一種熒光定量pcr檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測方法,包括熒光定量PCRMIX試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因blaTEM引物;所述的16sRNA通用引物包括16sRNA通用引物1:5'?CGTATCGGTCGCATTGTT?3',16sRNA通用引物2:5'?CTTCGTCCCATTTCAGGTT?3';所述的耐藥基因blaTEM引物包括耐藥基因blaTEM引物1:5'?CGGTATTATCCCGTGTTG?3';耐藥基因blaTEM引物2:5'?GTCGTTTGGTATGGCTTC?3'。本發(fā)明提供的試劑盒材料完整、操作簡單,具有快速、較高的靈敏度、良好的特異性,對獲取養(yǎng)殖場環(huán)境中耐藥基因信息具有廣泛的適用性。
【專利說明】
一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及 其檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及細菌耐藥基因檢測技術領域,具體為一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸 桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 當前,畜牧業(yè)生產中抗生素的使用存在諸多不規(guī)范的情況,臨床和畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗 生素的不合理使用導致微生物在選擇性壓力作用下獲得并維持耐藥性,且有可能通過質粒 和整合子將耐藥基因在相同或不同種屬中廣泛傳播轉移,最終導致多重耐藥。耐藥基因在 養(yǎng)禽場中從發(fā)病動物體內的耐藥菌株傳遞給環(huán)境中的非致病菌,非致病菌在養(yǎng)殖場中不能 被完全消滅,致使耐藥基因在舍內長期存在,不斷地傳遞給可能出現(xiàn)的致病菌,從而使得養(yǎng) 殖場細菌病治療難度加大。目前,在研究和生產領域,耐藥基因檢測多為致病菌耐藥基因、 對單種細菌耐藥基因的檢測,且多采用普通PCR技術,在靈敏度、快速性和廣泛性等方面存 在不足。
[0003] 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中,以熒 光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產物總量、通過內參或外參法對待測樣 品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。具有快速高效、靈敏度高、特異性強等特點。經(jīng)過 對現(xiàn)有技術的文獻檢索,未發(fā)現(xiàn)有利用實時熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場環(huán)境中腸桿菌科耐藥 基因的方法,因此開發(fā)熒光實時定量PCR檢測養(yǎng)禽場環(huán)境中腸桿菌科耐藥基因的試劑盒十 分必要。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明提供了一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒及其檢測 方法,解決了目前沒有利用實時熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場環(huán)境中腸桿菌科耐藥基因的方法 的問題。
[0005] 為解決上述技術問題,本發(fā)明采用的技術方案為:
[0006] -種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒,包括熒光定量PCR MIX 試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因 b laTEM引物;
[0007] 所述的16sRNA通用引物包括
[0008] 16sRNA通用引物1:5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3'(SEQ ID N0:1),
[0009] 16sRNA通用引物2:5'-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3'(SEQ ID N0:2);
[0010] 所述的耐藥基因 blaTEM引物包括
[0011] 耐藥基因 blaTEM引物 1:5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'(SEQ ID N0:3);
[0012] 耐藥基因 blaTEM引物2:5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'(SEQ ID N0:4)。
[0013] 進一步,本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的16sRNA通用引物的濃度為0.1~0.5μ mol/L;耐藥基因 blaTEM引物的濃度為0 · 1~0 · 5ymol/L。
[0014] 進一步,本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的熒光定量PCR MIX試劑組成成分及含量 分別為濃度為5U/yL的Taq聚合酶;濃度均為200ymol/L的dNTP、濃度為25ymol/L的Mg 2+。
[0015] 本發(fā)明的所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒的用 途:用于對β-內酰胺類藥物耐藥性進行定量檢測。
[0016] 進一步,本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的β-內酰胺類藥物為頭孢菌素。
[0017] 本發(fā)明也提供了一種養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測方法,利用本發(fā)明的所述的試劑盒, 包括以下步驟:
[0018] (1)采集環(huán)境細菌檢測樣品。
[0019] (2)提取環(huán)境中細菌基因組RNA;
[0020] (3)將步驟(2)所得的基因組RNA反轉錄為cDNA;
[0021] (4)將步驟(3)得到的cDNA加入到熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測試劑 盒,混勻,進行PCR擴增;
[0022] (5)PCR擴增結束后,根據(jù)熒光實時定量PCR儀對結果進行分析,根據(jù)耐藥基因 blaTEM和16sRNA基因的Ct值,通過相對Ct法計算耐藥基因 mRNA的相對表達量,即為耐藥基 因表達的信息。
[0023] 進一步,本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為:所述的PCR擴增的條件為PCR擴增時預孵育95 。(:,時間5min;變性溫度為95°C,反應時間為10s;擴增溫度72°C,時間30s;循環(huán)數(shù)為45。 [0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025] 本發(fā)明提供的試劑盒材料完整、操作簡單,具有快速、較高的靈敏度、良好的特異 性,對獲取養(yǎng)殖場環(huán)境中耐藥基因信息具有廣泛的適用性。
[0026] 本發(fā)明提供的試試劑盒可以對養(yǎng)殖場環(huán)境細菌相關耐藥基因進行定量,從而為養(yǎng) 殖場常見細菌病的藥物治療和獸藥廠藥物生產提供指導。
[0027] 本發(fā)明提供的檢測方法反應條件溫和,擴增快速高效,lh左右即可完成,不需要電 泳,與普通PCR相比更快速、靈敏,而且沒有污染。
【附圖說明】
[0028] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案,下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例,對于本領域普通技術人員來講,在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下,還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0029]圖1為耐藥基因 blaTEM基因熔解曲線;
[0030]圖2為不同菌株大腸桿菌blaTEM基因檢測結果;
[0031]圖3為不同菌株大腸桿菌16s RNA基因檢測結果;
[0032]圖4為腸道桿菌科不同細菌blaTEM基因檢測結果。
【具體實施方式】
[0033]下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖,對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述,顯然,所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例,而不是全部的實施例?;?本發(fā)明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例,都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0034] 實施例1
[0035] -種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒,包括熒光定量PCR MIX 試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因 b laTEM引物;
[0036] 所述的熒光定量PCR MIX試劑組成成分及含量分別為濃度為5U/yL的Taq聚合酶; 濃度均為200ymol/L的dNTP、濃度為25ymol/L的Mg 2+。
[0037] 所述的16sRNA通用引物包括
[0038] 16sRNA通用引物1:5,-CGTATCGGTCGCATTGTT-3,(SEQ ID N0:1),
[0039] 16sRNA通用引物2:5,-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3,(SEQ ID N0:2);
[0040] 所述的耐藥基因 blaTEM引物包括
[0041] 耐藥基因 blaTEM引物1:5'-CGGTATTATCCCGTGTTG-3'(SEQ ID N0:3);
[0042] 耐藥基因 blaTEM引物2:5'-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3'(SEQ ID N0:4)。
[0043] 16sRNA通用引物的濃度為0.5ymol/L;耐藥基因 blaTEM引物的濃度為0.5ymol/L, 所述的熒光定量PCR MIX試劑采用上述試劑。熒光定量PCR MIX試劑也可以采用市場上的其 它試劑。
[0044] 實施例2
[0045]與實施例1基本相同,不同之處在于:16sRNA通用引物的濃度為O.lymol/L;耐藥基 因 blaTEM引物的濃度為0.3ymol/L。
[0046] 實施例3
[0047]與實施例1基本相同,不同之處在于:16sRNA通用引物的濃度為0.2ymol/L;耐藥基 因 blaTEM引物的濃度為0.1ymol/L。
[0048] 實施例4
[0049] -種養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測方法,包括以下步驟:
[0050] (1)采集環(huán)境細菌檢測樣品:地面采樣,采樣點采用梅花式(7點法)分布,用5cmX 5cm無菌規(guī)格板,放在地面,采樣面積100cm2,用中和劑浸潤后的滅菌棉拭子一個,在規(guī)格板 內橫豎往返均勻涂擦各5次,并隨之轉棉拭子,剪去手接觸部位后,將棉拭子頭部放入10ml 含相應中和劑的無菌洗脫無菌洗脫液試管中,回化驗室檢測。
[0051 ] (2)提取環(huán)境中細菌基因組RNA:利用TRI pure LS Reagent試劑盒提取樣品基因 組 RNA;
[0052] 3)按常規(guī)方法用反轉錄試劑盒Reverse Transcription System將提取的樣品基 因組RNA反轉錄為cDNA;
[0053] 4)用上述熒光定量PCR MIX試劑進行Real-time PCR,儀器為LightCycler? 480Real-Time PCR System,反應體系為:熒光定量PCR MIX試劑 10yL、Primer-l 0.5yL、 Primer-2 0.5yL、cDNA lyL、無菌水補至20yL,其中16sRNA通用引物、blaTEM引物的濃度均 為0·5ymol/L;
[0054] 反應條件:PCR擴增時預孵育95°C,時間5min;變性溫度為95°C,反應時間為10s;擴 增溫度72°C,時間30s;循環(huán)數(shù)為45。反應結束后作熔解曲線分析。
[0055] 5)定量PCR反應結束后,根據(jù)Real-time PCR專用儀為LightCyC丨e#48〇n上裝有 MghtCycler:|i軟件對結果進行分析。根據(jù)耐藥基因 blaTEM基因和16sRNA通用的Ct值,通過 相對Ct法即2_Λ ^法,來計算b laTEM基因 mRNA的相對表達量。
[0056] 6)實驗結果如表1和圖1所示。
[0057] 表1某養(yǎng)雞場地面樣品中blaTEM基因檢測情況
[0059] 如表1所示,對某養(yǎng)雞場空舍期和養(yǎng)殖期地面樣品檢測結果表明,養(yǎng)殖期blaTEM基 因的表達水平明顯上調,養(yǎng)殖期4為空舍期的6.9倍,與空舍期差異顯著,通過這一檢測數(shù) 據(jù),可以輔助評價養(yǎng)禽場環(huán)境耐藥基因存在及消長情況。
[0060] 由圖1可知b laTEM基因引物熔解曲線顯示,引物特異性良好。
[0061 ] 實施例5
[0062]利用本發(fā)明的引物對不同菌株大腸桿菌blaTEM基因檢測,菌株具體為:blaTEM基 因陰性標準菌株、blaTEM基因陽性標準菌株和藥敏試驗結果陽性的分離菌株和藥敏試驗陰 性的分離菌株(其中1. blaTEM基因陰性標準菌株,2. blaTEM基因陽性標準菌株,3-7.藥敏試 驗陽性的分離菌株,8-10.藥敏試驗陰性的分離菌株)進行PCR擴增,具體結果見圖2。由圖2 可知耐藥基因 blaTEM基因陰性標準菌株和藥敏試驗結果陽性的分離菌株均出現(xiàn)特異性條 帶,而blaTEM基因陰性標準菌株和藥敏試驗陰性的分離菌株均未出現(xiàn)特異性條帶,
[0063]利用本發(fā)明的引物對不同菌株大腸桿菌16s RNA基因檢測結果,菌株具體為: b laTEM基因陰性標準菌株、b laTEM基因陽性標準菌株和藥敏試驗結果陽性的分離菌株和藥 敏試驗陰性的分離菌株(其中1. blaTEM基因陰性標準菌株,2. blaTEM基因陽性標準菌株,3- 7.藥敏試驗陽性的分離菌株,8-10.藥敏試驗陰性的分離菌株)進行PCR擴增,具體結果見圖 3。由圖3可知不同菌株大腸桿菌16s RNA基因檢測結果:10株大腸桿菌均檢出16s RNA基因。
[0064] 利用本發(fā)明的引物對腸道桿菌科不同細菌blaTEM基因檢測結果,7種細菌分別為: 1.大腸桿菌2.芽孢桿菌3.葡萄球菌4.克雷伯氏菌5.變形桿菌6.不動桿菌7.陰溝腸 桿菌,具體結果見圖4。由圖4可知大腸桿菌、變形桿菌、克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌檢測到 blaTEM基因,芽孢桿菌、葡萄球菌和不動桿菌未檢出該基因。由圖1-4可知,本發(fā)明的引物具 有良好的特異性。
[0065] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精 神和原則之內,所作的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒,其特征在于,包括熒光定 量PCRMIX試劑、16sRNA通用引物和耐藥基因 blaTEM引物; 所述的16 sRNA通用引物包括 16sRNA通用引物1:5'-CGTATCGGTCGCATTGTT-3', 16sRNA通用引物2:5 '-CTTCGTCCCATTTCAGGTT-3 ' ; 所述的耐藥基因 b 1 aTEM引物包括 耐藥基因 b 1 aTEM 引物 1:5 ' -CGGTATTATCCCGTGTTG-3 ' ; 耐藥基因 blaTEM引物2:5 '-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3 '。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒,其 特征在于:所述的16sRNA通用引物的濃度為0.1~0.5ymol/L;耐藥基因 blaTEM引物的濃度 為0·1~0·5ymol/L。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒,其 特征在于:所述的熒光定量PCR MIX試劑組成成分及含量分別為濃度為5U/yL的Taq聚合酶; 濃度均為200ymol/L的dNTP、濃度為25ymol/L的Mg 2+。4. 一種權利要求1-3任一項所述的一種焚光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的 試劑盒的用途:其特征在于:用于對內酰胺類藥物耐藥性進行定量檢測。5. 根據(jù)權利要求4所述的一種熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的試劑盒的 用途,其特征在于:所述的β-內酰胺類藥物為頭孢菌素。6. -種養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的檢測方法,其特征在于,利用權利要求1-3任一項所 述的試劑盒,包括以下步驟: (1) 采集環(huán)境細菌檢測樣品。 (2) 提取環(huán)境中細菌基因組RNA; (3) 將步驟(2)所得的基因組RNA反轉錄為cDNA; (4) 將步驟(3)得到的cDNA加入到熒光定量PCR檢測養(yǎng)禽場耐藥基因的檢測試劑盒,混 勻,進行PCR擴增; (5) PCR擴增結束后,根據(jù)熒光實時定量PCR儀對結果進行分析,根據(jù)耐藥基因 blaTEM和 16sRNA基因的Ct值,通過相對Ct法計算耐藥基因 mRNA的相對表達量,即為耐藥基因表達的 信息。7. 根據(jù)權利要求5所述的一種養(yǎng)禽場腸桿菌科耐藥基因的檢測方法,其特征在于:所述 的PCR擴增的條件為PCR擴增時預孵育95°C,時間5min;變性溫度為95°C,反應時間為10s;擴 增溫度72 °C,時間30s;循環(huán)數(shù)為45。
【文檔編號】C12Q1/02GK105936931SQ201610237208
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】沈美艷, 張廣斌, 孫秋艷, 李舫, 袁東芳, 于海
【申請人】山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院