通過表面活性劑介導的制備型hplc純化有機化合物的制作方法
【專利說明】通過表面活性劑介導的制備型HPLC純化有機化合物 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及有機化合物的純化。更具體地，本發(fā)明涉及一種使用制備型反相高效 液相色譜法(Prep-RP-HPLC)純化包含肽的有機化合物的新穎的方法，所述方法與用于使用 表面活性劑作為替代固定相(surrogate stationary phase)(SSP)/附加固定相(APS)純化 包含肽的有機化合物的傳統(tǒng)的Prep-RP-HPLC相比具有其樣品負載容量（loading capacity)和輸出的7倍至10倍。增大的樣品負載容量是由于在C-18/C8鏈上的用作添加的 固定相(ASP)的吸附的表面活性劑。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 反相高效液相色譜法(RP-HPLC)在學術機構(gòu)、法醫(yī)實驗室、精細化學、和制藥工業(yè) 等等中被廣泛地用于小的有機分子、天然產(chǎn)物和生物活性分子(例如多肽、蛋白質(zhì)和核苷 酸）的分析、表征、分離、純化和/或離析(i solation)。在制藥工業(yè)中，分析型RP-HPLC被用于 釋放和表征原材料、中間體、和活性藥物成分(API)。相比之下，制備型色譜法被用于純化用 于另外用途的充分量的物質(zhì)。同時分析型RP-HPLC的主要目標是分析物的鑒定和定量，而在 制藥工業(yè)和精細化學工業(yè)中，Prep-RP-HPLC的主要目的是包含肽API、和沒有義務結(jié)晶的大 部分其他復合API的API、以及精細化學品的商業(yè)生產(chǎn)。
[0004] 在洗脫模式中的Prep-RP-HPLC最廣泛地被實踐并且是用于純化粗制肽混合物以 及其他小的復合有機分子的優(yōu)選模式。在洗脫制備型色譜法中，將待純化的化合物的粗制 混合物溶解在合適的溶劑Η列如，在水中的〇. 1%三氟乙酸(TFA)，緩沖液A}中并且結(jié)合至C-18/C-8衍生化的二氧化娃固定相載體(support)。當運行流動相(在50%至100%乙腈中的 0.1 % TFA，緩沖液B)梯度(通常A至B的線性梯度)時，在流動相和固定相之間建立平衡。取決 于它們對于固定相的親合力，各種樣品物質(zhì)以反映它們對于固定相的相對親合力的速度沿 著柱穿過。弱結(jié)合物質(zhì)首先洗脫，隨后是較強的粘合劑。總之，有機緩沖液組分的濃度的逐 漸增大導致混合物的組分的解吸(desorption)和拆分(resolution)。
[0005] 洗脫Prep-RP-HPLC模式在可以在單次運行中被純化的樣品的量方面被若干因素 限制，包括期望產(chǎn)物及其最近的洗脫相關的物質(zhì)之間的拆分、容量因子、以及制備型柱的理 論塔板數(shù)（number of theoretical plate)等等。Donald A.Wellings在他的書"A Practical Handbook of Preparative HPLC,Elsevier(2006)" 中已經(jīng)完美地描述許多這 些方面。合成的肽的典型的負載容量在lmg每ml填充柱體積至2mg每ml填充柱體積的范圍內(nèi) (即，關于總的柱體積的0.1 %至0.2%)。
[0006] 較早的Prep-RP-HPLC固定載體是用C-18或C-8鏈衍生化的不規(guī)則的二氧化硅顆 粒，并且它們經(jīng)受高背壓。高背壓限制它們關于可以在單次運行中被純化的量以及關于相 對較小的直徑的柱的用途。Prep-RP-HPLC的最近的進步已經(jīng)集中于生產(chǎn)球形的二氧化硅以 及開發(fā)新的鍵合化學以提供具有改進的穩(wěn)定性和選擇性的固定載體。已經(jīng)被C-18、C-8和其 他的配體衍生化的球形的二氧化硅的商業(yè)制造已經(jīng)克服這些挑戰(zhàn)并且已經(jīng)極大地擴展制 備型HPLC的實用性。在工藝HPLC儀器和鍵合二氧化硅載體中的技術進步已經(jīng)使得以數(shù)百千 克的量的復合肽例如Fuzeo:n?:(36種氨基酸的肽）的商業(yè)生產(chǎn)成為可能。遺憾地，這些大規(guī) 模HPLC儀器和相關的柱硬件是非常昂貴的并且限制方法的可承受性。另外，這些改進中沒 有一個既處理了給定的柱的負載容量，也沒有使它們產(chǎn)生純化的產(chǎn)物的量的明顯提高(填 充柱的輸出/mL)。
[0007] 盡管這些上述提及的進步，但是當較早地被洗脫時，僅有兩種方式增大可以在單 次運行中被Prep-RP-HPLC純化的樣品的量：（1)傳統(tǒng)的方法是使用較大的柱(較大量的固定 相）；以及(2)使用置換色譜法，其(同時對于開發(fā)是費力的)更有效地使用固定相。
[0008] 置換色譜法利用具有比樣品組分更高的對于固定相材料的親合力的流動相置換 劑溶液。區(qū)分置換色譜法與洗脫色譜法的關鍵操作特征是置換劑分子的使用。在洗脫色譜 法中，洗脫劑通常具有比待分離的混合物中的組分的任何低的對于固定相的親合力，而在 置換色譜法中，作為置換劑的洗脫劑具有較高的親合力。置換最好地適合于離子交換模式， 并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量近期的應用。專利US6239262公開了用于在疏水性相互作用和反相色譜 模式中的蛋白質(zhì)純化的低分子量置換劑。
[0009] 本發(fā)明通過利用SSP實現(xiàn)較高的輸出。SSP和置換色譜法協(xié)同地起作用以增大制備 型色譜法的輸出。
[0010] 發(fā)明人的PCT申請W0 2014/118797 A1描述了獨特的Prep-RP-HPLC技術，其相比于 常規(guī)的Prep-RP-HPLC技術實現(xiàn)(包含合成的粗制肽的化合物的粗制有機混合物的）樣品負 載的7倍至10倍的增大。相比于常規(guī)的Prep-RP-HPLC技術的輸出的增大是由于C-18/C-8吸 附的(結(jié)合的)季銨鹽的附加的替代固定相特征。季銨鹽通過與固定相的殘余硅醇的范德華 力(疏水性相互作用)和離子相互作用結(jié)合至固定相的C-18/C-8鏈。
[0011]本發(fā)明描述了用中性表面活性劑例如曲通X-100作為ASP涂覆的C-18/C-8衍生化 的二氧化硅的用途(請參見圖3)。本發(fā)明描述了使用Prep-RP-HPLC和中性表面活性劑作為 SSP/ASP的用于肽的可擴展的（scalable)分離工藝。本發(fā)明是用于肽的簡單的、成本效益好 的且可擴展的分離工藝。
[0012]發(fā)明目的
[0013] 本發(fā)明的主要目的是提供一種使用制備型反相高效液相色譜(Prep-RP-HPLC)技 術純化包含肽的有機化合物的新穎的方法。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供純化包含肽的有機化合物的方法，所述方法與傳統(tǒng)的 Prep-RP-HPLC技術相比具有其樣品負載容量和輸出的7倍至10倍。
[0015] 本發(fā)明的另外的目的是提供使用表面活性劑作為替代固定相(SSP)/附加固定相 (ASP)的這樣的方法。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含肽的有機化合物的純化的方法， 所述方法使用替代固定相/附加固定相連同C-18/C-8衍生化的二氧化硅固定相在制備型反 相高效液相色譜法(Prep-RP-HPLC)中具有反相柱的增大的樣品負載容量。C-18/C-8反相柱 的制備負載容量通過用替代固定相/附加固定相涂覆/結(jié)合C-18/C-8反相柱來增大，其中替 代固定相/附加固定相是中性表面活性劑或聚乙二醇化的表面活性劑。
[0018] 替代固定相/附加固定相表面活性劑可以選自烷基糖苷、膽汁酸、葡萄糖酰胺以及 聚氧化乙稀，其中聚氧化乙稀選自曲通)(-100(1'1'；[1:011乂-100)、吐溫-80(1￥6611-80)以及布 里杰-35(Bri j-35)，優(yōu)選地曲通X-100。
[0019] 烷基糖苷選自具有下式的化合物
[0020] R-〇-(CH2)x-CH3，
[0021 ]其中，
[0022] 當R =葡萄糖時 當R =麥芽糖時
[0023] X = 8,正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷x = ll，十二烷基-β-D-麥芽糖苷
[0024] X = 7,正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷x = 9,十二烷基-β-D-麥芽糖苷
[0025] X = 6,正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷x = 9,癸基-β-D-麥芽糖苷
[0026] X = 5,正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷。
[0027] 膽汁酸選自具有下式的化合物：
[0028] 膽汁酸
[0029]
[0030] 其中，
[0031 ] X = H，R = 0Na，脫氧膽酸鈉
[0032] X = H，R = NHCH2CH2S03Na，牛磺脫氧膽酸鈉
[0033 ] X = Η，R = NHCH2CH2C02Na，甘氨脫氧膽酸鈉
[0034] x = 〇H，R = 〇Na，膽酸鈉
[0035] X = OH，R = NHCH2CH2S〇3Na，?；悄懰徕c
[0036 ] X = OH，R = NHCH2CH2C〇2Na，甘氨膽酸鈉。
[0037]葡萄糖酰胺選自具有下式的化合物：
[0038] 葡萄糖酰胺
[0039]
[0040] 其中，
[0041 ] X = 8，MEGA_10
[0042] X = 7，MEGA_9，
[0043] X = 6，MEGA_8
[0044] 或，下式的化合物：
[0045]
[0046] 其中，
[0047] X = H，脫氧Big CHAP
[0048] X = 〇H，Big CHAP。
[0049] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過制備型反相高效液相色譜法(Prep-RP-HPLC)純化包含肽的有機化合物的多組分樣品的方法，所述方法包括以下步驟：
[0050] (a)配置具有疏水性固定相的色譜系統(tǒng)；
[0051 ] (b)用選自烷基糖苷、膽汁酸、葡萄糖酰胺以及聚氧化乙烯的替代固定相/附加固 定相表面活性劑使色譜固定相飽和；
[0052] (c)采用有機溶劑和水的混合物洗滌柱以除去過量的未結(jié)合的表面活性劑；
[0053] (d)用起始流動相使柱平衡；
[0054] (e)將多組分樣品應用至包含涂覆有表面活性劑的固定相的色譜床的一個端部； 以及
[0055] (f)使用緩沖液A和緩沖液B的線性梯度洗脫多組分樣品，其中緩沖液A是在水中的 0.11^溴化十六烷基三甲銨和0.1禮碳酸氫鈉，并且緩沖液8是在50%含水乙腈中的0.11111溴 化十六烷基三甲銨和0.1 mM碳酸氫鈉；
[0056] (g)使用緩沖液A和緩沖液B的線性梯度洗脫多組分樣品，其中緩沖液A是0.1%的 在水中的磷酸，并且緩沖液B是0.1 %的在50 %含水乙腈中的磷酸;或
[0057] (h)使用緩沖液A和緩沖液B的線性梯度洗脫多組分樣品，其中緩沖液A是1%的在 水中的磷酸，并且緩沖液B是1 %的在50 %含水乙腈中的磷酸;或
[0058] (i)使用