專利名稱：作為疫苗的hiv嵌合融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主 要涉及人類免疫缺陷性病毒(HIV)疫苗；更具體而言，本發(fā)明涉及一種 可誘導(dǎo)體液及細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的HIV嵌合融合蛋白。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)蔓延全球，使我們急需可抵抗第一型人類免疫缺 陷性病毒(HIV-I)的疫苗。此外，AIDS疫苗可能必須產(chǎn)生有效率的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)才 能有效。HIV疫苗所誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，主要應(yīng)實(shí)現(xiàn)以病毒中和抗體及抗HIV細(xì)胞毒性 (CD8+)T淋巴細(xì)胞(CTLs)介導(dǎo)的免疫。HIV的病毒蛋白是由多個(gè)主要基因予以編碼。gag基因負(fù)責(zé)編碼病毒殼體蛋白 P24、核殼蛋白p6與p7，以及基質(zhì)蛋白pl7。pol基因負(fù)責(zé)編碼反轉(zhuǎn)錄酶、嵌入酶，以及可將 衍生自gag與pol的蛋白切割為功能性蛋白的蛋白酶。env基因負(fù)責(zé)編碼gpl20與gp41的 前驅(qū)蛋白，其中g(shù)pl20與gp41是內(nèi)嵌于病毒包膜的包膜蛋白，并使病毒得以附著并融合于 靶細(xì)胞。tat、rev、nef、vif、Vpr, vpu基因則分別編碼同名的單一蛋白Tat、Rev、Nef、Vif、 Vpr 與 Vpu0通過(guò)HIV-I感染試驗(yàn)的動(dòng)物模型，已證實(shí)中和抗體有助于預(yù)防病毒感染。在 第一型人類免疫缺陷性病毒中，可與中和抗體結(jié)合的病毒特異性靶點(diǎn)為包膜糖蛋白 (Yang, X.等人(2005) "Stoichiometry of Antibody Neutralization of Human Immonodeficiency Virus Type 1” ( “第一型人類免疫缺陷性病毒的抗體中和反應(yīng)的化學(xué) 計(jì)量”)，Journal of Virology (“病毒學(xué)期刊”)，79 :3500_3508)。在感染 HIV-1 的一般 過(guò)程中常會(huì)產(chǎn)生病毒中和抗體，但中和效價(jià)往往偏低。大部分的中和抗體可與gpl20包膜 糖蛋白結(jié)合，而gpl20包膜糖蛋白正是病毒包膜糖蛋白三聚物的主要外露蛋白。此外，中和 抗體的靶點(diǎn)還包括HIV-lgpl20糖蛋白其保守性較高的受體結(jié)合表面。例如，CD4結(jié)合位點(diǎn) (CD4BS)抗體可識(shí)別由數(shù)個(gè)重迭于CD4結(jié)合位點(diǎn)的gpl20區(qū)片段所構(gòu)成的結(jié)構(gòu)表位，而CD4 所誘導(dǎo)(CD4i)的抗體則可與高度保守的gpl20片段結(jié)合，該片段與趨化因子受體相互作用 高度相關(guān)。CDBS與CD4i抗體可干擾受體的結(jié)合，因而具有中和的能力。Gpl20包含十個(gè)結(jié)構(gòu)域具保守性的結(jié)構(gòu)域1-5(C1_C5)及具可變性的結(jié)構(gòu)域 1-5(V1-V5)，其中結(jié)構(gòu)域Cl與C5分別位于gpl20的N端(N-terminal，氨基端)與C端 (C-terminal，羧基端)。以V3環(huán)(其負(fù)責(zé)選定趨化因子受體)為靶點(diǎn)的抗體可阻斷gpl20 結(jié)合至受體CCR5和/或CXCR4，因而具有中和的效力，但往往僅限于對(duì)少數(shù)的HIV-I病毒株 有效。Gp 120是以非共價(jià)方式與gp41連結(jié)，而gp41亞單位則固定于膜內(nèi)，且gp41亞單 位的N端具有非極性融合肽。gpl20-gp41復(fù)合體于受感染的細(xì)胞表面或于病毒粒子上形 成寡聚物。一般均認(rèn)為，gpl20結(jié)合于gp41時(shí)即啟動(dòng)gp41的膜融合活性，使病毒核殼得以 進(jìn)入細(xì)胞。因此，HIV感染者血清內(nèi)的gp41表位抗體有可能在病毒中和反應(yīng)中扮演重要角 色。在不同HIV亞型的gpl20-41復(fù)合體序列中，均顯示gp41具有高度保守的N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，以及可與gpl20的N端核心結(jié)構(gòu)相互作用的C端殘基。HIV感染的防治與清除涉及諸多免疫效應(yīng)子。例如，若欲防止宿主靶細(xì)胞受到感 染，須使用抗體；而在首批靶細(xì)胞感染病毒后，則須以細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及抗體共同殺死 受感染的細(xì)胞。有效的HIV疫苗除應(yīng)誘導(dǎo)可與病毒結(jié)合的抗體，以防止病毒附著于靶細(xì)胞 夕卜，還應(yīng)誘導(dǎo)可消滅任何受感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。 疫苗學(xué)家迄今仍難以建構(gòu)有效且安全的活性減毒疫苗，或模擬病毒蛋白在重組抗 原感染實(shí)例(或由載有適當(dāng)基因或抗原的復(fù)制或非復(fù)制載體加以感染的實(shí)例)中的表現(xiàn)。 此外，gpl20其V3結(jié)構(gòu)域中的大量突變，也限制了其作為HIV疫苗的靶點(diǎn)的實(shí)用性。再者， 可變結(jié)構(gòu)域的高可變性趨勢(shì)如何發(fā)展？在HIV病毒株演化過(guò)程中究竟有多少結(jié)構(gòu)域是絕 對(duì)不變的？這些問(wèn)題也沒(méi)有明確的答案。因此，如何解決HIV疫苗抗原生產(chǎn)的不足，尤其是提供有效的抗原決定簇肽，的確 是相關(guān)領(lǐng)域中的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
在決定中和表現(xiàn)型時(shí)，gpl20與gp41的相互作用極為重要，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)此 已詳加研究。本發(fā)明的一個(gè)方面是關(guān)于一種嵌合融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導(dǎo)對(duì) HIV抗原具有專一性的免疫反應(yīng)。該嵌合體包含(a)第一多肽區(qū)，其包含假單胞菌外毒素 A(Pseudomonas Exotoxin A ；ΡΕ)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PE轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，且位于該融合蛋白的N端； 和(b)第二多肽區(qū)，其位于該融合蛋白的C端，且包括(i)第一肽段，其包含gpl20Cl結(jié)構(gòu) 域的片段，且位于該第二多肽區(qū)的N端；(ii)第二肽段，其包含gpl20C5結(jié)構(gòu)域的片段，且 位于該第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片段，且位于該第二 肽段的C端，其中所述第二多肽區(qū)包含抗原決定簇，該抗原決定簇對(duì)HIV的一種亞型具有專 一性。該HIV亞型為選自HIV亞型A、B、C、D、E、F、G、H、J與K中的至少一種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該融合蛋白進(jìn)一步包括位于C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列， 例如氨基酸序列KDEL。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，該嵌合融合蛋白進(jìn)一步包括中間多肽 區(qū)，該中間多肽區(qū)位于第一多肽區(qū)與第二多肽區(qū)之間，且包含非Env的HIV抗原決定簇。在 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該中間多肽區(qū)為選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。在本 發(fā)明的另一實(shí)施例中，該中間多肽區(qū)包括Gag24氨基酸序列或其片段。在本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施例中，該中間多肽區(qū)包含Gag24氨基酸序列的N端或C端。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中， 該中間多肽區(qū)包含SEQ ID NO: 151所述的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是關(guān)于一種HIV嵌合融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導(dǎo)對(duì) HIV抗原具有專一性的免疫反應(yīng)，其中該HIV嵌合融合蛋白包括(a)第一多肽區(qū)，其包含 PE結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PE轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，且位于該融合蛋白的N端；和(b)第二多肽區(qū)，其包含HIV 蛋白或其片段，且位于該融合蛋白的C端，其中所述第二多肽區(qū)包含抗原決定簇，該抗原決 定簇對(duì)HIV的一種亞型具有專一性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，第二多肽區(qū)包含HIV Env的片段。在本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施例中，所述第二多肽區(qū)包含gpl20V3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)片段。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí) 施例中，所述第二多肽區(qū)包含SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中， 所述第二多肽區(qū)包含HIV蛋白或其片段，且該HIV蛋白選自Gag24，Nef, Tat與Rev中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，第二多肽區(qū)包含HIV Gag24氨基酸序列或其片段。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述第二多肽區(qū)是一種嵌合蛋白，其包括(i)第一肽段，其 包含gpl20Cl結(jié)構(gòu)域的片段，且位于該第二多肽區(qū)的N端；(ii)第二肽段，其包含gpl20C5 結(jié)構(gòu)域的片段，且位于該第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片 段，且位于該第二肽段的C端。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例中，所述第二多肽區(qū)包含SEQ ID NO :7所述的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是關(guān)于一種用以誘導(dǎo)對(duì)HIV抗原具有專一性的免疫反應(yīng)的方 法，其步驟為通過(guò)具有生物相容性的載液，施用有效量的上述嵌合融合蛋白，其中該載液適 合將該融合蛋白的預(yù)定等分部分運(yùn)載并傳送至活體受試者體內(nèi)的預(yù)選位點(diǎn)。在一并參閱以下優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明及附圖后，本發(fā)明的上述及其它方面將更 加明顯；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可加以變化及修改而不脫離本發(fā)明的新穎概念的實(shí)質(zhì)與 范圍。附圖顯示了本發(fā)明的一種或多種實(shí)施例，這些附圖的作用為結(jié)合相關(guān)文字?jǐn)⑹鲆?說(shuō)明本發(fā)明的原理。在所有附圖中，已盡可能使用相同的附圖標(biāo)記來(lái)表示實(shí)施例中的相同 或相似組件。


圖IA至IF是HIV嵌合融合蛋白編碼質(zhì)粒的圖譜。圖2A顯示動(dòng)物血清樣本以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)得的效價(jià)，其中動(dòng)物血清 是采自以不同HIV嵌合包膜融合蛋白免疫的動(dòng)物，且血清樣本的稀釋比例為1 2，500。圖2B顯示動(dòng)物血清樣本以ELISA測(cè)得的效價(jià)，其中動(dòng)物血清是采自以不同HIV嵌 合包膜融合蛋白免疫的動(dòng)物，而血清樣本的稀釋比例則為1 12，500。圖3顯示小鼠經(jīng)HIV Env融合蛋白疫苗免疫后產(chǎn)生可抵抗活性病毒的中和抗體。圖4 是建構(gòu) ρΡΕ( Δ IID-HIV gag24_K3 的流程圖。圖5 是建構(gòu) ρΡΕ( Δ IID-HIV gag24_gp 120-41-K3 的流程圖。圖6是HIV抗原決定簇肽融合于gpl20Cl-C5-gp41后生成嵌合體的示意圖，該嵌 合體可強(qiáng)化該抗原決定簇肽的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。圖 7 是建構(gòu) ρΡΕ( Δ IID-HIV nef-NC_K3 的流程圖。
具體實(shí)施例方式本說(shuō)明書(shū)所用的術(shù)語(yǔ)，其在本發(fā)明范圍內(nèi)及在本說(shuō)明書(shū)特定上下文中的解釋大致 依照各術(shù)語(yǔ)于本領(lǐng)域中的通常涵義。本說(shuō)明書(shū)中用以描述本發(fā)明的特定用語(yǔ)將于下文中 或于本說(shuō)明書(shū)他處加以說(shuō)明，以利業(yè)界人士了解本發(fā)明的相關(guān)敘述。為便于閱讀，特定用 語(yǔ)可能以斜體字和/或引號(hào)等格式特別標(biāo)示，但使用特別標(biāo)示并不影響該用語(yǔ)的范圍及涵 義。這些用語(yǔ)不論是否經(jīng)特別標(biāo)示，其在相同上下文中的范圍及涵義均相同。在本文中，相 同的文意可以不同方式表達(dá)。因此，本文所述的用語(yǔ)皆可以其替代用語(yǔ)及同義詞取代，且一 用語(yǔ)是否在本文中經(jīng)詳細(xì)說(shuō)明或討論，并無(wú)任何特別意義。在此將提供特定用語(yǔ)的同義詞， 然而，使用某一同義詞不代表排除其它同義詞。本說(shuō)明書(shū)所提出的實(shí)施例，包括在此所討論 的用語(yǔ)范例，僅出于說(shuō)明的目的，而非用于限制本發(fā)明或任何示例用語(yǔ)的范圍與涵義。同樣地，本發(fā)明同樣不限于在此所列舉的實(shí)施例除非另行定義，否則在此所用的所有技術(shù)與科學(xué)用語(yǔ)的涵義均與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域 內(nèi)的技術(shù)人員所普遍了解的相同。若有相互沖突之處，則以本說(shuō)明書(shū)及其所提供的定義為 解釋依據(jù)。在本文中，“約略”、“大約”或“概為”一般是指一已知數(shù)值或范圍的百分之二十以 內(nèi)，優(yōu)選為百分之十以內(nèi)，更優(yōu)選為百分之五以內(nèi)。本文所列的數(shù)量為約略值，意指即使未 書(shū)明“約略”、“大約”或“概為”等用語(yǔ)，仍包含這些用語(yǔ)的涵義。在本文中，“羧基端部分使融合抗原得以保留在靶細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上”是指肽 片段可使該融合抗原結(jié)合于該ER膜并將其保留于ER腔內(nèi)以實(shí)現(xiàn)糖基化作用，同時(shí)使該融 合抗原看起來(lái)更接近外來(lái)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該羧基端部分包含下列氨基 酸殘基，其沿氨基端至羧基端的方向依次為R1-R2-R3-R4- (R5)n其中R1為帶正電的氨基酸殘基；R2為帶負(fù)電的氨基酸殘基；R3為帶負(fù)電的氨基酸殘基；R4 為 L ；R5為帶正電的氨基酸殘基；且η 為 0 或 1。優(yōu)選地，該羧基端部分為KDEL家族蛋白中的一員。在此所述的“KDEL家族蛋白” 是指一個(gè)蛋白群組，其具有可與細(xì)胞ER膜結(jié)合的相似羧基端，且進(jìn)一步具有可將該蛋白 保留于ER腔內(nèi)的能力。通常，該羧基端的長(zhǎng)度介于4至16個(gè)殘基之間。如美國(guó)專利第 5，705，163號(hào)所述(在此以引用的方式將其全文并入本文)，KDEL家族蛋白其羧基端上的 氨基殘基(尤其是最后五個(gè)氨基酸中的氨基殘基)至關(guān)重要。針對(duì)存在于不同分子中且可 執(zhí)行特定生物機(jī)能的相似序列所做的研究顯示，一種可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中保留新生成蛋白的序列 為L(zhǎng)ys Asp Glu Leu(KDEL)。此發(fā)現(xiàn)說(shuō)明本發(fā)明融合抗原的羧基端序列可作為某種型態(tài)的 識(shí)別序列，以協(xié)助融合抗原從內(nèi)吞區(qū)室移入ER并將其留置于腔內(nèi)。該羧基端部分包含KDEL 序列。例如，該羧基端部分可包含序列KKDLRDELKDEL(SEQ ID NO :250)、KKDELRDELKDEL (SEQ ID NO 251), KKDELRVELKDEL (SEQ ID NO 252)或 KKDELRXELKDEL，其中 R 為 D 或 V。術(shù)語(yǔ)“ΡΕ( Δ IID-HIV gpl20” 與 “ΡΕ ( Δ III)-HIV gpl20V3_V3” 可交替使用。術(shù)語(yǔ)“ΡΕ (Δ III)-HIV gpl20_41” 與"ΡΕ ( Δ III)-HIV gpl20Cl_C5-gp41，，可交替 使用。術(shù)語(yǔ)“HIV亞型A gpl20Cl-C5-gp41”與“嵌合體Α”可交替使用；術(shù)語(yǔ)“HIV亞型B gpl20Cl-C5-gp41”與“嵌合體B”可交替使用；術(shù)語(yǔ)“HIV亞型C gpl20Cl_C5-gp41 ”與“嵌 合體C”可交替使用；依此類推。免疫原為配制免疫原，僅須將本文所述的融合蛋白產(chǎn)物與生物相容性載液混合 即可，只要該生物相容性載液適合將該融合蛋白產(chǎn)物的預(yù)定等分部分運(yùn)載并傳送至活體受 試者體內(nèi)的預(yù)選位點(diǎn)。本發(fā)明的免疫原可利用適當(dāng)?shù)妮d體，以皮內(nèi)、肌內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、陰 道內(nèi)、直腸內(nèi)、經(jīng)口或灌胃等方式施用。這些免疫原可以任何在人體內(nèi)產(chǎn)生抗原性的方式導(dǎo)入，施用劑量則視情況而有所不同，取決于接受者的年齡、健康狀況與體重；同時(shí)進(jìn)行的 療法類別(若有的話)；治療頻率；及所需體液抗體反應(yīng)的性質(zhì)。這些免疫原若需以皮內(nèi)、 皮下、肌內(nèi)、經(jīng)靜脈或腸胃外等方式施用，應(yīng)以無(wú)菌形態(tài)制備，采用多劑或單劑的形式，并分 散于例如無(wú)菌生理食鹽水或注射時(shí)常用的5%葡萄糖溶液等載液中。除此之外，也可采用其 它有利的施用方法。疫苗制備疫苗時(shí)，其配方至少包含本文所述的融合蛋白產(chǎn)物，其用量為預(yù)定； 生物相容性載液，其可將該融合蛋白產(chǎn)物的預(yù)定等分部分運(yùn)載并傳送至活體受試者體內(nèi)的 預(yù)選位點(diǎn)；及至少一種佐劑組合物，其分散于該載液中或與該融合蛋白產(chǎn)物結(jié)合。根據(jù)定 義，該疫苗含有免疫原，且包括一種或多種佐劑，用于促進(jìn)或激發(fā)免疫反應(yīng)并延長(zhǎng)活體內(nèi)的 抗原效果。在常用的佐劑物質(zhì)中，適用的是經(jīng)美國(guó)食品藥物管理局(FDA)核準(zhǔn)的組合物(包 括現(xiàn)已用于或尚未用于全身和/或黏膜免疫的組合物)。部分佐劑適用于經(jīng)黏膜施用的疫 苗，而部分佐劑則適用于以灌胃方式施用的疫苗。施用方式目前已有多種熟知且慣用的接種方式(也就是導(dǎo)入免疫原或疫苗的方 式)。全身性或腸胃外的施用方式(也就是經(jīng)注射或灌注而導(dǎo)入的方式)基本上包括腹膜 內(nèi)接種、靜脈接種、肌內(nèi)接種、皮下接種與真皮下接種。至于經(jīng)黏膜施用方式，不僅包括鼻內(nèi) 及灌胃等導(dǎo)入方式，也包括經(jīng)口或由陰道內(nèi)及直腸內(nèi)導(dǎo)入。
實(shí)施例以下所述僅為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所提供的例示用設(shè)備、器材、方法及相關(guān)結(jié)果，不 應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制。各實(shí)施例的標(biāo)題或子標(biāo)題僅為方便閱讀之用，同樣不應(yīng)視為對(duì)本 發(fā)明的限制。此外，本文雖述及若干學(xué)說(shuō)，但只要本發(fā)明是依據(jù)其本身實(shí)施，而非依據(jù)特定 的學(xué)說(shuō)或?qū)嵤┓桨?，則該等學(xué)說(shuō)無(wú)論正確與否，均不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制。I. HIV-lgpl20 與 gp41 融合蛋白實(shí)施例1 選取HIV Env蛋白gpl20與gp41的截短片段HIV gpl20與gp41的氨基酸序列是取自美國(guó)國(guó)家生物科技信息中心(NCBI，USA) 的數(shù)據(jù)庫(kù)并輸入軟件中，以評(píng)估靶蛋白的抗原決定簇(表位)，并在評(píng)估圖上顯示可用于 合成的候選片段。在選取靶蛋白上可供合成的抗原決定簇區(qū)域時(shí)，是使用逆向基因工程技 術(shù)，然后根據(jù)評(píng)估軟件的評(píng)估結(jié)果，選出若干肽片段作為靶肽。之后再以軟件DNA strider vl. 0分析靶肽的核苷酸序列是否包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；若其出現(xiàn)在DNA序列中的位置并 不理想，則在適當(dāng)?shù)拿艽a子內(nèi)加以調(diào)整而不改變氨基酸序列。接著以軟件檢查新產(chǎn)生的序 列，并于該DNA序列的兩端設(shè)計(jì)出限制位點(diǎn)以便進(jìn)行克隆。部分氨基酸殘基(如Arg、Ile、 Gln與Pro)的密碼子是經(jīng)改造以增強(qiáng)蛋白在大腸桿菌(E. coli)表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。表1 列出所選的肽片段及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。表 權(quán)利要求
一種嵌合融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導(dǎo)對(duì)HIV抗原具有專一性的免疫反應(yīng)，該融合蛋白包含(a)第一多肽區(qū)，其包含假單胞菌外毒素A(PE)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PE轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，且位于該融合蛋白的N端；和(b)第二多肽區(qū)，其位于該融合蛋白的C端，且包括(i)第一肽段，其包含gp120C1結(jié)構(gòu)域的片段，且位于該第二多肽區(qū)的N端；(ii)第二肽段，其包含gp120C5結(jié)構(gòu)域的片段，且位于該第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片段，且位于該第二肽段的C端，其中，所述第二多肽區(qū)包含抗原決定簇，其對(duì)HIV的一種亞型具有專一性。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，在該融合蛋白的C端進(jìn)一步包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中，所述HIV的一種亞型是選自HIV亞型A、B、C、 D、E、F、G、H、J與K中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其進(jìn)一步包含中間多肽區(qū)，該中間多肽區(qū)位于所述 第一多肽區(qū)與第二多肽區(qū)之間，其中，該中間多肽區(qū)包含非Env的HIV抗原決定簇。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區(qū)包含HIV蛋白或其片段，其為 選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。
6.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區(qū)包含Gag24氨基酸序列或其片段。
7.如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區(qū)包含Gag24氨基酸序列的N端 或C端。
8.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區(qū)包含SEQID N0:151所述的氨基酸序列。
9.一種融合蛋白，其可用作免疫原，用于誘導(dǎo)對(duì)HIV抗原具有專一性的免疫反應(yīng)，該融 合蛋白包含(a)第一多肽區(qū)，其包含PE結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PE轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，且位于該融合蛋白的N端；和(b)第二多肽區(qū)，其包含HIV蛋白或其片段，且位于該融合蛋白的C端， 其中，所述第二多肽區(qū)包含抗原決定簇，其對(duì)HIV的一種亞型具有專一性。
10.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，在該融合蛋白的C端進(jìn)一步包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列。
11.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)包含HIVEnv的片段。
12.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)包含gpl20V3結(jié)構(gòu)域的一個(gè) 或多個(gè)片段。
13.如權(quán)利要求12所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)包含SEQIDNO :6所述的氨基酸序列。
14.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)包含HIV蛋白或其片段，其為 選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。
15.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)包含HIVGag24氨基酸序列 或其片段。
16.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)是嵌合蛋白，該嵌合蛋白包含(i)第一肽段，其包含gpl20Cl結(jié)構(gòu)域的片段，且位于該第二多肽區(qū)的N端； ( )第二肽段，其包含gpl20C5結(jié)構(gòu)域的片段，且位于該第一肽段的C端；和 (iii)第三肽段，其包含gp41氨基酸序列的片段，且位于該第二肽段的C端。
17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，在該融合蛋白的C端進(jìn)一步包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列。
18.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽區(qū)包含SEQIDNO :7所述的氨 基酸序列。
19.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其進(jìn)一步包含中間多肽區(qū)，該中間多肽區(qū)位于所述 第一多肽區(qū)與第二多肽區(qū)之間，其中，該中間多肽區(qū)包含非Env的HIV抗原決定簇。
20.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中，所述中間多肽區(qū)包含HIV蛋白或其片段，其為 選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的至少一種。
全文摘要
一種嵌合融合蛋白，可用作免疫原，用于誘導(dǎo)對(duì)人類免疫缺陷性病毒(HIV)抗原具有專一性的免疫反應(yīng)。該嵌合融合蛋白包含第一多肽區(qū)和第二多肽區(qū)。所述第一多肽區(qū)包括假單胞菌外毒素A(PE)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PE轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。所述第二多肽區(qū)包括(i)第一肽段，其包含gp120C1結(jié)構(gòu)域的片段，且位于第二多肽區(qū)的N端；(ii)第二肽段，其包含gp120C5結(jié)構(gòu)域的片段，且位于第一肽段的C端；和(iii)第三肽段，其包含gp41的片段，且位于第二肽段的C端。所述第二多肽區(qū)包含對(duì)HIV的一種亞型具有專一性的抗原決定簇。也可包括中間多肽，其包含選自Gag24、Nef、Tat與Rev中的且非Env的HIV抗原決定簇。
文檔編號(hào)A61K38/16GK101969975SQ200980103387
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日
發(fā)明者廖朝暐, 章修綱 申請(qǐng)人:生寶美國(guó)公司;生寶生物科技股份有限公司