專(zhuān)利名稱(chēng)：適用于hpv和乙型肝炎感染的疫苗組合物以及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含單獨(dú)或組合使用的人乳頭瘤病毒(HPV)抗原和來(lái)源于所述抗原 的多肽并作為與細(xì)菌或病毒抗原的嵌合融合物形式的組合物，其可用于預(yù)防性和/或治療 性治療哺乳動(dòng)物、尤其是人類(lèi)的HPV以及乙型肝炎感染。本發(fā)明涉及一種藥物制劑，其能夠引發(fā)針對(duì)人乳頭瘤病毒感染(HPV)的保護(hù)性抗 體應(yīng)答和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。免疫原性制劑包含純化的重組HPV抗原于穩(wěn)定制劑中。本 發(fā)明還論述了使用單價(jià)、二價(jià)和多價(jià)嵌合疫苗引發(fā)保護(hù)性抗體應(yīng)答和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答 的方法。配制的免疫原性組合物適于在體內(nèi)投予人類(lèi)。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(HPV)是感染鱗狀上皮細(xì)胞和粘膜上皮細(xì)胞的雙鏈DNA病毒。由 “高風(fēng)險(xiǎn)”或致癌的HPV類(lèi)型引起的惡性上皮腫瘤可能進(jìn)展成惡性子宮頸癌(博斯(Bosch) 和德圣荷西(de Sanjose)，2003)。HPV的持續(xù)感染與進(jìn)展到侵襲性癌顯著相關(guān)?！案唢L(fēng)險(xiǎn)” 基因型可在低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low grade squamous intra印itheliallesion，LSIL) 到惡性腫瘤間有差別地進(jìn)展(斯奇利特(Schlecht)等人，2003)。HPV是子宮頸癌的主要 病因，據(jù)悉，約99. 7%的子宮頸癌病例都具有持續(xù)的HPV感染(沃布梅斯(Walboomers)等 人，1999)。HPV感染常發(fā)生于性活躍的年輕女性中間，并且超過(guò)95%的易發(fā)感染似乎都會(huì) 在一段時(shí)間內(nèi)自發(fā)消退。不到5%感染HPV16的女性發(fā)展成侵襲性子宮頸癌(斯奇利特 (Schlecht)等人，2003)。截至目前，已經(jīng)借助分子方法鑒別出近100類(lèi)HPV，并且超過(guò)35類(lèi)HPV是在生 殖道中鑒別出來(lái)的，在大多數(shù)國(guó)家，50%到60%的子宮頸癌病例是由HPV16引起，其次為 HPV18(10%到20% )以及HPV 31和45 (各4%到5% )。因此，在所有地理區(qū)域，HPV16是 最常見(jiàn)的類(lèi)型，HPV18緊隨其后，特別是在東南亞更為普遍。雖然在世界范圍內(nèi)，此種模式
(squamous cell carcinoma, SCC),{MX^TI/I^ (adenocarcinoma, ADC) 來(lái)說(shuō)，HPV18是最主要的，其次為HPV16(卡利福德(Clifford)等人，2003)。流行病學(xué)研究 顯示，存在數(shù)種HPV基因型的混合感染。其它研究也證實(shí)，與其它高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因型相比較，HPV 16的持續(xù)性更強(qiáng)(理查 德森(Richardson)等人，2003 ；朗德斯博(Londesborough)等人，1996)，并且進(jìn)展成CIN3 的可能性更大。因此，在基于HPV的子宮頸篩查程序中，基因分型可在分開(kāi)需要密切監(jiān)督的 HPV16(也可能是HPV18和其它基因型)陽(yáng)性L(fǎng)SIL病例與感染其它高風(fēng)險(xiǎn)基因型的LSIL病 例時(shí)起到診斷作用(卡利福德(Clifford)等人，2005)。基于有關(guān)年齡和類(lèi)型特異性HPV感染分布的可用流行病學(xué)數(shù)據(jù)的疫苗接種策略 可形成開(kāi)發(fā)有效疫苗以控制和根治人乳頭瘤病毒感染的基礎(chǔ)。賦予針對(duì)多種基因型的廣 泛保護(hù)性功效的候選疫苗應(yīng)成為進(jìn)行有效疫苗接種的策略。使用Ll衣殼蛋白的可用疫苗 對(duì)于HPV16、HPV18、HPV6和HPVll具有類(lèi)型特異性，但不能充分保護(hù)由例如HPV31、HPV35、 HPV52、HPV58等也與進(jìn)展成子宮頸癌相關(guān)的其它基因型所引起的感染。目前，還沒(méi)有能夠提供針對(duì)多種HPV基因型的交叉保護(hù)的HPV疫苗。包含重組HPV Ll病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)的兩種預(yù)防性疫苗已 經(jīng)獲得批準(zhǔn)。這兩種疫苗僅靶向約15種已知致癌性HPV類(lèi)型中的兩種。盡管約70%的子 宮頸癌病例是由這兩種類(lèi)型引起，而且有證據(jù)顯示，對(duì)其它密切相關(guān)的類(lèi)型存在某種程度 的交叉保護(hù)，但當(dāng)前這些疫苗的成本阻礙了持續(xù)的全球傳遞，尤其是在HPV感染發(fā)生率很 高的第三世界國(guó)家。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供一種適用于乙型肝炎病毒以及人乳頭瘤病毒(HPV)感染的疫苗 組合物，其包含HPV抗原與賦予較強(qiáng)免疫原性的病毒或細(xì)菌蛋白的嵌合融合物。HPV抗原可選自包含(但不限于)以下各項(xiàng)的群組HPV16、HPV18、HPV6、HPVlU HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。包含HPV抗原的完整/部分序列/突變體/變異體的抗原性組合物可選自包含以 下各項(xiàng)的清單L1、L2、E2、E5、E6和E7抗原，或者所述抗原的特異性T細(xì)胞或B細(xì)胞表位， 這些可以是單一序列，或者是與細(xì)菌/病毒蛋白的在投予宿主時(shí)能夠誘發(fā)強(qiáng)抗體應(yīng)答的嵌 合融合物中的串聯(lián)重復(fù)序列。所述病毒和細(xì)菌蛋白可選自包括(但不限于)以下各項(xiàng)的清單中的一種或者組合 或者來(lái)源于清單中蛋白質(zhì)的表位乙型肝炎抗原(例如乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎小抗 原)、失活的破傷風(fēng)類(lèi)毒素(tetanus toxoid)、白喉類(lèi)毒素(diphtheria toxoid)、大腸桿菌 不而才熱毒素、霍舌L毒素(cholera toxin)、綠月農(nóng)桿菌夕卜毒素A (Pseudomonas exotoxinA)、志 賀毒素(Shiga toxin)、李斯特菌素(Iisterolysin)?？乖越M合物是由HPV抗原與乙型肝炎小抗原(HbsAg)的嵌合融合物組成。HPV抗原包含例如Ll和L2等衣殼蛋白的完整或部分序列/表位，或者來(lái)源于其 Ll和/或L2的多肽，且與HbsAg融合，如SEQ ID N0. 3到SEQ ID N0. 13中所示。HPV抗原包含單獨(dú)或組合形式的HPV早期蛋白(例如E2、E5、E6和E7)的完整/ 部分序列/突變體/變異體/表位，如SEQ ID No. 1和2所示。HPV抗原與乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者開(kāi)放閱讀框內(nèi)的任何區(qū)域融合， 其中在這兩個(gè)序列之間添加有或不添加連接子序列。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供一種表達(dá)上述技術(shù)方案1的HPV和HPV-HBsAg嵌合抗 原的方法，其包含培養(yǎng)經(jīng)技術(shù)方案1的抗原/融合抗原轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從所述宿主細(xì)胞中 分離出重組蛋白并純化。上述HPV抗原可在宿主中重組表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)蛋白或分泌蛋白，所述宿主可以是原 核或真核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選酵母。一種藥物組合物，其包含有效量的可用作疫苗的如上文所揭示的抗原性組合物， 以及藥學(xué)上可接受的載劑。抗原的用量在每劑IOyg至IJ IOOOyg蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)，優(yōu)選介于10 μ g至IJ 200 μ g 之間，最優(yōu)選介于IOyg到IOOyg之間。所述藥物組合物另外包含適合的佐劑，所述佐劑選自以下各項(xiàng)中的至少一種氫 氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰脂A、其它有機(jī)親脂性化合物、含有CpG和非CpG的低聚核苷酸、細(xì)胞因子。一種引發(fā)對(duì)于根據(jù)前述技術(shù)方案中任一技術(shù)方案所述的抗原性組合物的保護(hù)性 抗體應(yīng)答和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包含借助例如經(jīng)口、粘膜或腸胃外投藥途徑 等途徑中的至少一種途徑，將所述組合物投予需要所述治療的個(gè)體。上述抗原性組合物是以藥學(xué)上可接受的生物可降解聚合物實(shí)現(xiàn)。一種上述抗原制劑的用途，其可用于預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng)物、尤其是人類(lèi) 的乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。


圖1 描述乙型肝炎小抗原OfepBsAg)基因的PCR擴(kuò)增。泳道1 約700bp的HbsAg 基因；泳道2 IOObp的DNA梯狀條帶。圖2 描述用于構(gòu)建嵌合HbsAg-HPV嵌合體的E6和E7合成基因片段的多表位序 列的PCR擴(kuò)增。泳道1 約150bp的多表位基因片段，由129bp的多表位序列組成；泳道2 IOObp的DNA梯狀條帶。圖3 描述用于產(chǎn)生嵌合HbsAg-HPV序列的HPV16L2的PCR擴(kuò)增；約530bp的基因 片段，由510bp的HPV16L2基因組成；泳道2 IOObp的DNA梯狀條帶。圖4 描述對(duì)應(yīng)于L2基因的氨基酸100-220的HPV16L2片段的PCR擴(kuò)增，獲得含 有360bp特定序列的約380bp的PCR片段。圖5 說(shuō)明99bp HPV16L1基因片段的PCR擴(kuò)增，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到約120bp的片 段。對(duì)應(yīng)于L2基因的氨基酸100-220，獲得含有360bp特定序列的約380bp的PCR片段。圖6 說(shuō)明HPV18L1基因的PCR擴(kuò)增，得到由117bp HPV18L1序列組成的約140bp 的片段。圖7 描述HPV18L1基因的PCR擴(kuò)增，得到由480bp HPV18L1片段組成的約500bp 的片段。圖8 顯示嵌合HbsAg-HPV蛋白的表達(dá)水平，是在畢赤酵母(Pichia pastoris)的 誘導(dǎo)培養(yǎng)物中借助ELISA法針對(duì)HbsAg含量所檢測(cè)，并視為嵌合蛋白的表達(dá)的量度。圖9 涉及嵌合HbsAg-HPV蛋白的表達(dá)水平，是在畢赤酵母的誘導(dǎo)培養(yǎng)物中借助 ELISA法針對(duì)HPV抗原含量所檢測(cè)。圖10 使用HPV特異性ELISA法，使用針對(duì)市售的四價(jià)疫苗而產(chǎn)生的初級(jí)抗體和 對(duì)于HPV16L2，針對(duì)純化蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的兔抗血清檢測(cè)的嵌合蛋白的免疫原性。圖11 使用HbsAg特異性ELISA法，使用市售的試劑盒檢測(cè)的嵌合蛋白的免疫原 性。使用針對(duì)純化的L2蛋白而產(chǎn)生的兔抗血清來(lái)估計(jì)針對(duì)含有HPV16L2蛋白的構(gòu)建體的 抗體滴度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涵蓋用于人類(lèi)的人乳頭瘤病毒感染的預(yù)防性和治療性疫苗候選物的開(kāi)發(fā)。 現(xiàn)有技術(shù)已知，當(dāng)在體外表達(dá)成重組蛋白時(shí)，HPV的主要衣殼蛋白Ll蛋白可單獨(dú)或與次要 衣殼蛋白L2組合組裝成病毒樣顆粒(VLP)。這些病毒樣顆粒具有免疫原性，并且已被用 作預(yù)防人類(lèi)HPV感染的疫苗。子宮頸癌是由數(shù)種“致癌性” HPV類(lèi)型引起，這些HPV類(lèi)型包括 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、 HPV68等。包含Ll衣殼蛋白的VLP是良好的疫苗候選物，但識(shí)別VLP上的特定結(jié)構(gòu)表位的 抗體具有基因型特異性，而且針對(duì)一種VLP類(lèi)型的抗體對(duì)于其它HPV基因型具有極少或沒(méi) 有交叉反應(yīng)性。然而，數(shù)種HPV基因型的混合感染是很常見(jiàn)的。本發(fā)明的范圍是開(kāi)發(fā)一種廣譜疫苗，其可提供針對(duì)與子宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的主要 HPV類(lèi)型的保護(hù)性免疫。鑒于次要的HPV衣殼蛋白L2中存在較高的序列保守性，故L2蛋白 可潛在地提供針對(duì)數(shù)種病毒基因型的廣泛中和活性。然而，與Ll的結(jié)構(gòu)表位具有較高抗原 性不同，L2蛋白的免疫原性相對(duì)較弱。L2蛋白在天然衣殼蛋白中的低豐度，即每360個(gè)Ll 拷貝約12到72個(gè)分子，限制了其免疫原性(皮埃拉(Pereira)等人，2009)。一種以較低成 本擴(kuò)大免疫性的可能方法是考慮針對(duì)L2進(jìn)行疫苗接種。L2疫苗的制造相對(duì)便宜，并且也有 望賦予比利用LlVLP免疫所觀(guān)察到的免疫范圍廣得多的交叉型保護(hù)性免疫(坎達(dá)(Kanda) 和肯度(Kondo) 2009)。HPV的次要衣殼蛋白L2在病毒進(jìn)入細(xì)胞、病毒組分定位于細(xì)胞核、 DNA結(jié)合、衣殼形成和穩(wěn)定性方面起到重要作用，它所引出的抗體在各類(lèi)HPV之間的交叉反 應(yīng)性高于主要衣殼蛋白Li，這些使得其成為針對(duì)HPV感染的新一代更廣泛保護(hù)性亞單位疫 苗的引人注目的潛在目標(biāo)。本發(fā)明一個(gè)目的在于，通過(guò)利用與病毒和細(xì)菌蛋白的嵌合融合而提供抗原表位的 多個(gè)拷貝來(lái)增強(qiáng)免疫原性，由此增加候選疫苗的免疫原性。截至目前，市面上還沒(méi)有針對(duì) HPV感染的多表位疫苗。由于在病毒的不同基因型間衣殼蛋白與早期蛋白的抗原表位存在 高序列保守性，故使得多表位疫苗有利于提供廣泛的保護(hù)活性。由乙型肝炎小抗原(HbsAg)形成的病毒樣顆粒是一種多聚體(multimeric)結(jié)構(gòu)， 當(dāng)作為針對(duì)乙型肝炎病毒感染的疫苗投予時(shí)，其具有高免疫原性。VLP的結(jié)構(gòu)允許將來(lái)自其 它蛋白質(zhì)的異源序列插入其開(kāi)放閱讀框中的個(gè)別位置，從而可使用蛋白質(zhì)與HbsAg的嵌合 融合物用作潛在疫苗候選物。HPV抗原包括衣殼蛋白Ll和L2，以及早期蛋白，例如E1、E2、 E5、E6和E7。這些蛋白質(zhì)可由單獨(dú)或組合形式的HPV L1、L2、E1、E2、E5、E6和E7蛋白的完 整/部分序列/突變體/變異體/表位組成。這些候選蛋白質(zhì)的T細(xì)胞或B細(xì)胞表位可單 獨(dú)使用或以串聯(lián)重復(fù)序列的形式使用，并且與HbsAg融合，用作供HPV疫苗接種的疫苗候選 物。HPV抗原與乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者開(kāi)放閱讀框內(nèi)的任何區(qū)域融合，其中 在這兩個(gè)抗原之間添加有或不添加連接子序列。迄今為止，尚無(wú)有關(guān)HPV衣殼蛋白與HbsAg的嵌合融合物的報(bào)導(dǎo)。次要HPV衣殼 蛋白L2與HbsAg的嵌合體是一種引人注目的疫苗候選物，因?yàn)楸M管L2蛋白可賦予針對(duì)多 種病毒基因型的廣泛中和活性，但它由于是線(xiàn)性多肽而本身為弱抗原。負(fù)責(zé)針對(duì)多種HPV 病毒基因型的廣泛中和活性的L2區(qū)是以多聚體拷貝的形式呈現(xiàn)于HbsAg的VLP上，鑒于在 VLP上多個(gè)拷貝的呈現(xiàn)，故相比于以單一拷貝存在時(shí)，增加了免疫原性。所選用于與HbsAg 形成嵌合構(gòu)建體的HPV16和HPV18L1蛋白的區(qū)域也為對(duì)其它基因型具有廣泛中和活性并且 能潛在地提供交叉保護(hù)的區(qū)域。我們已經(jīng)利用了 HbsAg在自組裝成病毒樣顆粒后，仍允許 利用其它蛋白質(zhì)與異源序列進(jìn)行嵌合融合的柔性。還制備出HbsAg與HPV E6和E7蛋白的 B細(xì)胞和T細(xì)胞表位(以串聯(lián)形式存在以增加免疫原潛力)以及與HPV16和HPV18的Ll和 L2蛋白的嵌合體。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)過(guò)HPV E7的個(gè)別區(qū)域與HbsAg蛋白的嵌合構(gòu)建體。我們使用 了來(lái)源于HPV的E6和E7蛋白的多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，因?yàn)檫@些序列以串聯(lián)形式存在時(shí)所引發(fā)的免疫原性高于以單一拷貝形式存在的情形。它們?cè)贖bsAg的多聚體VLP上的存 在又會(huì)增加呈現(xiàn)于VLP上的拷貝數(shù)，這進(jìn)一步增加其免疫原性，并代表一種優(yōu)良的疫苗候 選物。已知B細(xì)胞和T細(xì)胞表位可引發(fā)強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，從而有望成為針對(duì)HPV感 染的優(yōu)良治療性疫苗。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將確定，以下候選物也可用于與利用HPV抗原的嵌合序列類(lèi) 似的策略中，以便增加其疫苗潛力。候選物的清單包括(但不限于)乙型肝炎核心抗原、 失活的破傷風(fēng)類(lèi)毒素、白喉類(lèi)毒素、大腸桿菌不耐熱毒素、霍亂毒素、綠膿桿菌外毒素A、志 賀毒素、李斯特菌素、熱激蛋白、鈣網(wǎng)蛋白，或來(lái)源于上述蛋白質(zhì)的表位。上述蛋白質(zhì)可在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)或分泌蛋白。在工業(yè)規(guī)模 上，畢赤酵母宜作為表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)槠淇晒?jié)省成本，并且由畢赤酵母表達(dá)和純化得到的幾種 蛋白質(zhì)由于能夠安全用于人類(lèi)而已經(jīng)成功商業(yè)化。此系統(tǒng)適用于任一種屬的酵母。HPV抗原 與HAS(人血清白蛋白)的分泌信號(hào)的嵌合融合使培養(yǎng)基中所述蛋白質(zhì)的合成和分泌增加， 這使得不僅能夠進(jìn)行高水平表達(dá)，而且還易于在工業(yè)發(fā)酵規(guī)模上純化出所述蛋白質(zhì)。HSA的 N末端序列可與畢赤酵母中的高水平合成和高效率分泌相適應(yīng)。使用專(zhuān)有的Himax 技術(shù) 純化病毒抗原，便于以節(jié)省成本的方法分離出HbsAg-HPV嵌合抗原，尤其是VLP，所述節(jié)省 成本的方法能安全用于人類(lèi)，而且在工業(yè)規(guī)模上，比在氯化銫上的常規(guī)密度梯度超速離心 法更經(jīng)濟(jì)。這將能夠制造出低成本疫苗，并且環(huán)保，避免了如氯化銫等重金屬的使用。所述蛋白質(zhì)被表達(dá)為VLP、殼粒(capsomere)、多肽或包含HPV和細(xì)菌/病毒抗原 的嵌合多肽。以單一序列并入或以串聯(lián)重復(fù)序列形式呈與細(xì)菌/病毒蛋白的嵌合融合物 并入的所述抗原在投予宿主時(shí)，能誘導(dǎo)強(qiáng)的抗體應(yīng)答或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。含有串聯(lián)的 T細(xì)胞和B細(xì)胞表位拷貝的亞單位免疫原的免疫原性可能高于這些細(xì)胞表位以單一拷貝出 現(xiàn)的情形。如借助ELISA法所測(cè)定，與E6和E7表位以及與L2和Ll蛋白形成的嵌合構(gòu)建 體針對(duì)HbsAg和HPV表位都引發(fā)了強(qiáng)抗體應(yīng)答。這提供了疫苗的雙重用途，即針對(duì)乙型肝 炎以及多種HPV病毒基因型。上述蛋白質(zhì)的抗原性組合物以藥學(xué)上可接受的載劑配制，以便用于人類(lèi)免疫。所 述抗原制劑可單獨(dú)投予，或與選自包括(但不限于)以下各項(xiàng)的清單的佐劑一起投予氫氧 化鋁、磷酸鋁、單磷酰脂A、其它有機(jī)親脂性化合物、含有CpG和非CpG的低聚核苷酸、細(xì)胞因 子等?；蛘撸乖苿┛砂瑑煞N或兩種以上純化的抗原，這些抗原在體外混合于適合的制 劑中，并用作疫苗?？乖苿┛山柚鷶?shù)種方法中的一種，通過(guò)經(jīng)口、粘膜或腸胃外途徑遞送 給哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類(lèi)個(gè)體，以便引發(fā)保護(hù)性抗體應(yīng)答和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答?？乖?可以藥學(xué)上可接受的生物可降解聚合物遞送。上述制劑可用于預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng) 物的乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。HPV透過(guò)粘膜細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)，并且不會(huì)全身擴(kuò)散。因此，HPV疫苗有可能在生殖器 粘膜誘發(fā)強(qiáng)烈而且持續(xù)的免疫應(yīng)答。在這點(diǎn)上，動(dòng)物中的鼻和口腔免疫研究顯示，VLP可誘 導(dǎo)生殖器粘膜中的抗體。賦予針對(duì)HPV抗原的粘膜免疫性的疫苗有利于預(yù)防HPV感染。將 對(duì)適于疫苗的粘膜遞送的制劑進(jìn)行測(cè)試。市面上還沒(méi)此類(lèi)供粘膜應(yīng)用的HPV疫苗。本發(fā)明 將利用以下實(shí)例進(jìn)一步予以說(shuō)明。然而，這些實(shí)例只出于說(shuō)明的目的，并且不應(yīng)解釋保護(hù)范 圍。實(shí)例
1.實(shí)例1 克隆策略a) mi 來(lái)源干早期蛋白的多表擬與HbsAg的嵌合融合本序列是由乙型肝炎小抗原與來(lái)源于HPV16和HPV18E7蛋白的串聯(lián)的多表位融 合，隨后所述多表位與HbsAg蛋白的C末端和N末端嵌合融合而組成。(HbsAg蛋白序列MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYI) ·以下來(lái)源于E7和/或E6蛋白的表位串聯(lián)排列，得到5 ‘ EYMLDLQPETTEEDEID GPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL 3'，即43個(gè)氨基酸(129個(gè)核苷酸)。這個(gè)主要表位是 以下各項(xiàng)的組合，并選自T細(xì)胞和B細(xì)胞表位清單HPV16E7T細(xì)胞表位氨基酸20-29 TDLYCYEQLN ；氨基酸 45-54AEPDRAHYNI ；B 細(xì)胞表位氨基酸 10-20 :EYMLDLQPETT ；氨基酸 35-49EEDEIDGPAGQAEPDR ；與 HPV18E7B 細(xì)胞表位 DEIDGVNHQHL 融合，所述 HPV18E7B 細(xì)胞表 位是HPV18E7的免疫優(yōu)勢(shì)(immunodominant)表位，由此獲得下述指定為SEQ ID No. 1的嵌 合融合物。類(lèi)似地，所述多表位與HbsAg的N末端融合得到的嵌合融合物為SEQ ID No. 2 中提供的序列。在所述多表位的5'端引入翻譯起始子甲硫氨酸來(lái)用于起始翻譯。SEQ ID No. 1MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL-SEQ ID NO. 2 MEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHLGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTR ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQ GMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSL LVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI-b)策略2 次要衣殼蛋白L2與HbsAg的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區(qū)域與HbsAg的C末端融合。擴(kuò)增的L2區(qū)域?yàn)橄率?在HbsAg的C末端融合的具有171個(gè)氨基酸的序列(引入起始子甲硫氨酸以促進(jìn)翻譯)MSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFID AGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHN YEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRSEQ ID No. 3 MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAG APTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEE IPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR-
SEQ ID No. 4 將包含下述具有171個(gè)氨基酸的序列的次要衣殼蛋白序列L2在其C末端與HbsAg 的N末端融合，得到SEQ ID No. 4。添加起始子甲硫氨酸以便翻譯。5 ‘MSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDA GAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYE EIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPG QNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTC TMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYff GPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI 3'c)策略3 :L2片段的嵌套缺失體與HbsAg的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區(qū)域與HbsAg的C末端融合。擴(kuò)增的L2區(qū)域是下述 具有約120個(gè)氨基酸(360bp)的序列SDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVL QPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR將其連接至HbsAg的C末端，得到SEQ ID No. 5。SEQ ID No. 5 5 ‘MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVL QPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR 3‘SEQ ID No. 6 將包含下述具有120個(gè)氨基酸的序列的次要衣殼蛋白序列L2 SDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVL QPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR在其C末端與HbsAg的N末端嵌合融合，得到SEQ ID NO. 6。添加起始子甲硫氨酸 以便翻譯。MSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSV LQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTR ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQ GMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSffAFARFLffEffASVRFSffLSL LVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI 3‘d)策略4 :HPV16的Ll區(qū)與HbsAg的嵌合融合由以下來(lái)源于HPV16蛋白Ll區(qū)的33個(gè)氨基酸(99bp)的序列組成的HPV16蛋白 的 Ll 區(qū)在 HbsAg 的 C 末端發(fā)生嵌合融合NTVIQD⑶MVDTGFGAMDFITLQANKSEVPLDISEQ ID No. 75 ‘
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLffAYIGS NTVIQD⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI 3'由以下來(lái)源于HPV16L1區(qū)的33個(gè)氨基酸的序列組成的HPV16蛋白Ll區(qū)N1VIQD ⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI與HbsAg的N末端嵌合融合，得到嵌合序列SEQ ID No. 8。 添加起始子甲硫氨酸以便翻譯。SEQ ID No. 8 5 ‘ MNTVIQD⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDIGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQ SLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVC PPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPFVQ WFVGLSPTVWLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI3'e)策略5 :HPV18的Ll區(qū)與HbsAg的嵌合融合具有以下序列的HPV18L1蛋白的區(qū)域(39個(gè)氨基酸；117bp)5' PPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 3'與HbsAg序列的C末端嵌合融合，由此得到以下嵌合序列SEQ ID NO. 9 5 ‘MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSPPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 3‘將其與HbsAg蛋白的N末端融合，得到SEQ ID NO. 10，其中添加起始子甲硫氨酸以 便翻譯。SEQ ID NO. 10 5 ‘MPPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDIGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTI PQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLP VCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPF VQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYIf)策略6 :HPV18L1區(qū)的較大多肽與HbsAg的嵌合融合由以下序列組成的較大HPV18片段ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶MVD TGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPY⑶SMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM⑶TVPQSLYIK GTGMRAS PGSCVYSPS在其N(xiāo)末端與HbsAg的C末端嵌合融合，由此得到嵌合序列SEQ ID NO. 11 5'MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶MVDT GYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGT GMRASPGSCVYSPS 3'由以下序列組成的較大HPV18片段5'ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVD TGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPY⑶SMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM⑶TVPQSLYIK GTGMRASPGSCVYSPS 3'在其C末端與HbsAg的N末端嵌合融合，由此得到嵌合序列SEQ ID 12 SEQ ID No. 12 MATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQ⑶CPPLELKNTVLEDGDMVD TGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM⑶TVPQSLYIKG TGMRASPGSCVYSPSGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHS PTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFP SCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLffEWASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIffMMWYffGPSLYNILSPF LPLLPISCCLWAYI策略7 全長(zhǎng)HPV16L1蛋白序列在其N(xiāo)末端與用于在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)的人血清白 蛋白的具有24個(gè)氨基酸的信號(hào)序列嵌合融合，得到SEQ ID NO. 13。SEQ ID NO. 13 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLIA VGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHP LLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNP⑶CPPLELINTVIQDG DMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPY⑶SLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDL YIKGSGSTANIASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRST匪SLCAAISTSE TTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQ KHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKLSEQ ID NO. 14 全長(zhǎng)HPV16L2蛋白序列在其N(xiāo)末端與用于在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)的人血清白 蛋白的具有24個(gè)氨基酸的信號(hào)序列嵌合融合，得到SEQ ID NO. 14。MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQ ILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPT PVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPM DTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDNSI NIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDFSTIDPAEEIELQTITPSTYTTT SHAASPTSINNGLYDIYADDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIP IVPGSPQYTIIADAGDFYLHPSYYMLRKRRKRLPYFFSDVSLAA
12
SEQ ID NO. 15 全長(zhǎng)HPV18L1蛋白序列在其N(xiāo)末端與用于在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)的人血清白 蛋白的具有24個(gè)氨基酸的信號(hào)序列嵌合融合，得到SEQ ID NO. 15 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSLWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTV GNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPF YNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶ MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYOTSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLY IKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVP GQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAITCQ KDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTSSKPAKRVRVRARK2.實(shí)例2 基因克隆和HbsAg-HPV抗原嵌合體的構(gòu)建a)利用分別含有EcoRl和BamHl限制性位點(diǎn)的N末端和C末端引物，借助PCR擴(kuò) 增編碼全長(zhǎng)HbsAg蛋白的乙型肝炎基因，得到約700bp的PCR片段(參看圖1)。HbsAg基 因的PCR擴(kuò)增使用的引物為HB N 末端(HBNTERM)5’ CACGAATTCACCATGGAGAACACAACATCAGG 3’HB C 末端(HBCTERM)5’ TCAGGATCCAATGTATGCCCAAAGACAACAGG 3’PCR擴(kuò)增的條件為在94°C下變性45秒，在65°C下退火40秒并在72°C下延伸1. 5 分鐘，持續(xù)30個(gè)循環(huán)，隨后在72°C下進(jìn)行最后一次延伸，持續(xù)10分鐘。IOng將HbsAg基因 克隆到pBluescript SKII+中得到的質(zhì)粒DNA用作PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)物由Ix TaqDNA 聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、20皮摩爾各引物和1.5U Taq DNA聚合酶組成。所有試劑都 來(lái)自班加羅爾_吉奈公司(Bangalore Genei)。對(duì)PCR片段進(jìn)行凝膠純化，并用BamHl消 化。使用經(jīng)BamHl消化的HbsAg PCR片段來(lái)與各種HPV抗原連接，得到嵌合構(gòu)建體。為了 構(gòu)建在C末端帶有HbsAg基因且在N末端帶有HPV抗原的嵌合構(gòu)建體，利用含有Notl位 點(diǎn)的C末端引物和含有BamHl位點(diǎn)的N末端引物，借助PCR擴(kuò)增HbsAg。在用于PCR擴(kuò)增 的構(gòu)建體(其中HPV抗原在N末端且HbsAg在C末端)中，針對(duì)HPV抗原的PCR弓丨物在其 N末端含有EcoRl位點(diǎn)，且在其C末端含有BamHl位點(diǎn)。在兩種情況下，通過(guò)連接兩個(gè)序列 的BamHl端，來(lái)使HbsAg基因片段與HPV基因片段發(fā)生嵌合融合。BamHl位點(diǎn)在HbsAg-HPV 序列的接點(diǎn)處引入兩個(gè)氨基酸“GS” (甘氨酸-絲氨酸)。本發(fā)明中描述的所有嵌合融合物 (SEQ IDNo. 1到SEQ IDNo. 15)都是在核苷酸水平上使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)以及連接PCR擴(kuò)增基因得到。借助PCR法擴(kuò)增以下HPV基因片段以便連接多表位序列的克降EYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL,即 43 個(gè)氨基酸(129 個(gè)核苷 酸)。在金斯瑞公司(GenScript Corporation)合成編碼上述序列的合成基因片段。利用 以下引物擴(kuò)增所述基因片段，這些引物在N末端引入BamHl位點(diǎn)且在C末端引入Notl位 點(diǎn)。使PCR反應(yīng)物在94°C下變性45秒，在62°C下退火45秒，并在72°C下延伸30秒，持續(xù) 33個(gè)循環(huán)，由此得到含有129bp表位序列的約140bp的PCR片段。
ME N 末端(MENTERM)引物5' ATAGGATCCGAGTACATGTTGGATTTG 3'ME C 末端(MECTERM)引物5' ATCGCGGCCGCTTATCACAAATGTTGGTGGTTG 3'對(duì)使用上述引物得到的129bp PCR片段(參看圖2)進(jìn)行凝膠純化，并用BamHl消 化。使用T4DNA連接酶將經(jīng)BamHl消化的PCR片段連接至經(jīng)BamHl消化的HbsAg基因過(guò)夜， 由此得到約840bp的嵌合片段，其翻譯序列指定為SEQ ID NO. 1。對(duì)恰當(dāng)尺寸(約840bp) 的連接片段進(jìn)行凝膠純化，用EcoRl和Notl消化，以便克隆到酵母載體pPIC3. 5K中。為了 產(chǎn)生SEQ ID NO. 2(其中多表位序列連接于HbsA基因的5'端)，制備出具有類(lèi)似序列的引 物，但C末端引物帶有BamHl位點(diǎn)而非Notl位點(diǎn)，并且在N末端引物中，利用EcoRl代替 BamHl位點(diǎn)。用BamHl消化約140bp的PCR產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將其與經(jīng)BamHl消化的 HbsAg連接過(guò)夜。對(duì)連接得到的約840bp的片段(指定為SEQ ID NO. 2)進(jìn)行凝膠純化，用 EcoRl和Notl消化，以便克隆到酵母表達(dá)載體pPIC3. 5K中。HPV16L2片段在HbsAg的C末端的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區(qū)域與HbsAg的C末端融合。在金斯瑞公司合成 HPV16L2基因。擴(kuò)增的L2區(qū)域?qū)?yīng)于氨基酸50-220 (510bp)，并將其連接于HbsAg的C末 端，產(chǎn)生SEQ ID NO. 3。為了將L2基因片段連接至HbsAg基因的C末端，利用含有BamHl位 點(diǎn)的類(lèi)似N末端引物和含有Notl位點(diǎn)的C末端引物，借助PCR擴(kuò)增編碼L2蛋白的基因。用 BamHl消化PCR擴(kuò)增得到的約530bp的片段，并與經(jīng)BamHl消化的在C末端帶有BamHl位點(diǎn) 的HbsAg連接。對(duì)連接得到的約1230bp片段進(jìn)行凝膠純化，并用EcoRl和Notl消化，以便 克隆到酵母載體PPIC3. 5K中。為了產(chǎn)生HPV-HbsAg嵌合構(gòu)建體，利用具有類(lèi)似序列的引物擴(kuò)增L2基因(氨基酸 位置50-220bp)，但N末端引物帶有EcoRl位點(diǎn)而非BamHl，且C末端引物含有BamHl位點(diǎn) 而非Notl。如上文所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增、消化，得到SEQ ID NO. 4。HPV16L2片段的嵌套缺失體在HbsAg的C末端的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區(qū)域與HbsAg的C末端融合。擴(kuò)增的L2區(qū)域?yàn)?00 到220位的氨基酸(120個(gè)氨基酸；360bp)。L2基因片段的PCR擴(kuò)增使用的引物為6P2CF N 末端(6P2CFNTERM)5' ACCGGATCCGATCCATCTATCGTTTC 3'6P2CF C 末端(6P2CFCTERM)5' ATCGCGGCCGCTTATCATCTTGAACCTGGAATTG 3'PCR反應(yīng)在含有Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP以及20皮摩爾各引物和 1. 5U Taq DNA聚合酶的50 μ L體積中進(jìn)行。PCR條件是在94°C下變性45秒，在64°C下40 秒和在72°C下延伸1分鐘，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。對(duì)含有360bp L2序列的約380bp的PCR片段進(jìn)行凝膠純化，用BamHl消化，并連接 到經(jīng)BamHl消化的HbsAg基因，產(chǎn)生約1060bp的HbsAg-HPV嵌合體，指定為SEQ ID No. 5。 為了產(chǎn)生L2基因片段連接到HbsAg基因的N末端的HPV-HbsAg嵌合序列，用于L2的N末端 和C末端引物含有EcoRl和BamHl限制性位點(diǎn)。使經(jīng)BamHl消化的L2基因片段與經(jīng)BamHl 消化的HbsAg連接，產(chǎn)生1060bp的嵌合序列，指定為SEQ ID N0. 6。
具有HPV16的Ll區(qū)和HbsAg的嵌合序列的產(chǎn)牛產(chǎn)生的嵌合序列由來(lái)源于HPV16蛋白Ll區(qū)的33個(gè)氨基酸的序列(99bp) NTVIQD⑶ MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI與HbsAg基因組成。使用以下PCR引物，借助PCR擴(kuò)增HPV16L1 基因(在金斯瑞公司合成的基因)的指定區(qū)域，得到含有99bp上述序列的約120bp的PCR 片段6P1CF N 末端(6P1CFNTERM)5' ATCGGATCCAACACCGTTATCCAAGACGG 3'6P1CF C 末端(6P1CFCTERM)5' ACTGCGGCCGCTTATCAAATATCCAATGGAACTTC 3'PCR反應(yīng)在含有Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、20皮摩爾各引物和1. 5U Taq DNA聚合酶的50 μ L反應(yīng)體積中進(jìn)行(所有試劑都從班加羅爾_吉奈公司獲得)。PCR 循環(huán)由在94°C下變性45秒、在65°C下退火40秒和在72°C下延伸45秒持續(xù)30個(gè)循環(huán)組成。 對(duì)約120bp的PCR片段進(jìn)行凝膠純化，用BamHl消化，并利用T4DNA連接酶連接到經(jīng)BamHl 消化的HbsAg過(guò)夜，產(chǎn)生約SlObp的嵌合序列G^gSSEQ ID No. 7)，其中HPV16L1片段為 HbsAg基因的C末端。為了產(chǎn)生上述片段連接于HbsAg基因的N末端的HPV-HbsAg，利用具 有類(lèi)似序列的引物，借助PCR擴(kuò)增HPV16L1片段，其中N末端引物中含有EcoRl位點(diǎn)，且C 末端引物中含有BamHl序列而非Notl。用BamHl消化類(lèi)似尺寸的PCR片段，并如上文所述 連接到經(jīng)BamHl消化的HbsAg，產(chǎn)生指定為SEQ ID No. 8的序列。具有HPV18的Ll區(qū)和HbsAg的嵌合序列的產(chǎn)生借助PCR，將具有序列 PPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 的 HPV18L1 蛋 白(39個(gè)氨基酸；117bp)連接到HbsAg序列的C末端，產(chǎn)生嵌合序列。針對(duì)在畢赤酵母中表 達(dá)來(lái)對(duì)合成性HPV18L1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在金斯瑞公司進(jìn)行合成。利用以下PCR引 物，借助PCR擴(kuò)增上文指定的HPV18L1序列8PICF N 末端(SPICFNTERM)5' GATGGATCCCCTCCTTTGGAATTGAAG 3'8Picf c 末端(8Picfcterm)5' AGTGCGGCCGCTTATCAGTAATCTGGATATTTGC 3'PCR反應(yīng)以50 μ L體積進(jìn)行，并含有Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、20 皮摩爾各引物和1.5U Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)由在94°C下變性45秒、在65°C下退火30 秒和在72°C下延伸40秒持續(xù)30個(gè)循環(huán)組成。對(duì)約135bp的PCR片段進(jìn)行凝膠純化，用 BamHl消化，并連接到經(jīng)BamHl消化的HbsAg，得到HPV18L1序列連接到HbsAg的C末端的 HbsAg-HPV嵌合序列，得到SEQ ID No. 9。為了產(chǎn)生HPV-HbsAg嵌合序列，對(duì)于PCR引物，在 N末端引物中含有EcoRl位點(diǎn)，且在C末端引物中含有BamHl位點(diǎn)。在用BamHl消化后，將 片段連接到在N末端含有BamHl的HbsAg，產(chǎn)生SEQ ID No. 10。用EcoRl和Notl消化所述 兩個(gè)連接得到的PCR片段，以便克隆到酵母表達(dá)載體pPIC3. 5K中。較大HPV18L1片段與HbsAg的嵌合序列的產(chǎn)生借助PCR，將由以下序列組成的較大HPV18L1片段5 ‘ ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶ mvdtgygamdfstlqdtkcevpldicqsickypdylqmsadpygdsmffclrreqlfarhfwnragtmgdtvpqslyIKGTGMRASPGSCVYSPS 3'連接到HbsAg的C末端，得到嵌合序列。利用以下PCR引物，借助PCR擴(kuò)增Ll片 段8P1CFLF N 末端(SP1CFLFNTERM)5' TCTGGATCCGCTACATCTAATGTCTC 3'8P icFLF c 末端(8Picflfcterm)5' ATTGCGGCCGCTTATCAGGATGGACTGTAAACG 3'50 μ L的PCR反應(yīng)物由Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、N末端和C末端 引物各20皮摩爾和1.5U Taq DNA聚合酶組成。PCR反應(yīng)物由Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、 0. 25mM dNTP、20皮摩爾各引物和1. 5U Taq DNA聚合酶組成。PCR循環(huán)由在94°C下變性30 秒、在64°C下退火40秒和在72°C下延伸1分鐘持續(xù)30個(gè)循環(huán)組成。對(duì)PCR片段進(jìn)行凝膠 純化，用BamHl消化，并連接到經(jīng)BamHl消化的HbsAg的C末端，得到具有SEQ ID No. 11的 嵌合片段。為了將上述HPV18L1片段連接到HbsAg序列的N末端，對(duì)于引物來(lái)說(shuō)，N末端引 物帶有EcoRl位點(diǎn)，且C末端引物帶有BamHl位點(diǎn)。將經(jīng)BamHl消化的片段連接到經(jīng)BamHl 消化的HbsAg，得到HPV18L1片段處在HbsAg基因的N末端的嵌合序列，得到SEQ ID No. 12。 用EcoRl和Notl消化上述兩個(gè)嵌合序列，并連接到經(jīng)EcoRl和Notl消化的酵母表達(dá)載體 PPIC3. 5K，以便克隆到畢赤酵母中。HPV抗假與用于在畢,未酵母Φ^Η必+牛表達(dá)HPV抗JC的人血清白g白基因白射言號(hào)序 列的嵌合序列的產(chǎn)生利用以下引物，借助PCR擴(kuò)增人血清白蛋白基因的具有24個(gè)氨基酸的信號(hào)序列HASS N 末端(HASSNTERM)5' CCTGAATTCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC 3'HASS C 末端(HASSCTERM)5' ATTGGATCCTCGACGAAACACACCCCTG 3'由此得到72bp的片段，對(duì)其進(jìn)行凝膠純化，用BamHl消化并連接到在5'端帶有 BamHl位點(diǎn)的HPV16L1、HPV16L2和HPV18L1全長(zhǎng)基因的5'端，分別得到序列SEQID No. 13、 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID No. 15。實(shí)例3 在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)通過(guò)對(duì)所有嵌合序列的兩條DNA鏈進(jìn)行測(cè)序來(lái)驗(yàn)證嵌合序列和閱讀框的 正確性，隨后進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。用EcoRl和Notl消化前幾章節(jié)中提到的所有嵌合序 列，隨后進(jìn)行凝膠純化，并將其與經(jīng)EcoRl和Not 1消化的pPIC3. 5K載體(英杰公司 (InvitrogenCorporation)，美國(guó)卡爾斯巴德(Carlsbad，USA))連接，并用T4DNA連接酶連 接過(guò)夜。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并涂于含有100 μ g/mL氨必西林 (ampicillin)的LB瓊脂板中。從轉(zhuǎn)化的克隆中大規(guī)模分離出每一所述構(gòu)建體的質(zhì)粒DNA， 純化并用Bgl II消化，使質(zhì)粒線(xiàn)性化以用于酵母轉(zhuǎn)化。遵照制造商(英杰公司)的方案以及其手冊(cè)中略述的，將編碼嵌合序列SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 15的基本上線(xiàn)性化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中。將所有嵌 合序列都克隆到AOXl基因座中，并借助甲醇的誘導(dǎo)，在A(yíng)OXl啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá)。重組畢 赤酵母屬菌株的克隆、篩選、分離以及甲醇對(duì)克隆基因的誘導(dǎo)均遵照畢赤酵母屬表達(dá)試劑盒(Pichia Expression Kit，目錄號(hào)K1710-01 ；英杰公司，美國(guó)卡爾斯巴德)中的用戶(hù)手 冊(cè)“在畢赤酵母中表達(dá)重組蛋白的方法手冊(cè)(A Manual of Methods for Expressionof Recombinant Proteins in Pichia pastoris)，，(第]\1版，2002 年 1 月)進(jìn)行。實(shí)例4 嵌合HbsAg-HPV抗原的純化用甲醇誘導(dǎo)后，采集細(xì)胞，并借助超聲波和/或利用玻璃珠進(jìn)行溶解。用PEG6000 處理溶解產(chǎn)物，達(dá)到7. 5%的濃度，并用NaCl處理，使?jié)舛冗_(dá)到3%。以8000 χ g離心細(xì)胞 懸浮液10分鐘。借助鹽處理(專(zhuān)用混合物)來(lái)使上清液沉淀，并進(jìn)行沉淀。利用Tris-HCl 緩沖液(pH 8. 5)，從鹽沉淀中洗脫出蛋白質(zhì)。濃縮洗脫液，并用50mM Tris-HCl (pH 8. 5)透 濾(diafiltered)，并裝載到經(jīng)同一緩沖液平衡的陽(yáng)離子柱上。對(duì)于不同抗原蛋白，用不同 濃度的NaCl洗脫蛋白質(zhì)。在12% SDS-PAGE上借助銀染色檢查制劑的純度。隨后借助蛋白 質(zhì)免疫印跡(Western blot)確定各種嵌合蛋白的正確分子尺寸。實(shí)例5 =HPV-HbsAg 嵌合蛋白的 ELISA 借助ELISA法，利用M0N0LISA Anti_Hbs3. O試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)72400 ；伯樂(lè)公司 (Bio-Rad))，嚴(yán)格遵照試劑盒手冊(cè)中略述的方案，針對(duì)乙型肝炎小抗原的含量來(lái)檢測(cè)嵌合 蛋白的表達(dá)，并以ng/mL表示。使用誘導(dǎo)后的100 μ L細(xì)胞溶解產(chǎn)物來(lái)估算HbsAg的含量。 還借助ELISA法估計(jì)誘導(dǎo)后細(xì)胞溶解產(chǎn)物中嵌合蛋白中的HPV抗原。在涂布緩沖液(碳酸 鹽緩沖液，PH 9.6)存在下，將含Iyg純化蛋白質(zhì)的200yL涂布于96孔微量滴定板上，并 在4°C下培育過(guò)夜。在紙巾上輕敲所述板以去除孔中殘留的緩沖液，隨后排出孔中的內(nèi)含 物。用每孔225 μ L阻斷溶液(含有0. 5% BSA的Ix PBST)阻斷各孔，并在37°C下培育1 小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌各孔3次(每孔200 μ L，每次洗滌30秒)。在每次洗滌后，在紙 巾上輕敲所述板至干，以去除各孔中殘留的緩沖液。以Ix PBST (含有0. 5%吐溫20(tween 20)的磷酸鹽緩沖液)洗滌各孔5次，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。在兔中產(chǎn)生的針對(duì)全長(zhǎng) HPV6L1、HPV16L2和HPV18L1的抗體用作初級(jí)抗體。添加以1 1000稀釋的初級(jí)抗體后， 在室溫下，振蕩培育所述板1小時(shí)。排出孔中內(nèi)含物，并用含有Ix PBST的洗滌緩沖液洗滌 5次。添加在IOmM磷酸鹽緩沖生理鹽水中以1 2000稀釋的二級(jí)抗體抗兔IgG-HRP結(jié)合 物，并在室溫下振蕩培育1小時(shí)。排出孔中的內(nèi)含物，并在干紙巾上輕敲所述板，以去除孔 中殘留的緩沖液。每孔添加20 μ L新制的底物溶液OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)和過(guò)氧化氫， 并在室溫下培育30分鐘。通過(guò)添加75 μ L終止溶液(stopping solution)來(lái)終止反應(yīng)，并 在ELISA讀取器中讀取在490nm下的吸光度。實(shí)例6:蛋白質(zhì)免疫印跡在12 % SDS-PAGE凝膠上分離前幾章節(jié)所述的嵌合蛋白，在PVDF膜(Hybond-Ρ轉(zhuǎn) 印膜，GE醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare))上進(jìn)行電印跡，并在含有IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. 4， 含有3%脫脂奶粉)的溶液中阻斷。用阻斷溶液阻斷過(guò)夜后，排出阻斷溶液，并以PBST沖 洗3次，每次5分鐘。在37°C下，將印跡與利用市售四價(jià)疫苗而產(chǎn)生的初級(jí)兔抗血清的 1 500稀釋液一起培育。與初級(jí)抗體培育1小時(shí)后，洗滌印跡5次，并與二級(jí)抗體(即，抗 兔IgGHRPO結(jié)合物)的1 2000的PBST稀釋液一起培育，在室溫下振蕩培育1小時(shí)。添 加底物二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidene，DAB)和過(guò)氧化氫，并顯色，直到得到所需的顏色 強(qiáng)度。通過(guò)排出底物溶液并用WFI沖洗，來(lái)終止反應(yīng)。利用針對(duì)市售四價(jià)HPV疫苗而產(chǎn)生的抗血清，借助蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)嵌合序列中的HPV16L1和HPV18L1。實(shí)例7 :嵌合蛋白的免疫原性利用50 μ g吸收于氫氧化鋁凝膠中并經(jīng)肌肉內(nèi)投予的每一嵌合抗原的純化蛋白 質(zhì)使每一測(cè)試組中的10只BALB/C小鼠(15-20g)免疫。第1劑后21天，給予加強(qiáng)劑量， 并在第1劑后45天后投予第2劑。借助間接ELISA測(cè)量對(duì)于前一章節(jié)略述的含有SEQID No. 3-12的所有克隆的抗體滴度。估算經(jīng)嵌合抗原免疫的小鼠中針對(duì)HbsAg和HPV抗原的 抗體滴度。用于估算HPV16L1和HPV18L1的初級(jí)抗體為針對(duì)市售四價(jià)疫苗產(chǎn)生的兔抗血清， 但對(duì)于表達(dá)HPV16L2蛋白的克隆，利用針對(duì)純化的HPV16L2蛋白而產(chǎn)生的HPV16L2兔抗血 清來(lái)測(cè)量。借助間接ELISA，測(cè)量從每一組小鼠匯集的血清中針對(duì)HPV抗原的抗體滴度。二 級(jí)抗體為兔抗IgG HRPO結(jié)合物。重復(fù)本實(shí)驗(yàn)，其中將含等量抗原的氫氧化鋁凝膠(algel) 與每劑50 μ gCpG低聚核苷酸一起投予。在投予抗原的初始劑量后60到65天，估算所有小 鼠的抗體滴度。為了估算免疫小鼠中針對(duì)HbsAg的抗體滴度，利用來(lái)自伯樂(lè)公司實(shí)驗(yàn)室的 Monolisa Anti HBs 3. O試劑盒，嚴(yán)格遵照制造商的說(shuō)明進(jìn)行估算。在490nm下記錄值，并 作圖。參考文獻(xiàn)克雷斯特森N. (ChristensenN.)，瑞德 C. (Reed C.)，克拉德?tīng)?N. (CladelN.)， 韓R(Han R)和柯瑞德J. (Kreider J.) (1996)利用病毒樣顆粒免疫將誘導(dǎo)針對(duì)白尾棕 色兔乳頭瘤病毒激發(fā)的長(zhǎng)期兔防護(hù)(Immunization with viruslike particles induces long-termprotection of rabbits against challenge with cottontail rabbit papillomavirus).《病毒學(xué)雜志》(Journal of Virology) 70，960-965?？贫黪U爾R.(Kirnbauer R.)，查德庫(kù)德L. (Chandrachud L.)，奧尼爾B. (0' Neill B.)，瓦格納 E. (Wagner Ε.)，格林德萊 G. (Grindlay G.)，阿姆斯特朗 A. (Armstrong A.)，麥克格韋 G. (McGarvie G.)，斯奇爾 J. (Schiller J.)，羅瑞 D. (Lowry D.)和坎 普M. (Camp Μ.) (1996):牛乳頭瘤病毒4型的病毒樣顆粒用于預(yù)防性和治療性免疫 (Virus-like particles of bovine papillomavirus type-4 in prophylactic and therapeuticimmunization).《病毒學(xué)》(Virology) 219，37-44。露絲R. (Rose R.)，懷特 W. (White W.),馬琳 L. (MaoIin L.)，蘇黎世 J. (SuzichJ.)，萊恩 C. (Lane C.)和格瑞克 R. (Garcea R. ) (1998)人乳頭瘤病毒 11 型重 組Ll 殼粒誘導(dǎo)病毒中禾口抗體(Human papillomavirus type llrecombinant Llcapsomeres inducevirus neutralizing antibodies)，〈〈病毒學(xué)雜志〉〉(Journal of Virology) 72, 6151-6154。沃布梅斯JM (ffalboomers JM)，杰克布 MV (Jacobs MV)，曼諾斯 MM (ManosMM)，博斯 FX (Bosch FX)，庫(kù)默 JA(Kummer JA)，沙汗 KV (Shah KV)，斯尼杰德 PJ (Sni jders PJ)，佩托 J (Peto J)，梅杰爾C J (Meijer CJ)，姆諾N. (Munoz N.)人乳頭瘤病毒是全世界侵襲性子宮 ■I 白勺(Human papillomavirus is a necessarycause of invasive cervical cancer worldwide).《病理學(xué)雜志》(J Pathol) 1999 ； 189 :12_9。博斯FX(Bosch FX)，德圣荷西(de Smjose)第1章人乳頭瘤病毒與子宮 頸癌-負(fù)荷禾口因果關(guān)系評(píng)估(Human papillomavirus and cervical cancer-burden andassessment of causality).《國(guó)立癌癥石if 究所雜志》(J Natl Cancer InstMonogr)2003 ；31 :3-13。斯奇利特NF (Schlecht NF),派特RW(Piatt RW)，杜拉特-弗朗克 E(Duarte-FrancoE)等人，人乳頭瘤病毒感染與子宮頸上皮內(nèi)瘤形成的進(jìn)展和消退(Human papillomavirusinfection and time to progression and regression of cervical intraepithelial neoplasia).《國(guó)立癌癥研究所雜志》(J Natl Cancer Inst) 2003 ；95 1336-43。理查德森H(Richardson H)，凱爾索 G(Kelsall G)，泰利勒 P(Tellier P)等 人，在女大學(xué)生中類(lèi)型特異性人乳頭瘤病毒感染的自然史(The natural history of type-specifichuman papillomavirus infections in female university students). 《癌流行病學(xué)生物標(biāo)記與預(yù)防》(Cancer Epidemiol Biomarkers Prev) 2003，12 :485_90。朗德博夫P(Londesborough P)，胡 L(Ho L)，特瑞 G (Terry G)，庫(kù)茲克 J(CuzickJ)， 韋勒C(Wheeler C)，辛格A. (Singer Α.)，人乳頭瘤病毒基因型作為出現(xiàn)微小子宮頸異常 的女性中高級(jí)別病變的持續(xù)和發(fā)展的預(yù)測(cè)因子(Human papillomavirus genotypeas a predictor of persistence and development of high-grade lesions in women with minorcervical abnormalities). 〈〈IS際癌癥雜;ife〉〉(Int J Cancer) 1996，69 :364—8。卡利福德GM(Clifford GM)，史密斯 JS (Smith JS)，普拉姆 M(Plrnnmer Μ)，慕茲 N(Munoz N)和弗蘭齊斯S. (Francheschi S.)，全世界侵襲性子宮頸癌中人乳頭瘤病毒類(lèi) 型趨勢(shì)分析(Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide ameta-analysis).《英國(guó)癌癥雜志》(British J Cancer) 2003 ；88 :63_73。克利福德GM，史密斯JS，普拉姆M，慕茲N和弗蘭齊斯S.，全世界侵襲性子宮頸癌 中人乳頭瘤病毒類(lèi)型趨勢(shì)分析.英國(guó)癌癥雜志2003 ；88 :63-73。皮埃拉R(Pereira R)，海澤洛斯 II (Hitzeroth II)，瑞比克 EP. (Rybicki EP.)，乳頭瘤病毒次要衣殼蛋白L2的作用和功能的了解(Insights intothe role and function ofL2, the minor capsid protein ofpapillomaviruses)〈〈病毒學(xué)文獻(xiàn)〉〉(Arch Virol.) 2009 ；154 (2) 187-97)?？策_(dá)T(Kanda Τ)，肯度K. (Kondo K.)，針對(duì)廣范圍高風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型的HPV疫苗的開(kāi)發(fā) (Development of an HPV vaccine for a broad spectrum of high-risk types)〈〈人類(lèi) 疫苗》(Hum Vaccin. )2009 年 1 月 _2 月；5(1) :43_5。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，其包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原與賦予較強(qiáng)免疫原性的病毒或細(xì) 菌蛋白的嵌合融合物，所述疫苗組合物適用于乙型肝炎病毒以及HPV感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原選自包含但不限于 HPV16、HPV18、HPV6、HPVl 1、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59、HPV68 的群組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中包含所述HPV抗原的完整/部分序列 /突變體/變異體的所述抗原性組合物選自包含以下各項(xiàng)的清單L1、L2、E2、E5、E6和E7 抗原，或者所述抗原的特異性T細(xì)胞或B細(xì)胞表位，這些是單一序列，或者是與細(xì)菌/病毒 蛋白的在投予宿主時(shí)能夠誘導(dǎo)強(qiáng)抗體應(yīng)答的嵌合融合物中的串聯(lián)重復(fù)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述病毒和細(xì)菌蛋白選自包括但不限 于以下各項(xiàng)的清單中的一種或者組合或者來(lái)源于清單中蛋白質(zhì)的表位乙型肝炎抗原，例 如乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎小抗原；失活的破傷風(fēng)類(lèi)毒素；白喉類(lèi)毒素；大腸桿菌不耐 熱毒素；霍亂毒素；綠膿桿菌外毒素A ；志賀毒素；李斯特菌素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中所述抗原性組合物由HPV抗原與乙型 肝炎小抗原(HbsAg)的嵌合融合物組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原包含例如Ll和L2等衣 殼蛋白的完整或部分序列/表位，或者來(lái)源于其Ll和/或L2的多肽，且與所述HbsAg融合， 例如 SEQ ID NO. 3 到 SEQ ID NO. 13 中所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原包含單獨(dú)或組合形式的 例如E2、E5、E6和E7等HPV早期蛋白的完整/部分序列/突變體/變異體/表位，例如SEQ ID No. 1和2中所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原與所述乙型肝炎小抗原 的N末端或C末端或者開(kāi)放閱讀框內(nèi)的任何區(qū)域融合，其中在所述兩個(gè)序列之間添加有或 不添加連接子序列。
9.一種表達(dá)上述根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV和HPV-HBsAg嵌合抗原的方法，其包含培 養(yǎng)經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原/融合抗原轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從所述宿主細(xì)胞中分離出所 述重組蛋白并純化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中上述HPV抗原在所述宿主中重組表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)蛋 白或分泌蛋白，所述宿主是原核或真核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選酵母。
11.一種藥物組合物，其包含有效量的適用作疫苗的根據(jù)權(quán)利要求1至10所述的抗原 性組合物，以及藥學(xué)上可接受的載劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中所述抗原的用量在每劑IOyg到 1000 μ g所述蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)，優(yōu)選介于IOyg到200 μ g之間，最優(yōu)選介于IOyg到100 μ g 之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求11和12所述的藥物組合物，其另外包含適合的佐劑，所述佐劑選自 以下各項(xiàng)中的至少一種氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰脂A、其它有機(jī)親脂性化合物、含有CpG 和非CpG的低聚核苷酸、細(xì)胞因子。
14.一種引發(fā)對(duì)于根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗原性組合物的保護(hù)性抗 體應(yīng)答和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包含借助例如經(jīng)口、粘膜或腸胃外投藥途徑等途徑中的至少一種途徑，將所述組合物投予需要所述治療的個(gè)體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中上述抗原性組合物的遞送是以藥學(xué)上可接受的 生物可降解聚合物實(shí)現(xiàn)。
16.一種上述抗原制劑的用途，其是用于預(yù)防性或治療性治療哺乳動(dòng)物、尤其是人類(lèi)的 乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌癥風(fēng)險(xiǎn)。
全文摘要
本發(fā)明描述一種適用于乙型肝炎病毒以及人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染的疫苗組合物，其包含HPV抗原與賦予較強(qiáng)免疫原性的病毒或細(xì)菌蛋白的嵌合融合物。
文檔編號(hào)A61K39/285GK102112152SQ200980130450
公開(kāi)日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月9日
發(fā)明者克里希納·默斯·艾拉, 坎達(dá)斯瓦彌·蘇瑪斯 申請(qǐng)人:巴拉特生物技術(shù)國(guó)際有限公司