專利名稱：耐藥基因pcr檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板、制備方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板、制備方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的普遍應(yīng)用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題也日漸嚴(yán)重，隨著2010年8月TheLancet Infectious Diseases雜志發(fā)表了一篇由印度、英國(guó)、瑞典、巴基斯坦和澳大利亞科學(xué)家聯(lián) 合研究報(bào)告，報(bào)道了抗生素抗性的一種新機(jī)制及其在印度、英國(guó)和巴基斯坦的播散情況，耐 藥性問(wèn)題再一次驚醒世人抗生素濫用會(huì)終結(jié)我們依賴抗生素與細(xì)菌感染斗爭(zhēng)的威力。早在青霉素尚未臨床應(yīng)用的1940年，科學(xué)家就分離出了水解青霉素的酶，當(dāng)時(shí) 稱為青霉素酶，在解析了青霉素為一種β -內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的抗生素后，此酶也就重新命名為 β-內(nèi)酰胺酶。該酶按照功能和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類。根據(jù)功能特征分成群1 4，其中群2 又分成亞群2a 2e、2f，2b進(jìn)一步分成2be和2br兩個(gè)亞群。根據(jù)該酶的核酸與蛋白序列 進(jìn)行分子分型，分為A D 4個(gè)類型，分子型A、C和D是以絲氨酸為基礎(chǔ)的作用機(jī)制，而B(niǎo) 型或金屬- β _內(nèi)酰胺酶以鋅指結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的作用機(jī)制。群1是頭孢菌素酶，分子型C，不被 棒酸抑制；群2包括青霉素酶、頭孢菌素酶或二者均有，均被棒酸抑制，屬于分子型A和D， 對(duì)應(yīng)原始的TEM和巰基變異(sulfhydryl variable, SHV)基因；群3是金屬酶，分子型B， 不被棒酸抑制；群4是青霉素酶，沒(méi)有分子型與之對(duì)應(yīng)，不被棒酸抑制。新發(fā)現(xiàn)的NDM-I是 金屬蛋白酶，是一類新型具有廣譜抗生素水解作用的內(nèi)酰胺酶。新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM-1)基因 介導(dǎo)的抗性是一種新報(bào)道的耐藥新機(jī)制，NDM-I是一種新鑒定的對(duì)內(nèi)酰胺抗生素具有 廣譜水解作用的一種酶，是編碼碳青霉烯類酶(Carbapenamase)基因家族成員之一。NDM-I 可以水解碳(雜)青霉烯類抗生素，以及頭孢菌素和青霉素。攜帶該基因的細(xì)菌對(duì)幾乎所 有一線治療重癥感染的廣譜抗生素都具有抗性，因此，被媒體稱為“超級(jí)細(xì)菌”。該酶是質(zhì)粒 上bla ^基因編碼的，容易通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間傳播。該抗性細(xì)菌雖然發(fā)現(xiàn)時(shí)間不 到1年，但其已經(jīng)擴(kuò)散到英國(guó)、美國(guó)、比利時(shí)、巴基斯坦等國(guó)家，并且從肺炎克雷伯菌擴(kuò)散到 大腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌。由于從其他國(guó)家分離的攜帶NDM-I的耐藥菌株，患者都有到印 度就醫(yī)的歷史，因此，推測(cè)表達(dá)NDM-I菌株是從印度起源的。國(guó)際旅行和患者享受多國(guó)醫(yī)療 服務(wù)可能會(huì)導(dǎo)致NDM-I的快速擴(kuò)散，且可能導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重后果。鑒于我國(guó)目前還沒(méi)有關(guān)于攜帶NDM-I菌株的報(bào)道，所以需要加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。因?yàn)槲覈?guó) 目前對(duì)外交往頻繁，尤其是在一些印度和巴基斯坦人聚集的地區(qū)，更應(yīng)密切監(jiān)測(cè)；對(duì)于往來(lái) 印度和巴基斯坦的人員也要監(jiān)測(cè)，尤其是在當(dāng)?shù)赜凶≡夯蚓歪t(yī)歷史的人員更要密切監(jiān)測(cè)。最簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法就是基于核酸體外擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain Reaction, PCR)，雖然NDM-I基因序列網(wǎng)上已經(jīng)公布，在沒(méi)有陽(yáng)性對(duì)照模板的情況，會(huì)使得 檢測(cè)結(jié)果難以判定，而且，如果直接合成公布的基因，會(huì)造成合成基因?qū)o(wú)抗性菌株的污
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠保證生物安全的耐藥基因 PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板、制備方法及試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照 模板序列，所述耐藥基因?yàn)镹DM-1，所述序列含有SEQ ID NO :3所示的序列。所述序列可以 含有SEQ ID NO 2所示的序列。一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法，所述耐藥基因?yàn)镹DM-I，NDM-I 基因序列為SEQ ID NO 1所示的序列，包括如下步驟a)對(duì)NDM-I基因序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲取突變基因，所述突變基因序列含有SEQ ID NO 3所示的序列；b)將所述突變基因合成并克隆入質(zhì)粒；c)將所述質(zhì)粒線性化，得到所述陽(yáng)性模板。進(jìn)一步的，所述突變基因序列含有SEQ ID NO 2所示的序列。進(jìn)一步的，所述步驟a)中，插入一段多克隆位點(diǎn)。進(jìn)一步的，所述多克隆位點(diǎn)包括多個(gè)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，所述酶切位點(diǎn)選自BamHI、 EcoRI,HindIII0進(jìn)一步的，所述步驟C)中，將所述質(zhì)粒線性化后，再將所述質(zhì)粒去磷酸化。一種由所述制備方法制備的陽(yáng)性對(duì)照模板。一種陽(yáng)性對(duì)照模板在NDM-I檢測(cè)上的應(yīng)用。一種耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，包括所述的陽(yáng)性對(duì)照模板。一種所述的試劑盒在NDM-I檢測(cè)上的應(yīng)用。一種引物，所述引物用于檢測(cè)一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板序列，所述引
物含有下述至少一_i
ANDM-Pl-L CGACAACGCATTGGCATAAGSEQIDNO 7
NDM-Pl-RCTGGCAGCACACTTCCTATCSEQIDNO8
B:NDM-P2-L :GGCGGAATGGCTCATCACSEQIDNO 9
NDM-P2-RGGCAGCACACTTCCTATCTCSEQIDNO10
C:NDM-P3-L :GATTGCCGAGCGACTTGGSEQIDNO 11
NDM-P3-R:CTGAGCACCGCATTAGCCSEQIDNO12本發(fā)明的有益效果是通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性模板，可以快速準(zhǔn)確的進(jìn)行NDM-I檢測(cè)；通過(guò) 對(duì)NDM-I基因進(jìn)行點(diǎn)突變，可以保證陽(yáng)性模板不被正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能作為陽(yáng)性對(duì)照的 序列，從而能夠保證生物安全。


圖 1 是電泳圖，其中，Lane 1 :DL2000 marker ；Lane 2 =NDM-Pl 鑒定產(chǎn)物；Lane 3 NDM-P2鑒定產(chǎn)物；Lane 4 :NDM_P3鑒定產(chǎn)物；Lane 5 陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明所提供的陽(yáng)性對(duì)照模板制備方法是從網(wǎng)上獲得NDM-I基因序列 (FN396876)，將其編碼密碼子進(jìn)行27處點(diǎn)突變(突變成終止密碼子)并插入一段多克隆位 點(diǎn)(便于對(duì)突變序列進(jìn)行酶切分析)，然后將突變基因合成并克隆入質(zhì)粒中，再將重組質(zhì)粒 線性化后作為陽(yáng)性對(duì)照模板。這樣，可以保證陽(yáng)性模板不能被正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能作為陽(yáng) 性對(duì)照的序列，可以絕對(duì)保證生物安全。本發(fā)明所提供的陽(yáng)性對(duì)照模板制備方法，包括以下步驟1)從網(wǎng)上獲得NDM-I基因序列(FN396876)并根據(jù)NDM-I基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)PCR 鑒定引物NDM-I基因序列ATGGAATTGCCCAATATTATGCACCCGGTCGCGAAGCTGAGCACCGCATTAGCCGCTGCATTGATGCTGAGCGGGTGCATGCCCGGTGAAATCCGCCCGACGATTGGCCAGCAAATGGAAACTGGCGACCAACGGTTTGGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCACCGAATGT CTGGCAGCACACTTCCTATCTC GACATGCCGGGTTTCGGGGCAGTCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGC
CTGGACCGATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGGATCAAGCAGGAGATCAACCTGCCGGTCGCGCTGGCGGTGGTGACTCACGCGCATCAGGACAAGATGGGCGGTATGGACGCGCTGCATGCGGCGGGGATTGCGA CTTAT GCC^T GCGTTGTCG AACCAGCTTGCCCCGCAAGAGGGGATGGTTGCGGCGCAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTGGGTCGAACCAGCAACCGCGCCCAACTTTGGCCCGCTCAAGGTATTTTACCCCGGCCCCGGCCACACCAGTGACAATATCACCGTTGGGATCGACGGCACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGCCTGATCAAGGACAGCAAGGCCAAGTCGCTCGGCAATCTCGGTGATGCCGACACTGAGCACTACGCCGCGTCAGCGCGCGCGTTTGGTGCGGCGTTCCCCAAGGCCAGCAT GATC GTGATGAGCCATTCCGCC CCCGATAGCCGCGCCGCAATCACTCATACGGCCCGCATGGCCGACAAGCTGCGCTGA(813bp，與 SEQ IDNO 1所示序列一致，其中下劃線和著重號(hào)標(biāo)注序列為鑒定引物)。相應(yīng)的氨基酸 序列為MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNL⑶ADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR(270aa，即 SEQ IDNO 5所示序列)。NDM-I基因PCR鑒定引物序列如表1所示表1NDM-1基因PCR鑒定引物
權(quán)利要求
一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板序列，所述耐藥基因?yàn)镹DM 1，所述序列含有SEQ ID NO3所示的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板序列，其特征在于所述序列 含有SEQ ID NO :2所示的序列。
3.一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法，所述耐藥基因?yàn)镹DM-1，NDM-1基 因序列為SEQ ID NO 1所示的序列，其特征在于包括如下步驟a)對(duì)NDM-I基因序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲取突變基因，所述突變基因序列含有SEQID NO 3所示的序列；b)將所述突變基因合成并克隆入質(zhì)粒；c)將所述質(zhì)粒線性化，得到所述陽(yáng)性模板。
4.如權(quán)利要求3所述的耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法，其特征在于所 述步驟a)中，插入一段多克隆位點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求4所述的耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法，其特征在于所 述多克隆位點(diǎn)包括多個(gè)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，所述酶切位點(diǎn)選自BamHI、EcoRI、HindIII。
6.如權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板的制備方法，其 特征在于所述步驟c)中，將所述質(zhì)粒線性化后，再將所述質(zhì)粒去磷酸化。
7.一種權(quán)利要求1或2所述的陽(yáng)性對(duì)照模板在NDM-I檢測(cè)上的應(yīng)用。
8.一種耐藥基因PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1或2所述的陽(yáng)性對(duì)照 模板。
9.一種權(quán)利要求7所述的試劑盒在NDM-I檢測(cè)上的應(yīng)用。
10.一種引物，所述引物用于檢測(cè)一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板序列，所述引物含有下述至少-- g A=NDM-Pl-L CGACAACGCATTGGCATAAGSEQIDNO 7NDM-Pl-RCTGGCAGCACACTTCCTATCSEQIDNO8B:NDM-P2-L GGCGGAATGGCTCATCACSEQIDNO 9NDM-P2-R:GGCAGCACACTTCCTATCTCSEQIDNO10C:NDM-P3-L GATTGCCGAGCGACTTGGSEQIDNO 11NDM-P3-R:CTGAGCACCGCATTAGCCSEQIDNO1全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐藥基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照模板、制備方法及試劑盒，所述耐藥基因?yàn)镹DM-1，NDM-1基因序列為SEQ ID NO1所示的序列。一種陽(yáng)性模板的制備方法包括如下步驟a)對(duì)NDM-1基因序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲取突變基因，所述突變基因序列含有SEQ ID NO3所示的序列；b)將所述突變基因合成并克隆入質(zhì)粒；c)將所述質(zhì)粒線性化，得到所述陽(yáng)性模板。通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性模板，可以快速準(zhǔn)確的進(jìn)行NDM-1檢測(cè)；通過(guò)對(duì)NDM-1基因進(jìn)行點(diǎn)突變，可以保證陽(yáng)性模板不被正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能作為陽(yáng)性對(duì)照的序列，從而能夠保證生物安全。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101948920SQ201010278429
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者彭雁忠, 楊瑞馥, 蔡志明, 覃俊杰, 趙向娜, 郭兆彪 申請(qǐng)人:楊瑞馥;趙向娜;彭雁忠;郭兆彪;蔡志明