乙型肝炎疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含：i)HBsAg、該抗原的片段、該抗原的變體，或者其至少兩種的混合物，ii)HBcAg1-X、該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體，或者其至少兩種的混合物，其中X是149-183的整數(shù)，iii)CpG-ODN，該寡聚核苷酸為全硫代修飾，其序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’-NTCGTT-3’基序，其長度為21個堿基。本發(fā)明還涉及該組合物用于治療HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病中的用途，以及治療HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的方法。
【專利說明】乙型肝炎疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗。特別地，本發(fā)明涉及一種乙型肝炎疫苗，其包含乙肝表面抗原、乙肝核心抗原和具有免疫刺激活性的硫代寡聚脫氧核苷酸。

【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范圍的嚴重公共衛(wèi)生問題之一。HBV感染是導(dǎo)致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝細胞癌的重要原因(Fattovich G.J Hepatol 2008 ；48:335-352)。臨床治療慢性HBV感染的常用藥物主要有核苷類似物和干擾素。核苷類似物無法完全清除肝細胞內(nèi)的cccDNA，且長期使用易導(dǎo)致耐藥突變株的出現(xiàn)以及停藥后反彈(Kwon H, Lok AS.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2011 ；8:275-284.)。干擾素不適合用于無癥狀的HBV攜帶者，在慢性HBV患者中，使用半年后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換發(fā)生率僅33%，而且干擾素副作用較大也限制其應(yīng)用(Tang SX,Yu GL.Lancet 1990 ;335 (8684):302)。
[0003]目前廣泛應(yīng)用的乙肝蛋白疫苗通過誘導(dǎo)體液免疫，產(chǎn)生保護性抗體，達到預(yù)防的目的。大量的研究發(fā)現(xiàn)保護性抗體僅能夠消除胞外病毒顆粒，而清除胞內(nèi)感染的病毒則主要依賴特異性的細胞免疫反應(yīng)，輔助性T細胞、CD4+T細胞產(chǎn)生的IFN- Y等Thl型細胞因子，尤其是病毒特異性的殺傷性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)來清除(ChinR7Lacamini S.Rev Med V1rl.2003:13(4):255-72)。細胞免疫反應(yīng)的強弱直接決定著乙肝的預(yù)后。因此，理想的治療性乙肝疫苗需要同時誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細胞免疫，突破乙肝的免疫耐受。
[0004]目前國內(nèi)大多數(shù)乙肝治療性疫苗的研發(fā)思路圍繞著HBsAg，通過克服免疫耐受，產(chǎn)生抗HBsAg的抗體達到免疫清除的效果，如聞玉梅的HBsAg-免疫球蛋白復(fù)合物(Xu D Z，Zhao K，et al.PLoS0NE，2008，3:e2565)，張宜俊的高劑量乙肝表面抗原疫苗(曾瀅，張宜俊等，廣東醫(yī)學(xué)，2003年24卷07期，740-706頁)等均采用此思路，從其最新的臨床數(shù)據(jù)來看，這兩個疫苗的治療效果還不明朗。
[0005]研究表明，慢性乙肝感染患者的抗HBsAg的抗體亞型以IgG4為主，而乙肝感染治愈的患者的抗HBsAg的抗體亞型為IgGl≥IgG4，說明在乙肝感染的清除過程中Thl型抗體亞型IgGl發(fā)揮著重要的作用，評價Thl型抗體亞型是否高于或者等于Th2型抗體亞型可能提不乙肝治療的效果(S.Rath, et al.Clin.exp.Tmmunol.(1988)72,164-167)。同時，乙肝感染患者的抗HBcAg抗體亞型為IgGl > IgG3 > IgG4，而乙肝感染治愈的患者的抗HBcAg亞型發(fā)生轉(zhuǎn)變，為IgG3 > IgGl > IgG4，說明抗HBcAg特別是抗HBcAg的抗體亞型的轉(zhuǎn)變可能與乙肝的治療息息相關(guān)(Chien-Fu Huang, et al.Cellular & MolecularImmunology.2006 ；3(2):97-106.)。
[0006]此外，還有研究表明，慢性乙肝病毒攜帶者和慢性乙肝患者的樹突狀細胞(pDC)表面受體TLR9表達下調(diào)，從而導(dǎo)致機體對乙肝表面抗原的免疫耐受，不能產(chǎn)生乙肝表面抗體或?qū)σ腋伪砻婵乖募毎庖?Q.Xie et al.Microbes and Infect1n
11(2009)515-523)。
[0007]專利US4547367利用HBcAg顆粒治療/預(yù)防HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病，HBcAg顆粒免疫黑猩猩可保護黑猩猩免于感染HBV。而且HBcAg顆粒聯(lián)合HBsAg顆粒免疫乙肝攜帶者母親生產(chǎn)的新生兒，產(chǎn)生高滴度的抗HBsAg和抗HBcAg抗體，且在18個月的監(jiān)測中均未見HBV感染。但是該專利并無明確提出抗HBcAg抗體亞型轉(zhuǎn)變的證據(jù)，且無治療HBV感染和HBV介導(dǎo)的疾病的直接證據(jù)。
[0008]專利W02007/031334，保護了乙肝治療性疫苗組分，其包含HBsAg、HBcAg和一種皂苷佐劑，而CpG-ODN可作為共用佐劑使用，但是，該乙肝治療性疫苗在臨床中需要聯(lián)合核苷類似物進行聯(lián)合治療才能突破乙肝的免疫耐受，且e抗原轉(zhuǎn)陰僅25%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含:i)乙肝表面抗原(HBsAg)，ii)乙肝核心抗原(HBcAg)，iii)CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)和iv)可藥用載體。特別地，本發(fā)明的藥物組合物用作預(yù)防性或治療性疫苗。在某些實施方案中，所述藥物組合物由上述組分i)-1v)組成。
[0010]在本發(fā)明的一些實施方案中，所述HBsAg具有SEQ ID NO:1所示序列。
[0011]在本發(fā)明的另一些實施方案中，所述HBcAg具有SEQ ID NO:2所示序列。
[0012]在本發(fā)明的又一些實施方案中，所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯連接。特別地，所述CpG-ODN為硫代寡聚脫氧核苷酸，優(yōu)選地為全硫代寡聚脫氧核苷酸。
[0013]在本發(fā)明的又一些實施方案中，所述CpG-ODN包含兩個或更多的5’-NTCGTT-3’基序。
[0014]在本發(fā)明的又一些實施方案中，所述CpG-ODN長度為15~35個核苷酸,優(yōu)選20~25個核苷酸。
[0015]在本發(fā)明的又一些實施方案中，所述CpG-ODN具有選自下列的序列:5’ -TCG TTCGTT CGT TCG TTC GTT-3’(SEQ ID NO:3)、5’_TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T_3’ (SEQID NO:4)、5，-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3’ (SEQ ID NO:5)和 5，-TCC ATG ACG TTCCTG ACG TT-3，(SEQ ID NO:6)，優(yōu)選地所述 CpG-ODN 具有序列:5，-TCG TTC GTT CGT TCGTTC GTT-3’。
[0016]在本發(fā)明的又一些實施方案中，所述藥物組合物中的組分i)，ii)以及iii)之間的相對重量比范圍是1: 0.2~5: I~50，優(yōu)選為1:1~5: 2~15。
[0017]本發(fā)明還涉及一種乙型肝炎疫苗，其包含:i)乙肝表面抗原(HBsAg)，ii)乙肝核心抗原(HBcAg), iii) CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)以及iv)可藥用載體。
[0018]本發(fā)明還涉及一種藥盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物或乙型肝炎疫苗以及其使用說明。
[0019]在一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備用于在對象中治療HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病之藥物中的用途，優(yōu)選地所述HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病選自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
[0020]在又一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備用于在對象中產(chǎn)生針對HBV的免疫應(yīng)答(優(yōu)選地，誘導(dǎo)Thl和Th2型免疫應(yīng)答)之藥物中的用途。
[0021]在另一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備用于在對象中使抗HBcAg抗體發(fā)生亞型轉(zhuǎn)變之藥物中的用途。
[0022]在又一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備用于在對象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之藥物中的用途。
[0023]在又一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物在制備用于在對象中實現(xiàn)乙肝表面抗原Thl/Th2免疫應(yīng)答平衡(例如，大致相當?shù)卣T導(dǎo)Thl和Th2型免疫應(yīng)答)之藥物中的用途。
[0024]在又一個方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含:i)乙肝表面抗原(HBsAg)，ii)乙肝核心抗原(HBcAg)，和iii) CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)，其用于在對象中治療HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病、用于在對象中產(chǎn)生針對HBV的免疫應(yīng)答(優(yōu)選地，誘導(dǎo)Thl和Th2型免疫應(yīng)答)、用于在對象中使抗HBcAg抗體發(fā)生亞型轉(zhuǎn)變和/或用于在對象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受。
[0025]在又一個方面，本發(fā)明涉及一種在對象中治療HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康母鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0026]在又一個方面，本發(fā)明涉及一種在對象中產(chǎn)生針對HBV的免疫應(yīng)答(優(yōu)選地，誘導(dǎo)Thl和Th2型免疫應(yīng)答)的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康母鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0027]在又一個方面，本發(fā)明涉及一種在對象中使抗HBcAg抗體發(fā)生亞型轉(zhuǎn)變的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康母鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0028]在又一個方面，本發(fā)明涉及在對象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康母鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0029]在又一個方面，本發(fā)明涉及在對象中實現(xiàn)乙肝表面抗原Thl/Th2免疫應(yīng)答平衡(例如，大致相當?shù)卣T導(dǎo)Thl和Th2型免疫應(yīng)答)的方法，其包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康母鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物。
[0030]在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物不包含皂苷佐劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比在增強小鼠對乙肝表面抗原特異性總IgG免疫應(yīng)答的圖。
[0032]圖2顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比在增強小鼠產(chǎn)生保護性抗體免疫應(yīng)答的圖。
[0033]圖3顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比在體液免疫水平增強乙肝表面抗原Th2免疫應(yīng)答的圖。
[0034]圖4顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比在體液免疫水平增強乙肝表面抗原Thl免疫應(yīng)答的圖。
[0035]圖5顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比在體液免疫水平促進乙肝表面抗原Thl/Th2免疫應(yīng)答平衡的圖。
[0036]圖6顯示本發(fā)明組合物產(chǎn)生的抗HBcAg抗體亞型為IgG2a > IgGl的圖。
[0037]圖7顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比在細胞免疫方面促進HBsAg CTL表位特異性Thl細胞分化抑制Th2細胞增殖的圖。
[0038]圖8顯示本發(fā)明組合物中HBcAg與HBsAg+CpG聯(lián)用在產(chǎn)生抗原特異性IgG抗體水平上具有協(xié)同作用的圖。
[0039]圖9顯示本發(fā)明組合物中HBcAg與HBsAg+CpG聯(lián)用相比HBsAg+CpG在細胞免疫水平具有促進HBsAg特異性的Thl細胞分化的能力。
[0040]圖10顯示本發(fā)明組合物在產(chǎn)生抗原特異性IgG免疫應(yīng)答上突破HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受的圖。
[0041]圖11顯示本發(fā)明組合物在產(chǎn)生中和抗體免疫應(yīng)答上突破HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受的圖。
[0042]圖12顯示本發(fā)明組合物突破HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和免疫耐受小鼠的免疫耐受，產(chǎn)生高滴度抗HBcAg的特異性IgG抗體的圖。
[0043]圖13顯示本發(fā)明組合物在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和免疫耐受小鼠中產(chǎn)生的抗HBcAg抗體亞型為IgG2a > IgGl的圖。
[0044]圖14顯示本發(fā)明組合物與傳統(tǒng)疫苗組分相比更具有清除HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中HBsAg抗原的能力。

【具體實施方式】
[0045]以下結(jié)合附圖通過【具體實施方式】的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0046]本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于治療乙型肝炎感染的藥物的缺陷。
[0047]特別地，本發(fā)明的一個目的是提供一種藥物組合物，該組合物可以在慢性HBV感染患者中產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答，促進抗HBsAg-1gG2a抗體亞型的分化，使IgG2a和IgGl趨近平衡；誘導(dǎo)抗HBcAg抗體亞型發(fā)生轉(zhuǎn)變和/或突破HBV感染患者的免疫耐受。
[0048]本發(fā)明的另一目的是提供了該組合物用于治療HBV感染和/或HBV介導(dǎo)疾病的用途，以及治療HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病的方法。
[0049]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含:
[0050]i)HBsAg、該抗原的片段、該抗原的變體，或者其至少兩種的混合物，
[0051]ii)HBcAg、該抗原的片段、該抗原或者該抗原的片段的變體，或者其至少兩種的混合物，
[0052]iii) CpG-ODN,該寡聚核苷酸為全硫代修飾,其序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’ -NTCGTT-3’基序，長度為20~25個堿基。該寡聚核苷酸優(yōu)選自以下堿基序列:5’ -TCGTTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’、5’-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T_3’、5’_TCG TCGTCG TCG TCG TCG TCG-3，或 5，-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3，。更優(yōu)選為 5，-TCG TTCGTT CGT TCG TTC GTT-3’。
[0053]本發(fā)明的組合物實現(xiàn)了出乎意料的技術(shù)效果。與現(xiàn)有的市售乙肝預(yù)防疫苗相比，在小鼠體內(nèi)試驗中可以介導(dǎo)更強的免疫應(yīng)答，包括抗HBsAg抗體、抗HBcAg抗體，抗adr血清型的中和抗體，特別是介導(dǎo)Thl細胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生與病毒清除相關(guān)的細胞因子IFN-Y，促進抗HBs-1gG2a抗體亞型的分化和成熟，抗HBcAg抗體亞型轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)體液免疫和細胞免疫的平衡。
[0054]現(xiàn)有技術(shù)中(參見專利CN101492672)已公開了組合物HBsAg+CpG，而本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物(HBcAg、HBsAg和CpG ODN的組合)可產(chǎn)生顯著優(yōu)于HBsAg+CpG組合物的抗HBsAg特異性抗體,表現(xiàn)出出人意料的協(xié)同作用。
[0055]更加出人意料地，在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實驗表明，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以突破轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫耐受，產(chǎn)生高滴度的抗HBsAg抗體、抗HBcAg抗體、中和抗體，介導(dǎo)Thl細胞免疫應(yīng)答,促進IgG2a抗體亞型的分化和成熟。同時通過對其血清中乙肝表面抗原表達水平的檢測顯示，根據(jù)本發(fā)明的組合物多次免疫可以顯著清除轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的乙肝病毒，使其乙肝病毒表達水平下降。
[0056]另外，在BALB/c小鼠和模型小鼠上均能介導(dǎo)強抗HBcAg的免疫應(yīng)答，并且實現(xiàn)了抗HBcAg抗體亞型轉(zhuǎn)變，即表現(xiàn)出的抗HBcAg抗體亞型關(guān)系為IgG2a抗體水平高于IgGl，與乙肝感染患者痊愈的抗體亞型關(guān)系一致。這一鼓舞人心的結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明的組合物可用作乙肝治療性疫苗，從而解決長期以來困擾人們的這一難題。
[0057]定義
[0058]除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員具體可參考Current Protocols in MolecularB1logy (Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或I字母代碼。
[0059]盡管本發(fā)明的廣義范圍所示的數(shù)字范圍和參數(shù)近似值，但是具體實施例中所示的數(shù)值盡可能準確的進行記載。然而，任何數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何和所有子范圍。例如記載的“I至10”的范圍應(yīng)認為包含最小值I和最大值10之間(包含端點)的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值I或更大起始的子范圍，例如I至
6.1，以及以最大值10或更小終止的子范圍，例如5.5至10。另外，任何稱為“并入本文”的參考文獻應(yīng)理解為以其整體并入。
[0060]另外應(yīng)注意，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對象的復(fù)數(shù)形式，除非清楚且明確的限于一個所指對象。術(shù)語“或”可與術(shù)語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。
[0061]本文中使用的術(shù)語“多肽”是指氨基酸聚合物，并且無具體的最少氨基酸數(shù)目限制。因此其同樣包括肽、寡肽、二聚體、三聚體、低聚體、顆粒等。再者，術(shù)語“多肽”不僅包括在核糖體中翻譯后得到的純氨基酸聚合物，還包括經(jīng)過翻譯后修飾(例如糖基化、乙?；⒘姿峄?、硫代等)獲得的多肽。
[0062]本文使用的術(shù)語“抗原性片段”是指天然或合成多肽的片段，其保留了所述天然或合成多肽的抗原特性，即能夠引發(fā)針對所述天然或合成多肽的免疫應(yīng)答。
[0063] 本文中使用的術(shù)語“乙肝表面抗原(HBsAg、HBs) ”旨在涵蓋天然HBsAg、HBsAg抗原性片段、HBsAg功能性變體及其任意組合。特別地，所述天然HBsAg為含有226個氨基酸的天然HBsAg多肽。更特別地，所述HBsAg為來源于現(xiàn)今已知HBV標準基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H的天然HBsAg多肽。在某些實施方案中，所述HBsAg具有SEQ ID N0:1所示的序列。
[0064]本文中使用的術(shù)語“HBsAg抗原性片段”旨在表示下述多肽，即該多肽具有天然HBsAg中少于226個氨基酸的連續(xù)或不連續(xù)的片段，并且所述多肽保留天然HBsAg的抗原性。
[0065]本文中使用的術(shù)語“HBsAg功能性變體”旨在表示下述多肽，即該多肽相對于天然HBsAg或HBsAg片段有至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個、至多I個氨基酸缺失、插入、添加或替換，并且所述多肽保留天然HBsAg的功能(例如抗原性)。
[0066]本文中使用的術(shù)語“乙肝核心抗原(HBcAg、HBc) ”旨在涵蓋天然HBcAg、HBcAg抗原性片段、HBcAg功能性變體及其任意組合。特別地，所述天然HBcAg為含有183個氨基酸的天然HBcAg多肽。更特別地，所述天然HBcAg為來源于現(xiàn)今已知HBV標準基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H的天然HBcAg。在一些實施方案中，所述HBcAg選自HBcAgl-x多肽，其表示天然HBcAg的1-X位氨基酸的片段，特別地，X為149至183。在另一些實施方案中，所述HBcAg選自具有下述序列的多肽:SEQ ID NO:2的1-149位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-150位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-151位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-152位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-153位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-154位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-155位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-156 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-157 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-158位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-159位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-160位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-161位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-162位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-163位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-164 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-165 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-166位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-167位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-168位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-169位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-170位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-171位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-172 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-173 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-174位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-175位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-176位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-177位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-178位氨基酸、SEQ ID NO:2的1-179位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-180 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-181 位氨基酸、SEQ ID NO:2 的 1-182位氨基酸和SEQ ID NO:2的1-183位氨基酸。在某些實施方案中，所述HBcAg具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0067]本文中使用的術(shù)語“HBcAg抗原性片段”旨在表示下述多肽，即該多肽具有天然HBcAg中少于183個氨基酸的連續(xù)或不連續(xù)的片段，并且所述多肽保留天然HBcAg的抗原性。
[0068]本文中使用的術(shù)語“HBcAg功能性變體”旨在表示下述多肽，即該多肽相對于天然HBcAg或HBcAg片段有至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個、至多I個氨基酸缺失、插入、添加或替換，并且所述多肽保留天然HBcAg的功能(例如抗原性)。
[0069]優(yōu)選地，在本發(fā)明中，HBcAg以及HBsAg在根據(jù)本發(fā)明的組合物中都以顆粒形式存在。
[0070]本文使用的術(shù)語“藥物組合物”、“組合藥物”和“藥物組合”可互換地使用，其表示組合在一起以實現(xiàn)某種特定目的的至少一種藥物以及任選地可藥用賦形劑或輔料的組合。在某些實施方案中，所述藥物組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。例如，所述藥物組合物中所含的成分(例如HBsAg、HBcAg和CpG-ODN)可以以整體施用于對象，或者分開施用于對象。當所述藥物組合物中所含的成分分開地施用于對象時，所述成分可以同時或依次施用于對象。
[0071]本文使用的術(shù)語“CpG寡聚脫氧核苷酸”或“CpG-ODN”是指短的單鏈合成DNA分子，其含有一個或更多個“CpG”單元，其中C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤，P表示磷酸二酯鍵。特別地，所述CpG寡聚脫氧核苷酸是非甲基化的。在一些實施方案中，所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯連接或硫代磷酸酯骨架。也就是說，在一些實施方案中，所述CpG-ODN為硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸(即硫代寡聚脫氧核苷酸)。優(yōu)選地，所述CpG-ODN中所有核苷酸間連接均為硫代磷酸酯連接，即所述CpG-ODN為全硫代寡聚脫氧核苷酸。在另一些實施方案中，所述CpG-ODN包含兩個或更多的5’-NTCGTT-3’基序。在又一些實施方案中，所述CpG-ODN長度為15~35個核苷酸，優(yōu)選20~25個核苷酸。特別地，所述CpG-ODN具有選自下列的序列:5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3，(SEQ ID NO:3)、5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTCGTT CGT T-3，(SEQ ID NO:4)、5，-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3’ (SEQ ID NO:5)和5，-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3，(SEQ ID NO:6)，更特別地所述 CpG-ODN 具有序列:5’ -TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’。
[0072]本文使用的“治療有效量”或“有效量”是指足以顯示其對于所施用對象益處的劑量。施用的實際量，以及施用的速率和時間過程會取決于所治療者的自身情況和嚴重程度。治療的處方(例如對劑量的決定等)最終是全科醫(yī)生及其它醫(yī)生的責任并依賴其做決定，通?？紤]所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對于醫(yī)生來說已知的其它因素。
[0073]本文使用的術(shù)語“HBV介導(dǎo)的疾病”旨在表示乙肝病毒(HBV)所導(dǎo)致、誘發(fā)、加重、提高其發(fā)生風(fēng)險和/或與其有關(guān)的疾病，例如乙型肝炎病毒攜帶者、乙型肝炎、肝硬化、肝腹水、肝癌等。
[0074]本文使用的術(shù)語“抗HBcAg抗體亞型轉(zhuǎn)變”旨在表示施用本發(fā)明的藥物組合物后，對象中抗HBcAg抗體亞型關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)榕c乙肝治愈患者中的抗體亞型關(guān)系一致，即與乙肝感染患者痊愈的抗體亞型關(guān)系一致。特別地，在小鼠中，抗HBcAg抗體亞型由IgGl > IgG2a轉(zhuǎn)變?yōu)?IgG2a > IgG2b > IgGl 或者 IgG2b > IgG2a > IgGl，例如 IgG2a > IgGl，在人中，抗 HBc 抗體亞型由 IgGl > IgG3 > IgG4 轉(zhuǎn)變?yōu)?IgG3 > IgGl > IgG4。
[0075]本文所使用的術(shù)語“對象”是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如野生動物(如蒼鷺、鸛、鶴等)，家畜(如鴨、鵝等)或?qū)嶒瀯游?如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土撥鼠、地松鼠等)。
[0076]本發(fā)明組合物的另一個實施方案，其包含i)HBsAg或該抗原的變體，ii)HBcAgl-183，和iii)含有21個堿基的硫代寡聚核苷酸CpG-ODN，其序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’ -NTCGTT-3’基序。
[0077]在一些實施方案中，本發(fā)明藥物組合物中組分i)，ii)以及iii)之間的相對重量比范圍是1: 0.2~5: I~50，優(yōu)選為1:1~5: 2~15，更優(yōu)選1:1: 2。
[0078]在另一些實施方案中，本發(fā)明組合物還可包含另外的添加劑，如藥物載體或添加劑，尤其是當它以藥物制劑形式存在時。
[0079]在某些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物不包含皂苷佐劑。
[0080]優(yōu)選的藥物載體尤其是水，緩沖水溶液，優(yōu)選等滲鹽溶液如PBS (磷酸鹽緩沖液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、0.3%甘油、透明質(zhì)酸、乙醇或聚亞烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用藥物載體的類型尤其依賴于根據(jù)本發(fā)明的組合物是否配制為用于口服、鼻、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈施用。根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含潤濕劑、乳化劑或緩沖液物質(zhì)作為添加劑。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物、疫苗或者藥物制劑可通過任何適宜的途徑施用，例如可口服、鼻、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。
[0082]實施例
[0083]實施例1.乙肝表面抗原(HBsAg)與乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN聯(lián)用增強乙肝表面抗原特異性總IgG的免疫應(yīng)答。
[0084]為了檢測HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物的乙肝表面抗原特異性總IgG免疫應(yīng)答，本發(fā)明人分別將HBsAg、HBcAg與CpG-ODN，HBsAg與Al (OH)3佐劑混勻，用其免疫小鼠，通過測定血清中HBsAg特異性IgG水平，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，來評價相對于HBsAg與Al (OH) 3聯(lián)用，HBsAg、HBcAg與CpG-ODN聯(lián)用對HBsAg特異性總IgG免疫應(yīng)答的作用。
[0085]本實施例中使用BALB/c小鼠，雌性，6_8周，購自上海斯萊克公司。本實施例所使用的HBsAg抗原購買自Prospec公司(批號:1111PHADW22，序列如SEQ ID勵:1所示)，為畢赤酵母表達的adw2亞型，純度95 %以上，4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。本實施例使用的HBcAg (序列如SEQ ID N0:2所示)抗原為發(fā)明人制備，為大腸桿菌表達的天然乙肝核心蛋白，純化制備工藝參見李計來，徐靜等在《中國生物制品學(xué)雜志》2011，第24卷第1121-1125頁中的報道，具體步驟如下:收集菌體后用1mM磷酸鈉緩沖液重懸，超聲破碎，離心收集上清，加入飽和硫酸銨，使其終濃度為33%，充分混勻后4°C過夜；次日，離心，沉淀用1mM磷酸鈉緩沖液重懸，放入透析袋，在1mM磷酸鈉緩沖液中4°C透析24h ;透析后的溶液經(jīng)羥基磷灰石柱層析，收集蛋白峰，濃縮，經(jīng)Sephacryl S-400 HR凝膠過濾層析,收集目的蛋白峰；4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。本實施例所用的CpG-ODN序列為5’ -TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’，參照CN200810004736.0專利所述的固相亞磷酰胺三酯法化學(xué)合成方法制備，由3’端開始，
I)脫保護基:先用三氯乙酸脫去連接在CpG上的核苷酸的保護基團DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’羥基，以供下一步縮合反應(yīng)使用；2)活化:將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體，此中間體與CpG上已脫保護基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)；3)連接:亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CpG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’羥基發(fā)生親和反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時寡核苷酸鏈向前延長一個堿基；4)氧化:縮合反應(yīng)時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CpG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸或堿水解，此時使用硫代試劑將亞磷酰胺氧化為硫磷雙鍵的磷酸三酯，從而得到穩(wěn)定的寡核苷酸；5)封閉:縮合反應(yīng)后為了防止連在CpG上的未參與反應(yīng)的5’羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙?；瘉矸忾]此端羥基；經(jīng)過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就連到CpG的核苷酸上；重復(fù)以上的脫保護基、活化、連接、氧化、封閉過程即可得到一個DNA片段粗品；最后對其進行切割、脫保護基、純化、定量等合成后處理即可得到符合的CpG-ODN ;-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0086] HBsAg 和 HBcAg 用 PBS (Invitrogen 公司)稀釋至 10 μ g/ml ；CpG-ODN 用 PBS 稀釋至20μg/ml。Al (OH) 3佐劑購自天壇生物。對BALB/c小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100μ I,每組10只小鼠。HBsAg+Al (OH) 3組每只小鼠注射I μ g經(jīng)Al (OH) 3吸附的HBsAg0 HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 組每只小鼠注射 I μ g HBsAg、l μ g HBcAg 和 2 μ g CpG-ODN0每三周免疫一次，在二免后十天采血并分離出血清，按照常規(guī)方法用2%脫脂奶對該血清以I: 30稀釋倍數(shù)起始，再進行3倍系列稀釋，用于檢測抗原特異性IgG總抗體。
[0087]具體抗原特異性IgG總抗體的檢測步驟如下:用HBsAg包被96孔酶標板(購自Nunc公司)，每孔25ng，4°C過夜；洗板2次后用5%脫脂奶37°C封閉I小時；洗板2次后加入上述3倍系列稀釋的待檢血清，37°C作用I小時；洗板3次后加入1: 30000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(購自美國SIGMA公司)，每孔50 μ 1，37°C作用40分鐘；洗板3次后用TMB (購自美國Thermo公司)顯色，每孔100μ 1，顯色15分鐘；2Μ硫酸終止反應(yīng)，每孔100 μ 1，用酶標儀測定450nm處吸光值(?450Μ(以0D630?校正)，并確定終點滴度。結(jié)果顯示在圖1中。
[0088]由圖1可見，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組的免疫應(yīng)答顯著增強，HBsAg特異性抗體滴度可達4.0個對數(shù)值，與HBsAg+Al (OH) 3組比較，具有顯著性差異(P < 0.001)，特異性抗體滴度(效價)可增加3倍左右。上述結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物疫苗相比于Al (OH)3佐劑乙肝疫苗能顯著增強乙肝表面抗原特異性總IgG的免疫應(yīng)答。
[0089]實施例2.乙肝表面抗原(HBsAg)與乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN聯(lián)用增強乙肝表面抗原保護性抗體水平。
[0090]檢測乙型肝炎病毒表面抗體的作用是監(jiān)測乙肝疫苗的接種是否成功。乙肝疫苗刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相當于中和抗體的乙型肝炎病毒表面抗體，其效價與疫苗的保護力直接相關(guān)，所述抗體的產(chǎn)生對防止HBV感染具有顯著效果。因此，本發(fā)明人選用了國際通用的ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗體國際單位測試系統(tǒng)(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測定法，CMIA)來檢測免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗體(抗HBsAg)的濃度，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，從而評價HBsAg+HBcAg+CpG-ODN的組合相對于HBsAg+Al (OH) 3聯(lián)用對增強保護性抗體水平的保護力效果。
[0091]本實施例中使用BALB/c小鼠，雌性，6_8周，購自上海斯萊克公司。本實施例中所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN和Al (OH) 3佐劑如實施例1中所述。
[0092]HBsAg和HBcAg用 PBS稀釋至 10 μ g/ml ;CpG_0DN用 PBS稀釋至 20 μ g/ml。對BALB/c小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100 μ I，每組10只小鼠。HBsAg+Al (OH) 3組每只小鼠注射I μ g經(jīng)Al (OH) 3吸附的HBsAg，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組每只小鼠注射I μ gHBsAgUu g HBcAg和2yg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天采血并分離出血清。將血清進行原倍混血或個血用PBS溶液稀釋(對于250 < IU < 1000,500倍稀釋個血送樣，IU> 1000，5000倍稀釋個血送樣)送至東南大學(xué)第二附屬醫(yī)院進行檢測，用ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗體國際單位測試系統(tǒng)(化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測定法，CMIA)檢測免疫小鼠血清中的乙型肝炎病毒表面抗體(ABBOTT公司ARCHITECT系統(tǒng)檢測)，結(jié)果顯示在圖2中。
[0093]由圖2可見，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組可顯著增強保護性抗體水平，特異性保護抗體滴度可達4.3個對數(shù)值，與HBsAg+Al (OH) 3組比較，具有顯著性差異(P < 0.05)，特異性保護抗體滴度(效價)可增加5倍左右。上述結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物疫苗比Al (OH)3佐劑乙肝疫苗能顯著增強乙肝表面抗原保護性抗體水平，增強疫苗保護力。
[0094]實施例3.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN聯(lián)用在體液免疫水平增強乙肝表面抗原Th2免疫應(yīng)答。
[0095]根據(jù)實施例1所述的方法，測定本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物對小鼠Th2類免疫應(yīng)答的影響，不同之處在于檢測時所使用的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgGl (購自美國SouthernB1tech公司)，稀釋倍數(shù)為1: 20000。結(jié)果顯示在圖3中。
[0096]抗原特異性免疫應(yīng)答分為Thl和Th2兩種類型，其中Th2類應(yīng)答與高水平的抗原特異性IgGl抗體滴度相對應(yīng)。Al (OH) 3是一種極強的Th2類疫苗佐劑，能夠抑制Thl類免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為免疫后誘生高水平的特異性IgGl抗體。在本實施例中，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物產(chǎn)生的IgGl抗體水平比HBsAg+Al (OH)3組顯著更高(P < 0.001) ,HBsAg特異性IgGl抗體滴度(效價)可增加接近10倍。上述結(jié)果表明，本發(fā)明組合物能產(chǎn)生比Al (OH)3佐劑組還強的HBsAg特異性IgGl抗體，增強乙肝表面抗原Th2免疫應(yīng)答。
[0097]實施例4.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN聯(lián)用在體液免疫水平增強乙肝表面抗原Thl免疫應(yīng)答。
[0098]根據(jù)實施例1所述的方法，測定本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物對小鼠Thl類免疫應(yīng)答的影響，不同之處在于檢測時所使用的酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG2a(購自美國SouthernB1tech公司)，稀釋倍數(shù)為1: 6000。結(jié)果顯示在圖4中。
[0099]實施例3中提到，Al (OH) 3是一種極強的Th2類疫苗佐劑，能夠抑制Thl類免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為免疫后誘生極低水平的特異性IgG2a抗體。在本實施例中，Al (OH)3作為HBsAg佐劑誘生的特異性IgG2a抗體滴度僅為2.17個對數(shù)值。用本發(fā)明的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物免疫時，產(chǎn)生的HBsAg特異性IgG2a抗體滴度增加2個對數(shù)值左右，即100倍。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN聯(lián)用極強地刺激針對乙肝表面抗原的Thl免疫應(yīng)答。
[0100]實施例5.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN聯(lián)用在體液免疫水平促進乙肝表面抗原Thl/Th2免疫應(yīng)答平衡。
[0101]根據(jù)實施例3和實施例4所述，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物不僅對小鼠產(chǎn)生較高水平的Th2類免疫應(yīng)答，同時也產(chǎn)生極高水平的Thl類免疫應(yīng)答。Thl促進CTL反應(yīng)即所謂的細胞免疫傾向，而Th2則促進抗體產(chǎn)生即所謂的體液免疫傾向，而治療性乙肝疫苗的一個目的是清除血清中HBsAg抗原，這需要產(chǎn)生有效的保護性抗體，主要是體液免疫發(fā)揮作用；另一個目的是殺傷感染HBV的靶細胞，即CTL反應(yīng)，需要細胞免疫發(fā)揮作用，所以Thl和Th2免疫應(yīng)答都非常重要。為了更直接地說明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物和HBsAg+Al (OH)3對照組產(chǎn)生的免疫應(yīng)答偏向于Tl或Th2應(yīng)答方向，將分析抗原特異性IgG2a/IgGl滴度比值(LoglO)，結(jié)果顯示在圖5中，若比值小于O說明免疫應(yīng)答偏向于Th2，大于O說明免疫應(yīng)答偏向于Thl，接近O說明免疫應(yīng)答趨于平衡。分析結(jié)果表明，Al (OH)3作為HBsAg佐劑的對照組產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要以IgGl為主，偏向于Th2應(yīng)答；而HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物產(chǎn)生的特異性IgGl和IgG2a相當，使免疫應(yīng)答趨于Thl/Th2平衡。
[0102]實施例6.乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和CpG-ODN聯(lián)用產(chǎn)生的抗 HBcAg 抗體亞型 IgG2a > IgGl。
[0103]乙肝感染患者治愈人群的抗HBcAg抗體亞型為IgG3 > IgGl > IgG4，其在小鼠中對應(yīng)的抗體亞型關(guān)系為IgG2a > IgG2b > IgGl或者IgG2b > IgG2a > IgGl。根據(jù)實施例3和實施例4所述的方法，測定本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物對小鼠抗HBcAg抗體亞型IgG2a和IgGl滴度，考察本組合物是否可促進小鼠抗HBcAg抗體亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2a >IgGl,不同之處在于檢測時所使用的包被抗原為I μ g/ml HBcAg。結(jié)果顯示在圖6中。圖6結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物產(chǎn)生的抗HBcAg抗體亞型IgG2a > IgGl，且具有顯著性差異(P <0.001)。說明該組合物可促進小鼠抗HBcAg抗體亞型轉(zhuǎn)變?yōu)橐腋胃腥局斡颊叩目贵w亞型。
[0104]實施例7.乙肝表面抗原、乙肝核心抗原與CpG-ODN聯(lián)用在細胞免疫方面顯著促進HBsAg CTL表位特異性Thl細胞分化和抑制Th2細胞增殖。
[0105]為了闡明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物聯(lián)用在細胞免疫方面的作用，本發(fā)明人分別將HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和Al (OH) 3佐劑混勻，免疫小鼠，通過ELI SPOT實驗檢測免疫小鼠脾細胞經(jīng)HBsAgCTL表位刺激后特異性分泌IFN- Y和IL-4的水平，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，即可評價HBsAg HBcAg、與CpG-ODN聯(lián)用相對于HBsAg與Al (OH) 3聯(lián)用的促抗原特異性Thl細胞分化作用。
[0106]本實施例中所使用的為BALB/c小鼠，雌性，6-8周，購自上海斯萊克公司；所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN和Al (OH) 3佐劑如實施例1中所述。
[0107]HBsAg和HBcAg用 PBS稀釋至 10 μ g/ml ;CpG_0DN用 PBS稀釋至 20 μ g/ml。對BALB/c小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100 μ 1，每組5只小鼠。HBsAg+Al (OH)3組每只小鼠注射I μ g經(jīng)Al (OH) 3吸附的HBsAg，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組每只小鼠注射I μ gHBsAgUug HBcAg和2yg CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天取脾，按常規(guī)方法制備脾淋巴細胞，具體如下:無菌操作取脾臟:用無菌鑷子及剪刀剪取脾臟，放于70 μ m尼龍網(wǎng)篩(購自BD公司)中，置于含有5ml預(yù)冷處理的2% FBS(購自GIBCO公司)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾臟，脾臟細胞通過篩目進入平皿中，得到細胞懸液，用巴氏吸管將懸液放入經(jīng)40 μ m尼龍網(wǎng)篩過濾(購自BD公司)的50ml無菌離心管；300Xg，4°C離心10分鐘；棄去上清，加入5ml I X破紅劑(購自BD公司)重懸細胞，室溫作用5分鐘，以破碎紅細胞；加入5ml 2% FBS-PBS終止破紅反應(yīng)；300Xg，4°C離心5分鐘；棄去上清，加入2ml2% FBS-PBS重懸細胞備用。用Mouse IFN- y /IL-4ELISP0T試劑盒(BD公司)檢測抗原特異性的IFN-Y和IL-4分泌，刺激物為HBsAg的肽庫。試驗完成后，用ImmunoSPOT Series3自動讀板機上讀取斑點數(shù)。
[0108]HBsAg肽庫，由54個15氨基酸的多肽片段組成，涵蓋整個HBsAg全長序列，每對相鄰多肽有11個氨基酸的相互重疊，代表所有可能的HBsAg CTL表位。HBsAg肽庫的肽段設(shè)計如序列 SEQ ID NO:7 ~SEQ ID N0:60 所不。所有妝段由 Chinese Peptide Company 合成，純化，分裝和凍干。
[0109] 具體抗原特異性的IFN- Y和IL-4分泌的檢測步驟如下:用PBS稀釋MouseIFN-Y/IL-4 (I: 200稀釋，BD公司)，100 μ I/孔加至ELISP0T板，4°C包被過夜；棄去包被抗體，用封閉液(含10% FBS RPM1-1640培養(yǎng)液)洗孔I次，加入封閉液200 μ I/孔，室溫孵育2h ;采用10% FBS-1640培養(yǎng)基稀釋肽庫至10 μ g/ml ;采用10% FBS-1640培養(yǎng)基稀釋ConA至20 μ g/ml作為陽性對照；棄去封閉液，將I X 17細胞/ml的脾淋巴細胞懸液與配置好的肽庫或ConA對照按100 μ I/孔分別加入96孔板中，一式兩孔重復(fù)；于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱孵育24h ;棄去細胞懸液，用去離子水洗板2次，3-5m/次，用PBST洗滌3次，200 μ I/孔，加入用 10% FBS PBS 稀釋的 Mouse IFN- y /IL-4 ELI SPOT detect1n Antibody(l: 250稀釋，BD公司)，100 μ I/孔，室溫孵育2h ;棄去檢測抗體，用PBST洗板4次，200 μ I/孔，加入用 10%FBS PBS 稀釋 Sti^ptavidian-HRPd: 100 稀釋，BD 公司)，100 μ I/孔，室溫孵育Ih ;棄去酶結(jié)合物，用PBST洗4次，再用PBS洗3次，加入AEC底物100 μ I/孔顯色，肉眼觀察斑點形成，加去離子水終止反應(yīng)；在ImmunoSPOT Series 3自動讀板機上讀取斑點數(shù)。結(jié)果顯示在圖7中。
[0110]Thl細胞主要抗原特異性分泌IL-2、IL-12、IFN-Y和TNF-β/等，介導(dǎo)與細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細胞免疫及遲發(fā)型超敏性炎癥的形成，Th2細胞主要抗原特異性分泌IL-4、 IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能為刺激B細胞增殖并產(chǎn)生抗體，與體液免疫相關(guān)。IFN- Y可誘導(dǎo)Thl細胞分化，但抑制Th2細胞增殖；IL-4誘導(dǎo)Th2細胞分化。本實施例中，用ELISP0T檢測免疫小鼠的脾細胞的抗原特異性IFN- Y和IL-4的分泌水平，結(jié)果Al (OH) 3作為HBsAg佐劑分泌HBsAg特異性IL-4水平高于IFN- Y，說明Al (OH) 3佐劑主要刺激B細胞增殖產(chǎn)生抗體，而用本發(fā)明的HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物分泌HBsAg特異性IFN- Y水平遠高于IL-4水平，說明本發(fā)明組合物主要參與HBsAg特異性細胞免疫，促進Thl細胞分化，達到Thl/Th2細胞增殖平衡，因此兼具有殺傷感染HBV的肝細胞和清除游離HBV病毒的潛能。
[0111]實施例8.HBcAg.HBsAg和CpG-ODN聯(lián)用在產(chǎn)生抗原特異性IgG抗體水平上具有協(xié)同作用
[0112]為了考察HBcAg、HBsAg和CpG-ODN聯(lián)用是否有協(xié)同作用，本發(fā)明人分別將HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和CpG-ODN混勻，免疫小鼠，測定血清中HBsAg特異性總IgG，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，即可評價HBcAg、HBsAg和CpG-ODN聯(lián)用產(chǎn)生的抗原特異性IgG抗體水平上具有協(xié)同作用。
[0113]本實施例中所使用的為BALB/c小鼠，雌性，6-8周，購自上海斯萊克公司；所使用的HBsAg抗原、HBcAg、CpG-ODN和Al (OH) 3佐劑如實施例1中所述。
[0114]HBsAg 和 HBcAg 用 PBS 稀釋至 10 μ g/ml ；CpG-ODN 用 PBS 稀釋至 20 μ g/ml。對BALB/c小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100μ 1，每組10只小鼠。
[0115]HBsAg+CpG-ODN 組每只小鼠注射 I μ g HBsAg 和 2 μ g CpG-ODN，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 組每只小鼠注射 I μ g HBsAg、I μ g HBcAg 和 2 μ g CpG-ODN0 每三周免疫一次，在二免后十天采血并分離出血清，按照常規(guī)方法用2%脫脂奶對該血清以1: 30稀釋倍數(shù)起始，再進行3倍系列稀釋，用于檢測抗原特異性IgG總抗體。
[0116]根據(jù)實施例1所述的方法，測定本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組和HBsAg+CpG-ODN組產(chǎn)生的HBsAg特異性抗體滴度。結(jié)果顯示在圖8中。
[0117]由圖8 可見，HBcAg、HBsAg 和 CpG-ODN 聯(lián)用相對于 HBsAg+CpG-ODN 組產(chǎn)生的 HBsAg特異性IgG水平更高，特異性抗體滴度可達4.0個對數(shù)值，具有顯著性差異(P < 0.01)，特異性抗體滴度(效價)可增加3倍左右。上述結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物在加入HBcAg后比HBsAg+CpG-ODN聯(lián)用產(chǎn)生顯著更高的HBsAg特異性IgG抗體水平，證明HBcAg、HBsAg和CpG-ODN具有協(xié)同作用。
[0118]實施例9.HBcAg、HBsAg和CpG-ODN聯(lián)用比HBsAg+CpG-ODN在細胞免疫方面促進HBsAg特異性的Thl細胞分化。
[0119]實施例8中在體液免疫方面考察了 HBcAg、HBsAg和CpG-ODN具有協(xié)同作用，本發(fā)明人還在細胞免疫方面分析了 HBcAg、HBsAg和CpG-ODN聯(lián)用是否促進HBsAg的Thl細胞分化，從而進一步驗證HBcAg、HBsAg和CpG-ODN的協(xié)同作用。
[0120]分別將HBsAg、HBcAg和CpG_0DN，HBsAg與CpG-ODN佐劑混勻，免疫小鼠，通過ELISP0T實驗檢測免疫小鼠脾細胞分泌IFN- Y和IL-4的水平，即可評價HBsAg與HBcAg、CpG-ODN聯(lián)用相對于HBsAg+CpG-ODN聯(lián)用對促進HBsAg的Thl細胞分化的趨勢。
[0121]本實施例中所使用的為BALB/c小鼠，雌性，6-8周，購自上海斯萊克公司；所使用的HBsAg、HBcAg和CpG-ODN同實施例1中所述。
[0122]HBsAg和HBcAg用 PBS稀釋至 10 μ g/ml ;CpG_0DN用 PBS稀釋至 20 μ g/ml。對BALB/c小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100μ 1，每組10只小鼠。HBsAg+CpG-ODN組每只小鼠注射I μ g HBsAg和2 μ g CpG-ODN, HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組每只小鼠注射I μ gHBsAg、l μ g HBcAg和2 μ g CpG-ODN。每三周免疫一次，在二免后十天取脾，按常規(guī)方法制備脾淋巴細胞，用Mo μ se IFN- y /IL-4 ELI SPOT試劑盒(BD公司)檢測IFN- Y和IL-4，刺激物為HBsAg的肽庫(具體序列如實施例7所述)。實驗完成后，用ImmunoSPOT Series3自動讀板機上讀取斑點數(shù)。
[0123]根據(jù)實施例7所述的方法，測定本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物和HBsAg+CpG-ODN組脾細胞H BsAg表位特異性IFN- Y和IL-4的分泌水平。結(jié)果顯示在圖9中。
[0124]由圖9 可見，HBcAg 與 HBsAg+CpG-ODN 聯(lián)用相對于 HBsAg+CpG-ODN 組分泌的 HBsAg特異性IFN- Y水平高，而HBsAg特異性IL-4水平低，表明本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物相比于HBsAg+CpG-ODN聯(lián)用在細胞免疫方面更能促進HBsAg特異性的Thl細胞分化，說明HBcAg、HBsAg和CpG-ODN具有協(xié)同作用。
[0125]實施例10.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物突破HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)的免疫耐受。
[0126]為了驗證HBsAg+HBcAg+CpG-ODN聯(lián)用能否在HBV轉(zhuǎn)基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上突破免疫耐受，本發(fā)明人分別將HBsAg、HBcAg和CpG-ODN，HBsAg和Al (OH) 3佐劑混勻，免疫小鼠，測定血清中HBsAg特異性總IgG和保護性抗體IU水平，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，從而評價HBsAg、HBcAg和CpG-ODN聯(lián)用相對于HBsAg和Al (OH) 3聯(lián)用對突破免疫耐受的影響。
[0127]本實施例中所使用免疫耐受小鼠有兩種:第一種為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,血清型為adr血清型，雄性，10-12周，購自上海南方模式動物中心；第二種為B10.M小鼠，為組織相容性小鼠，具有免疫耐受，雄性，6-8周，購自The Jackson Laboratory ;所使用的HBsAg、HBcAg和、CpG-ODN和Al (OH) 3佐劑如實施例1中所述。
[0128]HBsAg 和 HBcAg 用 PBS 稀釋至 10 μ g/ml ；CpG-ODN 用 PBS 稀釋至 20 μ g/ml。對小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100μ 1，每組4只小鼠。
[0129]HBsAg+Al (OH) 3 組每只小鼠注射 I μ g 經(jīng) Al (OH) 3 吸附的 HBsAg，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 組每只小鼠注射 I μ g HBsAg、l μ g HBcAg 和 10 μ g CpG-ODN0 每三周免疫一次，每次免疫后兩周采血，共免疫6次，按照實施例1中所述方法檢測HBsAg特異性IgG總抗體，結(jié)果顯示在圖10中，按照實施例2中所述方法檢測產(chǎn)生的HBsAg抗體，結(jié)果顯示在圖11中。
[0130]由圖10可見，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物組可突破兩種模型小鼠的免疫耐受，HBsAg特異性IgG抗體滴度可達4.0個對數(shù)值以上，與HBsAg+Al (OH) 3組比較，具有顯著性差異(P < 0.05)，HBsAg特異性IgG抗體滴度(效價)可增加10-200倍；由圖11可見，保護性抗體水平可達2.5個對數(shù)值以上，與HBsAg+Al (OH) 3組比較，產(chǎn)生的保護性抗體水平高可增加5-20倍。上述結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物疫苗比Al (OH)3佐劑乙肝疫苗在免疫耐受小鼠上能顯著增強乙肝表面抗原特異性的總IgG和保護性抗體的免疫應(yīng)答，更能有效的突破免疫耐受。
[0131]實施例11.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B1.M)，產(chǎn)生高滴度抗HBcAg的特異性IgG抗體。
[0132]為了驗證HBsAg+HBcAg+CpG-ODN聯(lián)用能否在HBV轉(zhuǎn)基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上，產(chǎn)生抗HBcAg的特異性IgG抗體，本發(fā)明人將HBsAg、HBcAg和CpG-ODN混勻，免疫小鼠，測定血清中HBcAg特異性總IgG水平。
[0133]本實施例中所使用免疫耐受小鼠有兩種，如實施例10所述；所使用的HBsAg、HBcAg和CpG-ODN同實施例1中所述。
[0134]HBsAg 和 HBcAg 用 PBS 稀釋至 10 μ g/ml ；CpG-ODN 用 PBS 稀釋至 20 μ g/ml。每只小鼠經(jīng)左后肢腓腸肌注射I μ g HBsAgU μ g HBcAg和10 μ g CpG-ODN0每只小鼠，注射體積為100μ I,每組4只小鼠。每三周免疫一次,每次免疫后兩周采血,共免疫6次,按照實施例1中所述方法檢測HBcAg抗原特異性IgG總抗體，不同之處在于，包被抗原為I μ gHBcAg抗原，結(jié)果顯不在圖12中。
[0135]由圖12可見，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物可在兩種模型小鼠上，產(chǎn)生高滴度的抗HBcAg特異性IgG抗體，在一免后二周抗體滴度即可達2.5個對數(shù)值以上，此后抗體滴度可達4.0個對數(shù)值以上。上述結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物產(chǎn)生高滴度抗HBcAg的特異性IgG抗體。
[0136]實施例12.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)中產(chǎn)生的抗HBcAg抗體亞型IgG2a> IgGl。
[0137]為了驗證HBsAg+HBcAg+CpG-ODN聯(lián)用在HBV轉(zhuǎn)基因模型小鼠和免疫耐受小鼠上產(chǎn)生的抗HBcAg抗體亞型IgG2a > IgGl，本發(fā)明人將HBsAg、HBcAg和CpG-ODN混勻，免疫小鼠，測定血清中抗HBcAg抗體亞型IgG2a和IgGl滴度。
[0138]本實施例中所使用免疫耐受小鼠有兩種，如實施例10所述；所使用的HBsAg、HBcAg和CpG-ODN同實施例1中所述。
[0139]HBsAg 和 HBcAg 用 PBS 稀釋至 10 μ g/ml ；CpG-ODN 用 PBS 稀釋至 20 μ g/ml。每只小鼠經(jīng)左后肢腓腸肌注射I μ g HBsAgU μ g HBcAg和10 μ g CpG-ODN0每只小鼠，注射體積為100μ I,每組4只小鼠。每三周免疫一次,每次免疫后兩周采血,共免疫6次,按照實施例6中所述方法檢測抗HBcAg抗體亞型IgG2a和IgGl滴度，結(jié)果顯示在圖13中。
[0140]圖13結(jié)果表明，本發(fā)明HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(adr血清型)和免疫耐受小鼠(B10.M)中產(chǎn)生在的抗HBcAg抗體亞型IgG2a > IgGl，且具有顯著性差異(P < 0.01)。
[0141]實施例13.HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物有清除HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中HBsAg抗原的趨勢。
[0142]對HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物突破HBV轉(zhuǎn)基因小鼠免疫耐受，并產(chǎn)生抗原特異性抗體的小鼠進行分析，研究它們體內(nèi)HBsAg表達量是否可以出現(xiàn)下降趨勢，驗證抗體對血清中HBsAg抗原的清除情況。
[0143]本實施例中所使用的為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，血清型為adr血清型(從C57小鼠改造而來)，雄性，10-12周，購自上海南方模式動物中心；所使用的HBsAg、HBcAg、CpG-ODN和Al (OH)3佐劑如實施例1中所述。
[0144]HBsAg 和 HBcAg 用 PBS 稀釋至 10 μ g/ml ；CpG-ODN 用 PBS 稀釋至 20 μ g/ml。對小鼠進行左后肢腓腸肌免疫，每只注射體積為100μ 1，每組4只小鼠。HBsAg+Al (OH)3組每只小鼠注射 I μ g 經(jīng) Al (OH) 3 吸附的 HBsAg ；HBsAg+HBcAg+CpG-ODN 組每只小鼠注射 I μ g HBsAg、I μ gHBcAg和10 μ g CpG-ODN。每三周免疫一次，每次免疫后兩周采血，共免疫6次，按照常規(guī)方法用2%脫脂奶對免疫前、五免二周和六免二周后的血清以1: 200稀釋，用實施例1中所述HBsAg抗原作為標準品，用C57小鼠(購自上海斯萊克公司)血清按1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8ng/ml 進行稀釋作為起始濃度，再用2%脫脂奶進行1: 200稀釋，然后將稀釋的樣品和標準品用HBsAg抗原檢測試劑盒(上?？迫A公司)檢測HBsAg抗原濃度。用測定的標準曲線計算免疫前、五免二周和六免二周后個鼠血清中含有的HBsAg抗原濃度，并計算五免二周、六免二周后HBsAg抗原濃度下降％。結(jié)果顯示在圖14中。
[0145]具體HBsAg抗原濃度的檢測步驟如下:取出預(yù)包被抗HBsAg的反應(yīng)板,加入75 μ I稀釋的血清和陰、陽性對照于反應(yīng)孔中；用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置37°C孵育Ih ；取出反應(yīng)板，撕去封片，在已加入待測樣本和陰性、陽性對照孔中加入50μ I酶結(jié)合物；微孔振蕩器上震蕩1s ;用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置37°C孵育30m ;取出反應(yīng)板，撕去封片，洗滌反應(yīng)板5次；洗滌結(jié)束后立即在所有孔內(nèi)加入顯色劑A、顯色劑B各50μ 1，混勻；微孔振蕩器上震蕩1s ;用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置37°C孵育30m ;在所有孔內(nèi)加Λ 50 μ I終止液，震蕩反應(yīng)5s，使之充分混勻。酶聯(lián)儀測定OD45tlnm值(以O(shè)D63tlnm校正)。
[0146]由圖14所示，HBsAg+HBcAg+CpG-ODN組合物組在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠上的HBsAg抗原濃度下降％高于HBsAg+Al (OH)3組，具有顯著性差異(P < 0.05)。表明該組合物具有清除HBsAg抗原并使HBsAg抗原轉(zhuǎn)陰的趨勢，為慢性乙肝治療性疫苗打下堅實的基礎(chǔ)。
[0147]在本申請中，多個出版物在括號中被引用。由此，這些出版物的公開以整體通過引用并入本申請，以更完整的描述與本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)的狀態(tài)。
[0148] 盡管通過公開的實施方案描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當容易理解，具體的實施例和上文詳述的研究只是對本發(fā)明的舉例說明。應(yīng)當理解在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可作出各種修改。因此，本發(fā)明只受所附權(quán)利要求的限制。
【權(quán)利要求】
1.一種藥物組合物,其包含: i)乙肝表面抗原(HBsAg)， ii)乙肝核心抗原(HBcAg), iii)CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)，和 iv)可藥用載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其用作預(yù)防性或治療性疫苗。
3.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述HBsAg具有SEQID NO:1所示序列。
4.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述HBcAg具有SEQID N0:2所示序列。
5.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述CpG-ODN包含硫代磷酸酯連接，優(yōu)選地所述CpG-ODN是全硫代寡聚脫氧核苷酸。
6.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述CpG-ODN包含兩個或更多個5’ -NTCGTT-3’ 基序。
7.根據(jù)以上任一 權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述CpG-ODN長度為15~35個核苷酸，優(yōu)選20~25個核苷酸。
8.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述CpG-ODN具有選自下列的序列:5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT-3，(SEQ ID NO:3)、5，-TCG TTC GTT CGT TCG TTCGTT CGT T-3，(SEQ ID NO:4)、5，-TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG-3’ (SEQ ID NO:5)和5，-TCC ATGACG TTC CTGACG TT-3，(SEQ ID NO:6)，優(yōu)選地所述 CpG-ODN 具有序列:5，_TCGTTC GTT CGT TCG TTC GTT-3’ (SEQ ID NO:3)。
9.根據(jù)以上任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中組分i)，ii)以及iii)之間的相對重量比范圍是1: 0.2~5: I~50，優(yōu)選為1:1~5: 2~15。
10.一種藥盒，其包含權(quán)利要求1-9任一項的藥物組合物以及其使用說明。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的藥物組合物在制備用于在對象中治療HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病之藥物中的用途，優(yōu)選地所述HBV感染和/或HBV介導(dǎo)的疾病選自乙型肝炎、肝硬化和肝癌。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的藥物組合物在制備用于在對象中產(chǎn)生針對HBV的免疫應(yīng)答之藥物中的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的藥物組合物在制備用于在對象中使抗HBc抗體發(fā)生亞型轉(zhuǎn)變之藥物中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的藥物組合物在制備用于在對象中突破乙型肝炎病毒免疫耐受之藥物中的用途。
【文檔編號】A61K39/29GK104043120SQ201310080863
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】杜笑寒, 葛君, 莊曉倩, 宋翠靈, 周童, 孫瑩, 王美菊 申請人:江蘇先聲藥業(yè)有限公司