專(zhuān)利名稱(chēng)：Ag85B,ESAT－6的嵌合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和新型疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種新型的結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)多肽疫苗，即將結(jié)核桿菌esat-6基因嵌合入ag85b基因內(nèi)，表達(dá)Ag85B，ESAT-6的嵌合亞單位疫苗。
背景技術(shù)：
結(jié)核病仍對(duì)人類(lèi)構(gòu)成巨大的威脅。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年約有800萬(wàn)～1000萬(wàn)新發(fā)病例，而每年死于結(jié)核病的患者高達(dá)300萬(wàn)人。結(jié)核病已成為全球頭號(hào)傳染病殺手。
我國(guó)結(jié)核病疫情較嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。2000年我國(guó)第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果分析，受感染人數(shù)超過(guò)4億。在未來(lái)的十年內(nèi)可能有3000萬(wàn)人發(fā)生結(jié)核病。調(diào)查顯示，我國(guó)結(jié)核病疫情仍相當(dāng)嚴(yán)重，且部分地區(qū)有蔓延趨勢(shì)。
卡介苗問(wèn)世已80余年，全球大多數(shù)國(guó)家將其列入計(jì)劃免疫接種項(xiàng)目。但它不能保護(hù)最常見(jiàn)的成人肺結(jié)核的發(fā)生。有資料表明BCG對(duì)成人的保護(hù)效果有印度南部的0％到英國(guó)的80％不等。盡管發(fā)表文獻(xiàn)綜合有效值為50％，但據(jù)估計(jì)其對(duì)結(jié)核病死亡的預(yù)防效果僅占5％，因此，研制新型結(jié)核疫苗迫在眉睫。
多種類(lèi)型的新型疫苗已被廣泛研究，包括重組BCG疫苗、營(yíng)養(yǎng)缺陷型結(jié)核分枝桿菌疫苗、蛋白質(zhì)多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒為載體的結(jié)核亞單位疫苗等。然而經(jīng)檢索，目前與本發(fā)明相似的疫苗尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種比目前市售卡介苗性能更佳的疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述疫苗的一種制備方法。
本發(fā)明的提供了一種嵌合亞單位疫苗，該疫苗中對(duì)應(yīng)ESAT-6的多肽序列與對(duì)應(yīng)Ag85B兩個(gè)抗原表位的多肽序列相連，并且位于Ag85B兩個(gè)T細(xì)胞抗原表位的多肽片段之間。
本發(fā)明的疫苗中，將ESAT-6的多肽片段插入到Ag85B第169～182位氨基酸位置，并且去除Ag85B第169～182位氨基酸，形成嵌合蛋白。
本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒中含有Ag85B蛋白T細(xì)胞抗原表位的編碼序列和ESAT-6蛋白的編碼序列，并且ESAT-6蛋白的編碼序列插入Ag85B兩個(gè)T細(xì)胞抗原表位的編碼序列之間。
本發(fā)明的疫苗中，含有Ag85B蛋白T細(xì)胞抗原表位的編碼序列和ESAT-6蛋白的編碼序列，并且ESAT-6蛋白的編碼序列插入到Ag85B第169～182位氨基酸的編碼序列位置，同時(shí)去除Ag85B第169～182位氨基酸的編碼序列。
對(duì)應(yīng)ESAT-6的多肽序列與對(duì)應(yīng)Ag85B兩個(gè)抗原表位的多肽序列包括對(duì)應(yīng)ESAT-6的多肽序列與對(duì)應(yīng)Ag85B兩個(gè)抗原表位的多肽序列及其被修飾后的多肽序列。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，基因編碼序列包括Ag85B蛋白T細(xì)胞抗原表位的編碼序列或者ESAT-6蛋白的編碼序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與Ag85B蛋白T細(xì)胞抗原表位的編碼序列或者ESAT-6蛋白的編碼序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出相應(yīng)的序列。本發(fā)明還包括對(duì)Ag85B蛋白T細(xì)胞抗原表位的編碼序列或者ESAT-6蛋白的編碼序列作常規(guī)修飾但不影響其表達(dá)產(chǎn)物功能的序列。
本發(fā)明根據(jù)Ag85B，ESAT-6的T細(xì)胞抗原表位，選擇合適位點(diǎn)將esat-6基因嵌合入ag85b基因內(nèi)，表達(dá)Ag85B，ESAT-6的嵌合亞單位疫苗。Ag85B基因登錄號(hào)BX842578.1；蛋白登錄號(hào)CAB10044.1；ESAT-6基因登錄號(hào)BX248347.1；蛋白登錄號(hào)CAD96091.1。
Ag85B，ESAT-6是結(jié)核桿菌重要的保護(hù)性抗原。其抗原表位已得到廣泛研究，其中ESAT-6的T細(xì)胞抗原表位位于蛋白分子的N端及第51～60氨基酸之間；Ag85B的T細(xì)胞抗原表位位于蛋白分子C端的第241～260氨基酸之間和第261～280氨基酸(是根據(jù)蛋白登錄號(hào)為CAB10044.1的蛋白序列，但不包括前面信號(hào)肽的40個(gè)氨基酸)之間。本發(fā)明依據(jù)Ag85B，ESAT-6的T細(xì)胞抗原表位，將ESAT-6插入到Ag85B第169～182氨基酸之間形成嵌合蛋白。即本發(fā)明用EAST-6替換了Ag85B的169-182氨基酸。
另一方面，本發(fā)明的提供了上述嵌合亞單位疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟(1)分別擴(kuò)增ag85b和esat-6基因；(2)用同樣的酶雙酶切ag85b和esat-6基因序列，并與載體相連，形成質(zhì)粒；(3)將(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并表達(dá)；(4)分離(3)獲得的重組質(zhì)粒，提取蛋白以獲得權(quán)利要求1所述的疫苗。
本發(fā)明中，該方法中雙酶切使用的酶是NruI和XhoI。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
本發(fā)明中，該方法中使用的載體可以是pET28a、pQE30或者pUC118等。
在連接ag85b和esat-6基因片段時(shí)，可以通過(guò)雙酶切將基因片段直接連接，也可先將基因片片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接形成質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切質(zhì)粒來(lái)達(dá)到連接ag85b和esat-6基因片段的目的。例如，將ag85b與載體連接形成重組質(zhì)粒后，雙酶切該重組質(zhì)粒和esat-6基因片段，并連接酶切產(chǎn)物；或者先將esat-6基因片段與載體連接形成重組質(zhì)粒后，雙酶切該重組質(zhì)粒和ag85b基因片段，并連接酶切產(chǎn)物。
本發(fā)明的Ag85B，ESAT-6的嵌合亞單位疫苗具有下列優(yōu)勢(shì)1.重組表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌兩個(gè)重要保護(hù)性抗原。
2.依據(jù)Ag85B，ESAT-6的T細(xì)胞抗原表位構(gòu)建嵌合蛋白，可減少因兩蛋白融合時(shí)結(jié)構(gòu)改變?cè)斐傻膶?duì)抗原表位的影響。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，這種新的嵌合蛋白疫苗與佐劑MPL-TDM共免疫小鼠后，IgG2a/IgG1的比例和IFN-γ的分泌都比Ag85B-ESAT-6融合蛋白(Ag85B-EAST-6融合蛋白的連接順序是直接頭尾相連后插入同一載體的)高，后者已被報(bào)道在結(jié)核桿菌感染后可以產(chǎn)生與BCG同等的保護(hù)效果。因此，Ag85B，ESAT-6嵌合亞單位疫苗有可能成為一種有效的新的蛋白多肽疫苗而用于結(jié)核分枝桿菌的預(yù)防。


圖1為重組蛋白的純化結(jié)果圖。M蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2表達(dá)A-E(即Ag85B-ESAT-6融合蛋白，Ag85B-EAST-6融合蛋白的連接順序是直接頭尾相連后插入同一載體的)和AN-E-AC(Ag85B，ESAT-6嵌合亞單位疫苗)的BL21菌體；3，4純化的A-E和AN-E-AC。
圖2為A-E和AN-E-AC免疫小鼠抗體水平的檢測(cè)結(jié)果圖。可見(jiàn)，AN-E-AC免疫的小鼠比Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫的小鼠抗體水平顯著增加。
圖3為A-E和AN-E-AC免疫小鼠IgG2a/IgG1的比例的檢測(cè)結(jié)果圖。可見(jiàn)，AN-E-AC免疫的小鼠脾細(xì)胞比Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫的小鼠的IgG2a/IgG1的比例更高。
圖4為A-E和AN-E-AC免疫小鼠脾細(xì)胞IFN-γ表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果圖。其中，“sfu”是(斑點(diǎn)形成數(shù))?？梢?jiàn)，AN-E-AC免疫的小鼠脾細(xì)胞比Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫的小鼠IFN-γ的分泌量顯著增加。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中未特定標(biāo)注的試劑和條件均采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)產(chǎn)品和方法。
實(shí)施例1 Ag85B，ESAT-6的嵌合亞單位疫苗的制備1.1結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組DNA的制備結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)在7H9Broth培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周，80℃，2小時(shí)滅活。用細(xì)菌DNA(小量)抽提試劑盒抽提基因組DNA。因結(jié)核菌的壁厚，細(xì)菌的消化時(shí)間延長(zhǎng)至3到5小時(shí)。
1.2結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株ag85b，esat-6基因的擴(kuò)增根據(jù)ag85b，esat-6基因及載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)如下ag85b上游5’TAAGAATTCTTCTCCCGGCCGG-G 3’EcoRI下游5’TAAGCGGCCGCTCAGCCGGCGCCT 3’NotIesat6上游5’TAATCGCGATGACAGAG-CAGCAGTG 3’NruI下游5’TAACTCGAGGCGAACATCCCAGTGA3’XhoIPCR反應(yīng)體系10×buffer 5μl，dNTPs 5μl，DNA模板1μl，引物各1μl，Taq酶0.25μl，水36.75μl。反應(yīng)條件94℃1min，66℃1min，72℃3min；共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
1.3載體pET28a、ag85b的酶切、連接及轉(zhuǎn)化載體pET28a、ag85b的PCR產(chǎn)物使用EcoRI和NotI雙酶切，37℃，4小時(shí)。用膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。T4DNA連接酶連接，16℃，過(guò)夜。制備E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞取DH5α單菌落于3mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接于30mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，0℃冷卻放置10min，5kr/min 4℃離心5min收集菌體，重懸于10ml0.1mol/LCaCl2中。冰浴20min，5kr/min 4℃離心5min收集菌體。加預(yù)冷0.1mlmol/LCaCl2冰浴放置1小時(shí)以上備用。將10ml連接產(chǎn)物加入200mlE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，37℃熱休克5min，立即冰浴2min，加入LB培養(yǎng)液800ml，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，然后涂布于含50μg/ml Kana的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單菌落分別接種于3ml含50μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收菌，抽提質(zhì)粒DNA。用EcoRI和NotI雙酶切鑒定。選取正確的重組子(簡(jiǎn)稱(chēng)PA)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
1.4重組子(PA)、esat6的酶切、連接及轉(zhuǎn)化重組子(PA)、esat6的PCR產(chǎn)物使用NruI和XhoI(TaKaRa Biotechnology Co.，NruID1168A，XhoID1094A)雙酶切。然后連接，轉(zhuǎn)化(同上)。選取正確的重組子進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。重組質(zhì)粒pET28a-ag85b(esat-6)測(cè)序，結(jié)果表明所插入序列和Gene Bank中相應(yīng)基因序列一致。
1.5重組質(zhì)粒pET28a-ag85B(esat-6)的轉(zhuǎn)化，表達(dá)及純化重組質(zhì)粒pET28a-ag85b(esat-6)轉(zhuǎn)化入E.coliBL21中(方法同上)。挑選單菌落分別接種于3ml含50μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100接種目的表達(dá)菌株至1LLB培養(yǎng)基中，220rpm，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入1.0mM IPTG，37℃培養(yǎng)4hr。收菌，SDS-PAGE電泳驗(yàn)證表達(dá)成功。超聲破菌(超聲1S，中止1S，200V，50個(gè)循環(huán))，收取上清及沉淀，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白主要在包涵體中。包涵體重懸于含有8M尿素，10mMTris-HCl(pH7.4)的緩沖液中，室溫溶解4hr，12,000g4℃離心40分鐘收集上清。將收集所得上清流過(guò)緩沖液A(8M urea，0.1M sodium phosphate buffer，0.01M Tris-HCl，pH 8.0)預(yù)先處理好的His-Bind-Ni2+-NTA柱，緩沖液A洗柱后，用緩沖液B(8M urea，0.1M sodiumphosphate buffer，0.01M Tris-HCl，pH 6.3)，緩沖液C(8M urea，0.1M sodium phosphate buffer，0.01M Tris-HCl，pH 4.5)洗脫，收集純化蛋白，超濾，測(cè)蛋白濃度。(圖1)實(shí)施例2 疫苗免疫小鼠并免疫指標(biāo)的測(cè)定用Ag85B，ESAT-6的嵌合亞單位疫苗(簡(jiǎn)稱(chēng)AN-E-AC)與佐劑MPL-TDM共免疫C57BL/c小鼠，同時(shí)分別用Ag85B-ESAT-6的融合亞單位疫苗(簡(jiǎn)稱(chēng)A-E)和Tris-MPL(即單磷酸內(nèi)酯A)-TDM(即海藻糖丙吡胺霉菌酸酯)作為對(duì)照。每?jī)芍苊庖咭淮?，共免疫三次。免疫后取血用ELISA法檢測(cè)血清抗體表達(dá)水平。無(wú)菌分離脾臟，應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞受到相應(yīng)蛋白刺激后IFN-γ的表達(dá)。它們分別反映了疫苗免疫后體液免疫和細(xì)胞免疫的水平。結(jié)果表明Ag85B，ESAT-6的嵌合亞單位疫苗和Ag85B-ESAT-6的融合亞單位疫苗組相比，所誘導(dǎo)的血清抗體水平(圖2)，IgG2a/IgG1的比例(圖3)和脾細(xì)胞IFN-γ表達(dá)(圖4)都有顯著的增高。這說(shuō)明AN-E-AC可以誘導(dǎo)較A-E高的體液和細(xì)胞免疫水平。
檢測(cè)血清抗體血清抗體的檢測(cè)用免疫酶標(biāo)技術(shù)(ELISA)。酶標(biāo)板分別用Ag85B-ESAT-6(5μg/well)，or Ag85B(ESAT-6)(5μg/well)包被4℃過(guò)夜。次日用含1％BSA的200μl/well PBS37℃封閉30min，含0.05％Tween 20的PBS洗三次，每次五分鐘。加入按2倍梯度從1/1000開(kāi)始稀釋的血清37℃2h，同上洗三次。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，IgG1和IgG2a，分別按1/10000，1/1000和1/1000用PBS稀釋?zhuān)?7℃1h，同上洗三次。用含1mg/mlOPD(鄰苯二胺)和0.03％過(guò)氧化氫的0.1M檸檬酸鹽緩沖液pH 5.0顯色，加入50μl/well of 1N H2SO4終止反應(yīng)。分光度492nm讀板。
檢測(cè)脾細(xì)胞IFN-γ脾細(xì)胞IFN-γ的檢測(cè)用ELISPOT技術(shù)。無(wú)菌分離小鼠脾細(xì)胞，懸浮在含10％的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)后按5×/105cells/well鋪板。每孔加100μl of70％乙醇室溫10min潤(rùn)濕PVDF膜，后加入50μl of稀釋的包被抗體4℃過(guò)夜。用5倍的洗滌緩沖液洗滌，加200μl封閉緩沖液，37℃封閉1h。5×105cells/well鋪板，at 37℃，5％CO2，100％濕度培養(yǎng)24小時(shí)。洗掉細(xì)胞后每孔加入100μl合適稀釋度的生物素標(biāo)記的抗體37℃1h。洗滌三次，加100μl/well合適稀釋度的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈球菌親和素，37℃1h。洗滌三次，加10μl的AEC(3-氨基-9-乙基吡咯)底物緩沖液，室溫15-30min。顯點(diǎn)后，用無(wú)菌水洗滌終止反應(yīng)。
結(jié)果顯示，本發(fā)明的嵌合蛋白疫苗與佐劑MPL-TDM共免疫小鼠后，小鼠抗體水平、小鼠脾細(xì)胞IgG2a/IgG1的比例和IFN-γ的分泌都比Ag85B-Esat-6融合蛋白顯著增加。
權(quán)利要求
1.一種含有Ag85B和ESAT-6多肽序列的嵌合亞單位疫苗，其特征在于，該疫苗中將ESAT-6的多肽片段插入到Ag85B第169～182位氨基酸位置，并且去除Ag85B第169～182位氨基酸，形成嵌合蛋白。
2.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒中含有Ag85B蛋白T細(xì)胞抗原表位的編碼序列和ESAT-6蛋白的編碼序列，并且ESAT-6蛋白的編碼序列插入到Ag85B第169～182位氨基酸的編碼序列位置，同時(shí)去除Ag85B第169～182位氨基酸的編碼序列。
3.如權(quán)利要求1所述的疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)分別擴(kuò)增ag85b和esat-6基因；(2)用同樣的酶雙酶切ag85b和esat-6基因序列，并與載體相連，形成質(zhì)粒；(3)將(2)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并表達(dá)；(4)分離(3)獲得的重組質(zhì)粒，提取蛋白以獲得權(quán)利要求1所述的疫苗。
4.一種如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，該方法中雙酶切使用的酶是NruI和XhoI。
5.一種如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，該方法中使用的載體是pET28a、pQE30或者pUC118。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和結(jié)核疫苗領(lǐng)域。近十幾年來(lái)由于結(jié)核耐藥株增多和結(jié)核分枝桿菌與HIV的共感染，導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病率增高，成為繼HIV之后人類(lèi)的第二大殺手。目前全球廣泛使用的唯一的結(jié)核病疫苗是BCG。本發(fā)明提供了一種新型Ag85B，ESAT－6嵌合蛋白疫苗。這種新的嵌合蛋白疫苗與佐劑MPL－TDM共免疫小鼠后，IgG2a/IgG1的比例和IFN－γ的分泌都比Ag85B－ESAT－6融合蛋白高，后者已被報(bào)道在結(jié)核桿菌感染后可以產(chǎn)生與BCG同等的保護(hù)效果。因此，Ag85B，ESAT－6嵌合亞單位疫苗有可能成為一種有效的新的蛋白多肽疫苗而用于結(jié)核分枝桿菌的預(yù)防。
文檔編號(hào)A61P31/06GK1923278SQ20061011605
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日
發(fā)明者王洪海, 徐穎, 王寶林, 王慶忠, 陳嘉臻, 祝秉東, 王九玲, 郄亞卿 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)