine, TC)的標簽插入到乙肝病毒核心蛋白的77~78位氨基酸之間，構(gòu)建了帶TC標簽的原核質(zhì)粒載體pTHBVl.3-TC，這個TC標簽是由六個氨基酸組成，其中四個半胱氨酸形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，如C-C-P-G-C-C，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)與雙砷染料特異性的結(jié)合發(fā)出熒光。
[0006]pTHBVl.3是原核質(zhì)粒載體pBR322通過脂質(zhì)體在體外和質(zhì)粒形成復(fù)合物，導(dǎo)入細胞后進行瞬時表達。由于這種瞬時表達的質(zhì)粒在真核細胞不能擴增，并不斷被降解，在一定的時間后就會消失。因此，沒有觀察到完整的乙肝病毒Dane顆粒。
[0007]我們現(xiàn)在用真核載體pcDNA3.1+來代替原核載體，用酶切連接的方法將質(zhì)粒整合進入細胞的基因組，通過質(zhì)粒上所攜帶的篩選標記進行G418篩選，得到穩(wěn)定表達帶有TC標簽的乙肝病毒細胞克隆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的旨在填補乙肝病毒標記技術(shù)的空白，提供編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體及其構(gòu)建方法，解決了不能動態(tài)觀察乙肝病毒入胞以及胞內(nèi)運輸?shù)膯栴}。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設(shè)計的編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體，所述真核表達載體命名為pcHBVl.3-TC，所述真核表達載體以pcDNA3.1+為基本骨架，所述的乙肝病毒真核表達載體含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上還同時含有TC標簽。其中，將真核表達載體pcHBVl.3，命名為大腸桿菌DH5 α /pcHBVl.3Escherichia coil DH5 a/pcHBVl.3，于 2013 年 11 月 22 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC);保藏地址為:武漢大學(xué)，其保藏號為CCTCC NO:M2013590。
[0010]進一步地，所述真核表達載體為:
[0011]真核表達載體pcHBVl.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759個堿基后插入TC標簽，或；
[0012]真核表達載體pcHBVl.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906個堿基后插入TC標簽，或； [0013]真核表達載體pcHBVl.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990個堿基后插入TC標簽，或；
[0014]真核表達載體pcHBVl.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218個堿基后插入TC標簽。
[0015]本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述的編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體的方法，包括步驟如下:
[0016]1)1.3倍乙肝病毒基因的獲得
[0017]以含1.3倍乙肝病毒基因的環(huán)形載體質(zhì)粒pTHBVl.3為模板設(shè)計引物，擴增pTHBVl.3質(zhì)粒上從5675位點順時針方向擴增到3270位點的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段；
[0018]2) 1.3倍乙肝病毒基因真核表達載體的構(gòu)建
[0019]根據(jù)酶切位點分析，結(jié)合pcDNA3.1+真核表達載體的限制性酶切位點圖譜，選用HindIII和NotI兩個限制性內(nèi)切酶對1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表達載體進行雙酶切，分別回收酶切的片段，用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，酶切鑒定，載體命名為pcHBVl.3 ；
[0020]3) pcHBVl.3-TC真核表達載體的構(gòu)建
[0021 ] 利用SOE-PCR技術(shù)，設(shè)計引物并將TC標簽設(shè)計入引物內(nèi)，進行PCR，得到編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表達載體，命名為pcHBVl.3-TC。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點如下:
[0023]UTC標簽是一個僅含6個氨基酸的插入片段，并且與之結(jié)合的雙砷染料的分子量也僅為545.38，相當于5個氨基酸。因此，結(jié)合了雙砷染料的TC嵌合型核心蛋白同野生型核心蛋白具有相近的大小，TC標簽可以裝配入成熟的HBV病毒體中，作為遺傳物質(zhì)隨著細胞的分裂分配到子代細胞中。
[0024]2、TC標簽分別插入在乙肝病毒核心蛋白的第2位、第49位、第79位、第155位氨基酸后面，這幾個位點是臨床上乙肝病毒常見的突變位點，不會引起病毒抗原性以及基因組復(fù)制完整性的改變。
[0025]3,pcHBVl.3-TC的細胞和!fepG2細胞的一般生物學(xué)特性一致，具有典型的上皮樣形態(tài)，可以無限傳代培養(yǎng)。
[0026]4、pcHBVl.3_TC可穩(wěn)定結(jié)合在宿主細胞基因組形成穩(wěn)定表達的細胞，便于研究乙肝病毒的整個生命周期過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為pTHBVl.3的載體示意圖；
[0028]圖2為pcDNA3.1+的載體示意圖；
[0029]圖3為pcHBVl.3-TC載體示意圖；
[0030]圖4為pcHBVl.3-TC-1的質(zhì)粒雙酶切電泳圖。
【具體實施方式】
[0031]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實施例進一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實施例。
[0032]實施例1
[0033]1、獲得1.3倍乙肝病毒基因
[0034]I)設(shè)計引物，如下:
[0035]引物如下:
[0036]
【權(quán)利要求】
1.編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體，其特征在于:所述真核表達載體命名為pcHBVl.3-TC，所述真核表達載體以PCDNA3.1+為基本骨架，所述的乙肝病毒真核表達載體含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上還同時含有TC標簽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體，其特征在于:所述真核表達載體為: 真核表達載體pcHBVl.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759個堿基后插入TC標簽，或； 真核表達載體pcHBVl.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906個堿基后插入TC標簽，或； 真核表達載體pcHBVl.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990個堿基后插入TC標簽，或； 真核表達載體pcHBVl.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218個堿基后插入TC標簽。
3.構(gòu)建權(quán)利要求1所述的編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表達載體的方法，包括步驟如下: 1)1.3倍乙肝病毒基因的獲得 以含1.3倍乙肝病毒基因的環(huán)形載體質(zhì)粒pTHBVl.3為模板設(shè)計引物，擴增pTHBVl.3質(zhì)粒上從5675位點順時針方向到3270位點的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段； 2)1.3倍乙肝病毒基`因真核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)酶切位點分析，結(jié)合PCDNA3.1+真核表達載體的限制性酶切位點圖譜，選用HindIII和NotI兩個限制性內(nèi)切酶對1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表達載體進行雙酶切，分別回收酶切的片段，用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，酶切鑒定，載體命名為pcHBVl.3 ； 3)pcHBVl.3-TC真核表達載體的構(gòu)建 利用SOE-PCR技術(shù)，設(shè)計引物并將TC標簽設(shè)計入引物內(nèi)，進行PCR，得到編碼TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表達載體，命名為pcHBVl.3-TC。
【文檔編號】C12N15/79GK103805628SQ201310655349
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】林菊生, 孫淑珍, 廖家智, 閆靜君, 何星星, ?，? 田德安, 趙秋, 但自立 申請人:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院