重組釀酒酵母表達HBsAg的制備工藝及其分離純化工藝、HBsAg和乙肝疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組基因的乙肝疫苗制備工藝技術，尤其涉及一種重組釀酒酵母表達 乙肝表面抗原（HBsAg)的制備工藝及其分離純化工藝、HBsAg和乙肝疫苗。
【背景技術】
[0002] 我國是乙型肝炎高流行區(qū)，每年平均報告發(fā)病人50多萬例，而接種乙肝疫苗是預 防乙型肝炎最有效、最經濟，也是最有保障的方法。我國于1992年將乙型肝炎疫苗納入計 劃免疫管理，2009年開始，國家又將乙型肝炎免費接種范圍擴大至對15歲以下青少年兒 童，以及醫(yī)務人員、大學生和現(xiàn)役軍人等，全國接種乙肝疫苗的需求愈來愈大，覆蓋范圍越 來越廣。2010版新版GMP的實施，對藥企的生產及藥品質量提出了更高的要求。如今全國 各乙肝疫苗廠家均在積極通過生產技術優(yōu)化、改進及革新等措施，力求進一步提高生產效 率和提升產品質量，以確保接種范圍擴大后的市場需求和質量保證。
[0003] 現(xiàn)有技術中，在表達HBsAg的重組釀酒酵母細胞破碎和純化的生產過程中，為防 止HBsAg被蛋白酶分解，主要采用在破碎前加入苯甲基磺酰氟溶液（苯甲基磺酰氟是一種 蛋白酶抑制劑，對眼睛、鼻子及喉嚨有刺激作用）的方法。
[0004] 然而，發(fā)明人在實施本發(fā)明的過程中發(fā)現(xiàn)，上述加入蛋白酶抑制劑的方案存在以 下缺陷：
[0005] 由于蛋白酶抑制劑半衰期短（約30分鐘），而在大規(guī)模生產中，細胞破碎所需要的 時間較長（60~80分鐘），往往導致破碎過程的后期，蛋白酶抑制劑的作用已經下降或者消 失，使破碎釋放出的目標物HBsAg被蛋白酶一定程度的分解，從而提高了后續(xù)純化難度，導 致純化得到的原液收率及質量均受到影響；另外，由于加入的蛋白酶抑制劑進入緩沖體系， 還帶來了二度污染問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術問題是，提供一種重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工 藝，該工藝可在無需在細胞破碎前加入蛋白酶抑制劑的情況下使蛋白酶失去活性，從而避 免蛋白酶抑制劑帶來的二度污染，且可明顯提高后續(xù)純化得到的原液收率，并大大改善原 液的"比活"、"Sub_p24"等質量指標，具有很高的經濟效益及社會效益。
[0007] 本發(fā)明進一步所解決的技術問題是，提供一種重組釀酒酵母表達HBsAg的制備工 藝，該工藝可在無需在細胞破碎前加入蛋白酶抑制劑的情況下使蛋白酶失去活性，從而避 免蛋白酶抑制劑帶來的二度污染，且可明顯提高后續(xù)純化得到的原液收率，并大大改善原 液的"比活"、"Sub_p24"等質量指標，具有很高的經濟效益及社會效益。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了以下方案：
[0009] -種重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝，包括有：
[0010] 細胞破碎步驟，將經過發(fā)酵后提取的酵母細胞供入高壓勻漿器內，在 15000±1500PSIG壓力下對其進行細胞破碎；
[0011] 純化步驟，對破碎后的料液進行純化，制備HBsAg原液；
[0012] 在所述細胞破碎步驟后、純化步驟之前還包括：
[0013] 料液加熱步驟，對破碎后的料液進行加熱操作，使其溫度上升到50-80°C后，再將 其降溫到2~8°C。
[0014] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到60-80°C。
[0015] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到60-70°C。
[0016] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到65±1°C。
[0017] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，通過在套設于所述勻漿器外部的夾套中傳遞傳 熱介質，對所述勻漿器內經細胞破碎后的料液進行加熱。
[0018] 優(yōu)選地，所述夾套中傳熱介質的傳遞方向與勻漿器內料液的流動方向相反。
[0019] 優(yōu)選地，在所述細胞破碎步驟之前包括：
[0020] 冷凍懸液融化步驟，將經過發(fā)酵后提取并冷凍保存的酵母細胞懸液從冷凍保存裝 置中轉移到溫度穩(wěn)定在26 ± 1 °C的水浴鍋內，至其融化完成；
[0021] 所述提純步驟包括：
[0022] 澄清抗原制備步驟，除去在所述勻漿器破碎并加熱后的料液中的酵母菌碎片后， 通過加入硅膠380吸附目標抗原，并通過引入硼酸，將抗原由硅膠上解吸附，收集合并洗脫 液，制備成澄清抗原；
[0023] 原液制備步驟，將所述澄清抗原進一步用疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處 理，用磷酸鹽緩沖液稀釋，除菌過濾后即為原液。
[0024] 相應地，本發(fā)明還公開了一種重組釀酒酵母表達HBsAg的制備工藝，包括發(fā)酵步 驟和分離純化步驟，所述分離純化步驟采用如上所述的分離純化工藝。
[0025] 相應地，本發(fā)明還公開了一種重組釀酒酵母表達的HBsAg，該乙肝表面抗原采用如 上所述的工藝生產制得。
[0026] 相應地，本發(fā)明還公開了一種乙肝疫苗，該乙肝疫苗的活性成分包括有如上所述 的重組釀酒酵母表達的HBsAg。
[0027] 本發(fā)明的有益效果是：
[0028]本發(fā)明的實施例通過在細胞破碎步驟后，將破碎后的料液進行加熱使其溫度快速 上升到50-80°C，使蛋白酶失去活性后，再對料液進行純化，從而不僅實現(xiàn)了無需在細胞破 碎前加入蛋白酶抑制劑，避免了其帶來的二度污染，并對目標物HBsAg的活性無任何不利 影響；還明顯提高了其后續(xù)純化得到的HBsAg原液收率，并大大改善了 HBsAg原液的"比 活"、"Sub-p24"等質量指標，具有很高的經濟效益及社會效益。
【附圖說明】
[0029] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030] 圖1是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝一個實施例中破碎后料 液加熱狀態(tài)示意圖。
[0031] 圖2是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝第四實施例與現(xiàn)有技術 的抗原收率對比示意圖。
[0032] 圖3是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝第四實施例與現(xiàn)有技術 的比活值對比示意圖。
[0033] 圖4是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝第四實施例與現(xiàn)有技術 的Sub-p24值對比示意圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面參考圖1詳細描述本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝的 第一實施例；本實施例實現(xiàn)一次重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化流程主要包括以下步 驟：
[0035] 在細胞破碎步驟中，將經過發(fā)酵后提取的酵母細胞供入高壓勻漿器內，在 15000±1500PSIG壓力下對其進行細胞破碎；
[0036] 在純化步驟中，對破碎后的料液進行純化，制備HBsAg原液。
[0037] 并且，關鍵地，在所述細胞破碎步驟后、純化步驟之前還包括：
[0038] 在料液加熱步驟中，對破碎后的料液進行加熱操作，使其溫度上升到50_80°C后， 再將其降溫到2~8°C。
[0039] 具體實現(xiàn)時，在所述料液加熱步驟中，可通過在套設于所述勻漿器外部的夾套中 傳遞傳熱介質，對所述勻漿器內經細胞破碎后的料液進行加熱。
[0040] 進一步地，所述夾套中傳熱介質的傳遞方向可設置為與勻漿器內料液的流動方向 相反，從而達到更充分地交換傳遞熱量、加快溫度升高所需時間的效果。
[0041] 更進一步地，可通過自控裝置PID控制加熱過程中的各項參數(shù)，如控制傳熱介質 流向、設定加熱溫度等。
[0042] 本實施例中，所述傳熱介質可采用乙二醇，具體實現(xiàn)時，可先通過工業(yè)蒸汽或電加 熱的方式將乙二醇加熱至所需的溫度后，沿與勻漿器內料液流向相反的方向從傳熱介質入 口進入所述夾套中對所述料液進行熱交換。
[0043] 另外，本實施例中，在所述細胞破碎步驟之前還可包括：
[0044] 在冷凍