一種融合蛋白及其編碼的疫苗組合物與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種融合蛋白及其編碼的疫苗組合物與應(yīng)用。該融合蛋白包括假單胞桿菌毒素A結(jié)構(gòu)域I與II、禽流感病毒HA2蛋白及羧基末端部分。其中，所述HA2蛋白的氨基酸序列可為SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7；所述羧基末端部分為含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列可為SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13。本發(fā)明還公開了含免疫量的禽流感融合蛋白的疫苗組合物及其在制備預(yù)防和/或治療H9亞型禽流感藥物中的應(yīng)用。該禽流感疫苗組合物能同時產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫；還對H9亞型的禽流感均能產(chǎn)生保護(hù)性免疫，具有廣譜性。
【專利說明】一種融合蛋白及其編碼的疫苗組合物與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品，特別是涉及一種融合蛋白及其編碼的疫苗組合物與應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian inf luenza，AI)是禽流行性感冒的簡稱，由禽流感（Avian influenza virus, AIV)引起的多種禽類感染的急性呼吸道傳染病，也能感染人類，被國際 獸醫(yī)局（0ΙΕ)和我國《家畜家禽防疫條例》列為A類烈性傳染病。
[0003] 流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，含有囊膜、為多形態(tài)的負(fù)鏈RNA病毒。根 據(jù)流感病毒內(nèi)部核蛋白（Nucleoprotein，NP)和基質(zhì)蛋白（Matrix protein, MP)抗原及其 基因特性的不同，可將流感病毒分為甲（A)、乙（B)、丙（C)三種類型，其中，能夠引起大流行 的流感病毒主要是甲型。禽流感即為甲型流感病毒，其基因組共由8個單獨的負(fù)鏈RNA片 段組成，由片段1至片段8依次為PB1、PB2、PA、HA、ΝΡ、ΝΑ、M、NS。根據(jù)位于禽流感囊膜 上的血凝素 HA (Hemagglutinins,由禽流感基因組的第4個片段編碼）和神經(jīng)氨酸酶NA (Neuraminidase，由禽流感基因組的第6個片段編碼）抗原性的不同，禽流感可分為若干個 亞型，目前已知的HA有16個亞型（H1-H16)、NA有9個亞型（N1-N9)，這兩種不同的亞型之 間可以進(jìn)行自由組配，從而形成一個龐大而復(fù)雜的禽流感家族。正是由于流感病毒基因組 自身的特點決定了其不斷發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，從而使得新的流行毒株不斷出現(xiàn)。目 前，禽流感主要以H9亞型最為流行，感染后的舍飼禽(包括家禽)可表現(xiàn)為亞臨床癥狀、輕的 呼吸系統(tǒng)感染到無癥狀帶毒等多種流行形式，不僅使家禽業(yè)遭受危機(jī)，還導(dǎo)致預(yù)防、控制禽 流感疫情面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
[0004] 截止到目前，接種疫苗仍然是預(yù)防和/或控制禽流感大流行的最有效手段。而且， 面對禽流感的不斷變異，制備H9亞型通用流感疫苗已博得世界各國科學(xué)家和疫苗生產(chǎn)公 司的青睞，所謂的H9亞型通用流感疫苗是指一種能夠預(yù)防H9亞型所有流感病毒毒株，并可 誘導(dǎo)持久性和保護(hù)性免疫的流感疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種新型的禽流感融合蛋白，以及含免疫量的禽流感融合蛋白的疫 苗組合物及其應(yīng)用。該疫苗組合物既能同時產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，又能對H9亞型禽流 感病毒產(chǎn)生保護(hù)性免疫，具有廣譜性。
[0006] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種禽流感融合蛋白，所述禽流感融合蛋白包含：
[0007] ( 1)假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I，
[0008] (2)假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域II，
[0009] (3)禽流感病毒HA2蛋白，以及 [0010] (4)羧基末端部分；
[0011] 其中，所述禽流感病毒HA2蛋白位于假單胞菌外毒素 A結(jié)構(gòu)域II與羧基末端部分 之間，且假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域II位于假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I與所述禽流感病毒 HA2蛋白之間。
[0012] 優(yōu)選地，所述禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列與序列SEQ ID N0. 3具有至少90% 的同源性，或者至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
[0013] 本發(fā)明所用術(shù)語"同源性"是指兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列的相似 程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通過本領(lǐng)域公知的任何適當(dāng)方法計算 得到，例如，可以將目標(biāo)氨基酸(或核苷酸）序列與參比氨基酸(或核苷酸）序列進(jìn)行序 列比對，必要時可以引入空缺，使得兩條比對的序列間相同的氨基酸(或核苷酸）數(shù)目 達(dá)到最優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上計算兩條氨基酸(或核苷酸）序列之間相同氨基酸(或核苷 酸）的百分比。氨基酸(或核苷酸）序列的比對和同源性的計算可以通過本領(lǐng)域公知 的軟件實現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST軟件(在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI的網(wǎng) 址上可獲得：http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi,或者見，例如，Altschul S. F. et al. , J. Mol. Biol. , 215 : 403-410 (1990) ; Stephen F. et al. , Nucleic Acids Res.，25:3389-3402 (1997) )，ClustalW2軟件(在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得： http: //www. e ii. ac. uk/Toolsa/clustalw2/,或者見，例如,Higgins D. G. et al. , Methods in Enzymology, 266:383-402(1996);Larkin M. A. et al. , Bioinformatics(Oxford, Engl and), 23(21) :2947-2948(2007));和Tcoffee軟件(在瑞典生物信息學(xué)研究所的網(wǎng)站上可 以獲得：http://tcoffee. vital-it. ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee cgi/index, cgi,另見， 例如，Poirot O.et al·, Nucleic Acids Res·, 31 (13):3503-3506(2003);Notredame C.et al.，J. Mol. Boil.，302 (1) : 205-217 (2000))等。使用軟件進(jìn)行序列比對時，可以使用軟件提 供的默認(rèn)參數(shù)，或者也可以根據(jù)實際情況對軟件提供的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，這些都在本領(lǐng)域技 術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列可為SEQ ID NO. 3、SEQ ID Ν0· 5 或 SEQ ID Ν0· 7。
[0015] 更優(yōu)選地，所述禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列依次為SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 8。
[0016] 優(yōu)選地，所述羧基末端部分為含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列可為 SEQ ID N0.9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID N0. 12 或 SEQ ID N0. 13。
[0017] 本發(fā)明所述的羧基末端部分為KDEL家族蛋白中的成員。所用術(shù)語"KDEL家族蛋 白"是指一組蛋白質(zhì)，其具有與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合的相似羧基端，并進(jìn)一步具有可將該蛋白 質(zhì)留存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中以實現(xiàn)醣基化作用的能力，以便融合抗原更接近外源蛋白的肽片段。 通常，該羧基端的長度介于4-16個殘基之間。根據(jù)針對存在于不同分子中且執(zhí)行特定生 物機(jī)能的相似序列所做的研究顯不：一種可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中留存新形成蛋白的序列為Lys Asp Glu Leu (KDEL) (SEQ ID NO. 9)。從而說明：根據(jù)這一發(fā)明的融合抗原的羧基端上的序列 可作為某種類型的識別序列，協(xié)助融合抗原從內(nèi)吞區(qū)室易位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，并將其留置于內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。在一個較佳的實施方式中，該羧基末端部分包含KDEL的序列如SEQ ID N0. 9所 示。在一個更理想的實施方式中，該羧基末端部分包含KDEL-KDEL-KDEL (SEQ ID NO. 10) 或KKDL-RDEL-KDEL的序列（SEQIDN(λll)、KKDELRDELKDEL的序列（SEQIDN(λl2)或 KKDELRVELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 13)，其中 R 為 D 或 V。
[0018] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述的禽流感融合蛋白的方法，所述制備 方法包括：通過基因工程手段分別獲得所述PEA基因、所述HA2基因，將其分別連接至克 隆載體以獲得PEA克隆載體、HA2克隆載體；通過PCR方法在構(gòu)建的所述HA2基因羧基末 端添加含KDEL的多肽序列，并連接至克隆載體以獲得HA2-KDEL克隆載體；將構(gòu)建的所述 HA2-KDEL克隆載體、所述PEA克隆載體通過酶切，構(gòu)建同時包含PEA、HA2-KDEL基因的克隆 載體，即禽流感融合蛋白的克隆載體；將構(gòu)建的所述禽流感融合蛋白的克隆載體、表達(dá)載體 通過酶切，構(gòu)建同時包含PEA、HA2-KDEL基因的表達(dá)載體，即禽流感融合蛋白的表達(dá)載體； 將所述禽流感融合蛋白的表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)的禽流感融合蛋白 進(jìn)行純化和鑒定以獲得禽流感融合蛋白。
[0019] 優(yōu)選地，所述基因工程手段是指運(yùn)用分子生物學(xué)方法獲得所述PEA基因、所述HA 基因，進(jìn)一步優(yōu)選為通過PCR方法擴(kuò)增PEA基因，通過RT-PCR方法擴(kuò)增HA2基因；優(yōu)選地， 所述克隆載體為分子生物學(xué)可接受的克隆載體，進(jìn)一步優(yōu)選為pMD18-T、pGEM-T、pUC18/19、 PBR322 ;優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為pET，進(jìn)一步優(yōu)選為pET-28a、pET-32a ;所述受體菌為大腸 桿菌，進(jìn)一步優(yōu)選為Bal21。
[0020] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種用于預(yù)防H9亞型禽流感感染的疫苗組合物，包 括一免疫量的所述禽流感融合蛋白和/或一獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
[0021] 優(yōu)選地，所述禽流感疫苗組合物單位劑量中含所述禽流感融合蛋白組分的含量為 5-50 μ g，優(yōu)選為 10-40 μ g。
[0022] 本發(fā)明所述禽流感疫苗組合物中，較佳地還可包括一獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑，所 適用的免疫佐劑不限，可以是任何一種常用于疫苗的佐劑，包括油佐劑、鋁膠佐劑、蜂膠佐 齊U、丙烯酸聚合物佐劑、水性佐劑、脂質(zhì)體中的一種或幾種。
[0023] 本發(fā)明所用術(shù)語"丙烯酸聚合物佐劑"為至少含有丙烯酸聚合物的佐劑溶液；優(yōu)選 地，所述丙烯酸聚合物還可為丙烯酸聚合物、可代謝油的混合物；更優(yōu)選地，所述丙烯酸聚 合物為均聚物或共聚物，進(jìn)一步優(yōu)選為Carbopol。
[0024] 本發(fā)明所用術(shù)語"水性佐劑"又稱"水佐劑"、"水基佐劑"或"水溶性佐劑"，是一種 聚合物水溶性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，滴入水中能迅速與水混溶。
[0025] 本發(fā)明還提供了所述禽流感融合蛋白及所述禽流感疫苗組合物在制備預(yù)防和/ 或治療H9亞型禽流感藥物中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明在制備用于保護(hù)動物免患H9亞型禽流感所引起疾病的禽流感疫苗組合物 中的應(yīng)用時，所用禽流感疫苗組合物的免疫量為〇. 3mL/羽。
[0027] 所述的禽流感疫苗組合物在給予免疫動物時，可以通過肌肉注射、皮下注射、口服 途徑、靜脈注射或點眼、滴鼻途徑，優(yōu)選為通過皮下注射或肌肉注射。
[0028] 基于此，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0029] (1)本發(fā)明所述的禽流感融合蛋白是通過基因工程手段獲得的，易于大規(guī)模生產(chǎn)， 便于儲存；
[0030] (2)本發(fā)明所述禽流感疫苗組合物所含抗原的主要組分為禽流感融合蛋白，而該 融合蛋白包含HA2蛋白，能同時刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫；
[0031] (3)本發(fā)明所述的禽流感疫苗組合物具有廣譜性，能抗H9亞型的禽流感，免疫動 物后可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗H9亞型禽流感的抗體。
[0032] 序列表中：
[0033] 序列1為假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I與II的氨基酸序列；
[0034] 序列2為假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I與II的核苷酸序列；
[0035] 序列3為禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列1 ;
[0036] 序列4為禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列1 ;
[0037] 序列5為禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列2 ;
[0038] 序列6為禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列2 ;
[0039] 序列7為禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序列3 ;
[0040] 序列8為禽流感病毒HA2蛋白的核苷酸序列3 ;
[0041] 序列9為羧基末端部分的氨基酸序列1 ;
[0042] 序列10為羧基末端部分的氨基酸序列2 ;
[0043] 序列11為羧基末端部分的氨基酸序列3 ;
[0044] 序列12為羧基末端部分的氨基酸序列4 ;
[0045] 序列13為羧基末端部分的氨基酸序列5 ;
[0046] 序列14為羧基末端部分的核苷酸序列。

【具體實施方式】
[0047] 下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0048] 本發(fā)明所用術(shù)語"假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I "是指與假單胞桿菌毒素 A的氨基末 端細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域具有相同序列或具有功能相當(dāng)片段的肽片段。
[0049] 本發(fā)明所用術(shù)語"假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域II"是指與假單胞桿菌毒素 A的中間 易位結(jié)構(gòu)域具有相同序列或具有功能相當(dāng)片段的肽片段。
[0050] 本發(fā)明所用術(shù)語"免疫量"是指提供針對禽流感疫苗組合物的免疫劑量，主要取決 于以下因素：被免疫動物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態(tài)以及動物之前是否接受過 對抗同樣病毒的疫苗。
[0051] 本實施例中所用的禽流感HA2蛋白的序列，來源于已報道的禽流感H9亞型分離 株，在 NCBI 中的登錄號為 DQ064366. 1、CY102744. 1、CY144539. 1。
[0052] 本實施例通過基因工程手段，以大腸桿菌表達(dá)載體為例進(jìn)行表達(dá)，從而獲得禽流 感融合蛋白，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0053] 本實施例以油佐劑作為佐劑制備禽流感疫苗組合物為例進(jìn)行闡述，但該實施方式 無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
[0054] 本實施例中所用的攻毒毒株為H9亞型禽流感抗原HL株(見文獻(xiàn)：孫進(jìn)忠等，禽 流感病毒（H9N2亞型，HL株）與國內(nèi)部分省禽流感病毒（H9亞型）流行株抗原相關(guān)性及交 互免疫的研究，2007年畜牧獸醫(yī)學(xué)會年會論文集，2007, 35-38)、禽流感病毒SZ株（Avian influenza virus (H9 subtype) strain SZ，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中 國武漢大學(xué)，保藏日期為2012年9月16日，保藏編號為CCTCC N0:V201240)。
[0055] 下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料， 若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0056] 實施例1禽流感病毒融合蛋白克隆載體的構(gòu)建
[0057] 根據(jù) NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)報道的假單胞桿菌毒素 A (Pseudomonas aeruginosa PA01，登錄號：AE004091)、禽流感中國分離株中的HA蛋白（登錄 號為DQ064366. 1)中的基因序列（詳情依次見SEQ ID No. 2、SEQ ID N0. 4)，用PCR方法擴(kuò) 增假單胞桿菌毒素 A (PEA)結(jié)構(gòu)域I與II，用RT-PCR方法擴(kuò)增禽流感HA2蛋白；并用連續(xù) PCR的方法擴(kuò)增羧基末端部分含KDEL多肽的基因 （SEQ ID N0. 12)?？寺⊥瓿珊螅ㄟ^基因 工程手段將它們串聯(lián)起來，作為禽流感病毒的融合蛋白。
[0058] 1. 1 PEA結(jié)構(gòu)域I與II、HA2基因克隆載體的構(gòu)建及鑒定
[0059] 根據(jù)選取的PEA結(jié)構(gòu)域I與II、HA2蛋白的核苷酸序列，即SEQ ID No. 2、SEQ ID NO. 4,用PCR方法對其進(jìn)行擴(kuò)增。其中，PEA基因的上、下游引物分別添加 BamHI和Sail酶 切位點，引物設(shè)計如下：
[0060] 上游引物：5，-CGGGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3'，
[0061] 下游引物：5，-GCGTCGACGCCGTCGCCGAGGAACT-3'；
[0062] HA2基因上、下游引物分別添加 Sail和SphI酶切位點，引物設(shè)計如下：
[0063] 上游引物：5' ~GCGTCGACGGACTATTTGGTGCCATAGC~3,,
[0064] 下游引物：5' ~ACATGCATGCTATACAAACGTTGCATCTGCAAGAT~3,。
[0065] PCR擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，52°C復(fù)性 30s，72°C延伸 60s，35 個 循環(huán)，最后72°C延伸10min。
[0066] 將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測結(jié)果顯示：分別在 1200bp、660bp附近出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶，與PEA結(jié)構(gòu)域I與II片段、HA2片段的大小相符。
[0067] 將目的片段分別使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并將回收后的目的基因片段 分別連接至PMD18-T載體，以構(gòu)建pMD18-T-PEA、pMD18-T-HA2克隆載體，連接體系為：目的 基因20 μ L、pMD18-T載體0. 5 μ L、連接酶緩沖液2. 0 μ L、T4DNA連接酶1. 0 μ L、滅菌雙蒸水 8. 5yL;反應(yīng)條件為：16°C、30min。將連接產(chǎn)物加入DH5a感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30min，然 后42°C加熱45s，置冰上lmin，加入890 μ L的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60min，將培養(yǎng) 物接種含1〇〇 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)過夜。觀察結(jié)果顯示：LB固體 培養(yǎng)基均出現(xiàn)白色小菌落。
[0068] 挑典型菌落，接種于含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，200rpm培養(yǎng) l〇h。使用質(zhì)?；厥赵噭┖刑崛「鬓D(zhuǎn)化菌質(zhì)粒，分別命名為pMD18-T-PEA、pMD18-T-HA2,并 進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定結(jié)果顯示：pMD18-T-PEA酶切后，出現(xiàn)2600bp左右的載體片段和 1200bp左右的PEA片段；pMD18-T-HA2酶切后，出現(xiàn)2600bp左右的載體片段和660bp左右 的HA2片段。
[0069] 將酶切正確的質(zhì)粒送基因公司測序，測序結(jié)果表明：擴(kuò)增序列分別為PEA基因和 HA2基因，且目的基因和載體連接正確。
[0070] 1. 2 pMD18-T-HA2-KDEL克隆載體的構(gòu)建及鑒定
[0071] 通過連續(xù)的 PCR，將 SEQ ID N0. 14 (編碼 KKDELRVELKDEL，即 SEQ ID N0. 13)中的 基因連接至HA2基因末端，構(gòu)建SphI位點-KKDELRVELKDEL-終止密碼子-Hindlll序列的 多核苷酸。將該多核苷酸序列克隆至PMD18-T載體，獲得pMD18-T-HA2-KDEL。使用Sail、 Hindlll雙酶切鑒定，并送基因公司進(jìn)行測序，表明pMD18-T-HA2-KDEL構(gòu)建正確。
[0072] L 3 pMD18-T-PEA-HA2-KDEL克隆載體的構(gòu)建和鑒定
[0073] 構(gòu)建的 pMD18-T-PEA、pMD18-T-HA2-KDEL 分別使用 Sail 和 Hindlll 進(jìn)行雙酶 切，使用DNA凝膠回收試劑盒，將pMD18-T-PEA、HA2-KDEL片段回收，使用DNA連接試劑 盒將PMD18-T-PEA、HA2-KDEL進(jìn)行連接，構(gòu)建pMD18-T-PEA-HA2-KDEL。將構(gòu)建載體使用 BamHI、Hindlll雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果顯示：酶切后，出現(xiàn)2600bp的載體片段和1900bp左 右的目的條帶；并將陽性質(zhì)粒送基因公司進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果表明：禽流感融合蛋白 PMD18-T-PEA-HA2-KDEL 連接成功。
[0074] 實施例2禽流感融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
[0075] 將 pMD18-T-PEA-HA2-KDEL、pET-28a，分別使用 BamHI、Hindlll 雙酶切，回收 PEA-HA2-KDEL、pET-28a載體片段，連接，構(gòu)建pET-28a-PEA-HA2-KDEL表達(dá)載體。然后，將 pET-28a-PEA-HA2-KDEL載體導(dǎo)入Bal21感受態(tài)細(xì)胞，并使用BamHI、Hindlll雙酶切鑒定， 鑒定結(jié)果顯示：酶切后，出現(xiàn)5300bp左右的載體片段和1900bp左右的目的條帶；并將陽性 質(zhì)粒送基因公司進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果表明：禽流感融合蛋白pET-28a-PEA-HA2-KDEL構(gòu) 建正確。
[0076] 實施例3禽流感融合蛋白的表達(dá)、鑒定及純化
[0077] 3. 1禽流感融合蛋白的表達(dá)及鑒定
[0078] 將含 pET-28a-PEA-HA2-KDEL 質(zhì)粒的 Bal21 菌，按 1% (V/V)接種量接種含 50 μ g/ mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、180rpm培養(yǎng)6-8h，使細(xì)菌0D6QQ在0. 6-1. 0之間，加入 IPTG，使終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用雞抗H9亞型禽流感 病毒陽性血清進(jìn)行Western blot鑒定。
[0079] 結(jié)果顯示：相對于對照，含pET-28a-PEA-HA2-KDEL質(zhì)粒的Bal21菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 5h，在80KDa附近出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶，主要存在于包涵體中。Western blot結(jié)果表明：該 重組蛋白可與抗禽流感陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。
[0080] 3. 2禽流感融合蛋白的純化
[0081] 使用Ni+親和層析柱對上述表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。將含pET-28a-PEA-HA2-KDEL質(zhì)粒 的Bal21菌，按1% (V/V)接種量接種含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、180rpm 培養(yǎng)6-8h，使細(xì)菌0D_在0. 6-1. 0之間，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5h后， 收集細(xì)菌進(jìn)行超聲破碎，8000rpm離心30min，收集沉淀，使用包涵體溶解液溶解后，使用Ni+ 親和層析柱進(jìn)行純化，純化蛋白使用生理鹽水進(jìn)行透析，透析蛋白使用紫外分光光度計測 定蛋白濃度，使用SDS-PAGE對其純度進(jìn)行鑒定。
[0082] 鑒定結(jié)果表明：禽流感融合蛋白，即重組PEA-HA2-KDEL蛋白，經(jīng)Ni+親和層析柱純 化，透析后得到濃度為200 μ g/mL的含禽流感融合蛋白溶液，將其作為禽流感融合蛋白的 儲備液；SDS-PAGE電泳后，僅在80KDa附近出現(xiàn)條帶。
[0083] 將鑒定合格后的禽流感融合蛋白（將其命名為禽流感融合蛋白1)使用冷凍干燥機(jī) 進(jìn)行凍干，以便長期保存。
[0084] 實施例4禽流感融合蛋白的制備
[0085] 依次參照禽流感H9亞型分離株中的HA蛋白（登錄號為CY102744. UCY144539. 1) 中的基因序列（詳情依次見SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8)，并按照實施例1-3的方法即通過 PCR方法分別獲得PEA基因、HA2基因，將其分別連接至克隆載體以獲得PEA克隆載體、HA2 克隆載體；通過PCR方法在構(gòu)建的HA2基因羧基末端添加含KDEL的多肽序列，并連接至 克隆載體以獲得HA2-KDEL克隆載體；將構(gòu)建的HA2-KDEL克隆載體、PEA克隆載體通過酶 切，構(gòu)建同時包含PEA、HA2-KDEL基因的克隆載體，即禽流感融合蛋白的克隆載體；將構(gòu)建 的禽流感融合蛋白的克隆載體、表達(dá)載體通過酶切，構(gòu)建同時包含PEA、HA2-KDEL基因的表 達(dá)載體，即禽流感融合蛋白的表達(dá)載體；將所述禽流感融合蛋白的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌 Bal21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)的禽流感融合蛋白進(jìn)行純化和鑒定，分別制得禽流感融合蛋 白2、禽流感融合蛋白3。
[0086] 同時，將透析后得到濃度為200μ g/mL的，且分別含禽流感融合蛋白2、禽流感融 合蛋白3的溶液，將其作為禽流感融合蛋白2、禽流感融合蛋白3的儲備液。將鑒定合格后 的禽流感融合蛋白2、禽流感融合蛋白3使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，以便長期保存。
[0087] 實施例5不含佐劑和含油佐劑的禽流感疫苗組合物的制備
[0088] 5. 1不含佐劑的禽流感疫苗組合物的制備
[0089] 將實施例3、實施例4制備的200 μ g/mL禽流感融合蛋白的儲備液，用生理鹽水進(jìn) 行稀釋，使其含禽流感融合蛋白的終濃度均為25 μ g/mL，依次編碼為疫苗1-1、疫苗2-1、疫 苗3-1，2-8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0090] 5. 2含油佐劑的禽流感疫苗組合物的制備
[0091] 取注射用白油94份，加司本-80 6份混合后，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌至透明 為止，高壓滅菌后備用，即為油相。
[0092] 將實施例3、實施例4所制備的200 μ g/mL禽流感融合蛋白的儲備液分別進(jìn)行稀 釋，使其含禽流感融合蛋白的濃度均為75 μ g/mL禽流感抗原液，分別于無菌容器中，加入 4%滅菌并冷卻后的吐溫-80,邊加邊攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，即為水相1、水相2、水 相3。
[0093] 乳化機(jī)的轉(zhuǎn)子先用0. 5%甲醛溶液浸泡消毒4h以上，使用前以熱的無菌蒸餾水沖 洗干凈。取油相2份置乳化器內(nèi)，開動電機(jī)攪拌，然后依次分別徐徐加入1份水相1、水相 2、水相3,再以17500r/min乳化5min即可。在乳化終止前加入1%硫柳汞鈉，使其終濃度為 0. 01%。制備的疫苗即為含油佐劑的25 μ g/mL禽流感融合蛋白的疫苗組合物，將其依次編 碼為疫苗1-2、疫苗2-2、疫苗3-2,于2-8 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0094] 實施例6動物實驗
[0095] 選取3周齡的SPF雞65只，隨機(jī)挑選5只作為空白對照，其余60只隨機(jī)分成6組， 10只/組，分別經(jīng)肌肉注射實施例5制備的不含佐劑和含油佐劑的禽流感疫苗組合物、生理 鹽水(作為空白對照)，注射劑量0. 3mL/羽。
[0096] 于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分別采集并分 離各試驗組的血清,并利用ELISA檢測血清中的禽流感抗體水平，檢測結(jié)果見表1。
[0097] 表1不同時間段各試驗組禽流感抗體水平的檢測結(jié)果匯總
[0098]

【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，包含： (1) 假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I， (2) 假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域II， (3) 禽流感病毒HA2蛋白，以及 (4) 羧基末端部分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述禽流感病毒HA2蛋白的氨基酸序 列可為 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 7。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述羧基末端部分為含有氨基酸序 列 KDEL 的多肽，其氨基酸序列可為 SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 或 SEQ ID NO. 13。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述禽流感病毒HA2蛋白位于假單胞 菌外毒素 A結(jié)構(gòu)域II與羧基末端部分之間，且假單胞桿菌毒素 A結(jié)構(gòu)域II位于假單胞桿 菌毒素 A結(jié)構(gòu)域I與所述禽流感病毒HA2蛋白之間。
5. -種制備如權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：通 過基因工程手段，依次構(gòu)建所述融合蛋白的克隆載體、表達(dá)載體，并對所述融合蛋白進(jìn)行表 達(dá)、純化及鑒定。
6. -種用于預(yù)防H9亞型禽流感感染的疫苗組合物，包括一免疫量的如權(quán)利要求1所述 融合蛋白和/或一獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物單位劑量中含所 述融合蛋白的含量為5-50 μ g。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物單位劑量中含所 述融合蛋白的含量為10-40 μ g。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑包括油佐劑、鋁膠佐劑、 蜂膠佐劑、丙烯酸聚合物佐劑、水性佐劑、脂質(zhì)體中的一種或幾種。
10. 權(quán)利要求6-9任一項所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療H9亞型禽流感藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/16GK104250304SQ201310533149
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】張許科, 孫進(jìn)忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司