一種fliC蛋白微膠囊疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種微膠囊疫苗，其中抗原fliC蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；本發(fā)明的微膠囊疫苗可用作飼料添加劑來使用。本發(fā)明提供的fliC蛋白疫苗具有強(qiáng)的免疫原性，其的免疫效果好。且口服免疫對個(gè)體較小的魚體應(yīng)激小，人力成本低，便于規(guī)?；茝V應(yīng)用。該疫苗無異味，適口性好，魚體易采食。
【專利說明】
-種f I iC蛋白微膠囊疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種flic蛋白微膠囊疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 遲純愛德華氏菌巧dwardsiella tarda)是一種水產(chǎn)動(dòng)物重要的致病菌，屬于腸桿 菌科，愛德華氏菌屬，該菌由化sMna首次在媛綱紅病中報(bào)道，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中有極大危 害的病原菌。該菌可W感染包括淡水與海水養(yǎng)殖的多種魚類，并能在短期內(nèi)引起大量死亡， 給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 疫苗的使用可提高養(yǎng)殖魚類特異性免疫水平，使魚體產(chǎn)生抵抗特定病原微生物感 染的免疫力，不污染環(huán)境，無藥物殘留等問題，是今后魚類疾病防控的主流發(fā)展方向。因此， 篩選免疫原性好的抗原，并用其制備疫苗就具有現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種flic蛋白微膠囊疫苗，可W有效的預(yù)防遲純愛德華氏 菌引起的疾病，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明提供的微膠囊疫苗，其中抗原flic蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1;
[0006] 其中編碼flic蛋白的基因，其核巧酸序列為SEQ ID N0:2;
[0007] 上述的蛋白用脂多糖進(jìn)行了偶聯(lián)；
[000引本發(fā)明的微膠囊疫苗;是將η iC蛋白與黃巧多糖混合，再與海藻酸鋼混合，用蒸饋 水配制成乳濁液，其中海藻酸鋼終濃度為2%，將乳濁液攬拌均勻后，噴入濃度為3%化C12 的溶液中，形成海藻酸巧微膠囊，噴霧完畢后繼續(xù)攬拌20min;離屯、收集海藻酸巧微膠囊，然 后將微膠囊分散到0.2%的殼聚糖溶液中，充分?jǐn)埌韬?，離屯、收集微膠囊，蒸饋水洗涂后，再 將收集的微膠囊分散在甘露醇溶液中，混勻后冷凍，經(jīng)冷凍干燥后制成微膠囊疫苗。
[0009] 本發(fā)明的微膠囊疫苗可用作飼料添加劑來使用。
[0010] 本發(fā)明提供的flic蛋白疫苗具有強(qiáng)的免疫原性，其的免疫效果好。且口服免疫對 個(gè)體較小的魚體應(yīng)激小，人力成本低，便于規(guī)?；茝V應(yīng)用。該疫苗無異味，適口性好，魚體 易義食。
【附圖說明】
[0011] 圖1:本發(fā)明的flic蛋白與NCBI中的flic基因的序列比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0013] 實(shí)施例1: flic蛋白的獲得及序列分析
[0014] 1)遲純愛德華氏菌的分離
[0015] 2015年山東某牙解養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的牙解出現(xiàn)了明顯的遲純愛德華氏菌感染的病癥， 但患病魚之前已經(jīng)進(jìn)行過遲純愛德華氏菌疫苗的免疫處理。取溯死病魚，無菌條件下獲得 肝臟組織，劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，3(TC培養(yǎng)后挑取優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至獲得 純培養(yǎng)菌。
[0016] 將分離獲得各菌株純培養(yǎng)物，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用無菌 生理鹽水洗脫菌落，獲得菌懸液用于注射感染。最終篩選的菌株顯示出對健康牙解具有較 高的毒力，可引起90 %牙解死亡，且死亡牙解出現(xiàn)與患病牙解相同的癥狀。因此，證實(shí)篩選 的遲純愛德華氏菌ET株為牙解腹水癥的病原。且在感染患病的牙解體內(nèi)可再次分離到該菌 株。
[0017] 對比實(shí)驗(yàn)表明，用目前市場上出售的遲純愛德華氏菌疫苗對牙解幼苗進(jìn)行免疫 后，再用本發(fā)明篩選的ET株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn);結(jié)果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠(yuǎn) 低于用本發(fā)明ET株制成的滅活疫苗的效果。推測是由于ET株的某個(gè)致病基因發(fā)生變異導(dǎo)致 目前疫苗的免疫效果不好。
[0018] 2)遲純愛德華氏菌ET菌株鞭毛蛋白flic的擴(kuò)增及序列分析
[0019] 根據(jù)Genba址遲純愛德華氏flic的基因序列，分別設(shè)計(jì)其特異性引物：
[0020] f 1 i C正向引物:CGGGATCCATGGCACAAGTAATCAACACC、
[0021] flic反向引物：CCGCTCGAGACGCAGCAGAGACAGGACGTTC;
[0022] 利用細(xì)菌基因組抽提試劑盒，W抽提細(xì)菌基因組DNA為模板，分別配合各基因的正 反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：5化1反應(yīng)體系，包含37μ1此0、5μ1 10 XTaq buffer、4yl dNTP(2.5mM)、正反引物各化 1、化 1 Taq DNA 化lymerase及化 1 DM模 板;PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性10min;94°C變性，lmin，50°C退火lmin，72°C延伸Imin，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸SmiruPCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察， 結(jié)果顯示基因擴(kuò)增成功，且擴(kuò)增產(chǎn)物大小與期望的目的基因一致。
[0023] 對擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行測序，結(jié)果表明，flic基因的序列與NCBI中已公開的序列 存在明顯的差異；本發(fā)明獲得的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的flic蛋白相比于NCBI中的 flic基因存在10個(gè)W上氨基的區(qū)別（圖1)。而獲得的甘油醒-3-憐酸脫氨酶(GAPDH)的氨基 酸序列為SEQ ID N0:3，NCBI比對結(jié)果表明GAPDH與NCBI中已公開的序列一致。
[0024] 而免疫效果表明，用氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的flic蛋白制成的疫苗對ET株的 免疫效果明顯好于NCBI中已公開的flic蛋白制成的疫苗的免疫效果。
[0025] 實(shí)施例2:重組蛋白的表達(dá)及與脂多糖進(jìn)行偶聯(lián)
[0026] l)fliC基因表達(dá)載體的構(gòu)建:將擴(kuò)增的遲純愛德華氏菌flic基因產(chǎn)物切膠回收進(jìn) 行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)BamHI和趾〇11雙酶切后，連接至原核表達(dá)載體祀T32a，構(gòu)建其表達(dá)載體 祀T32a-fliC，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化2UDE3)，于含氨節(jié)青霉素的LB平板上培養(yǎng)， 待長出菌落后，利用PCR方法篩選陽性克隆表達(dá)菌，將PCR檢測為陽性克隆的菌株進(jìn)一步利 用測序進(jìn)行確認(rèn)。
[0027] 2)重組蛋白的表達(dá)與純化:經(jīng)測序確認(rèn)載體中插入序列正確后，將篩選到的遲純 愛德華氏fli啡日性克隆表達(dá)菌分別接種于含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床上培養(yǎng)至指 數(shù)生長期時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)化，離屯、收集菌體，經(jīng)超聲破碎后，WNi離子 馨合的親和層析柱化is化ap HP 1ml，GE)對重組蛋白進(jìn)行純化，洗脫產(chǎn)物經(jīng)尿素濃度梯度 透析后，最后WPBS進(jìn)行透析，透析完成后對樣品進(jìn)行冷凍干燥W濃縮樣品，SDS-PAGE檢測 純化的重組蛋白。遲純愛德華氏菌flic重組蛋白分子量為63kDa，該目的基因編碼416個(gè)氨 基酸，表達(dá)的蛋白片段理論分子量為43kDa，質(zhì)粒祀T32a的標(biāo)簽蛋白大小則約為20kDa左右， 結(jié)果與理論大小相符。
[002引3)重組蛋白與LPS的偶聯(lián):將llOmg脂多糖干粉溶解于10ml蒸饋水中，往該WS水溶 液中加入400mg固體化104,混合解育2min，然后加入22化1乙醇胺終止氧化反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn) 物加入孔徑為3K大小的透析袋中，置于O.Olmol/L的PBS中，在4°C條件下透析過夜，期間換 兩次透析液。同時(shí)，稱取390mg碳化二亞胺巧DC)，溶解于5ml蒸饋水中，然后加入90mg純化后 的Flic重組蛋白，利用1M肥1將反應(yīng)體系P的周整至5.4,室溫震蕩解育化。將上述完成氧化 反應(yīng)后的LPS與含抓C的重組Flic蛋白溶解混合，在22°C條件下解育化，最后將反應(yīng)液置于 PBS緩沖液中透析過夜，期間更換透析液，最后將透析后的溶液在8000g下離屯、30min，所得 上清即為Flic與LI^的偶聯(lián)粗制物。
[00巧]4)重組蛋白-LPS偶聯(lián)物的純化:各重組蛋白的偶聯(lián)粗制物，利用S邱hac巧1 S-300 凝膠柱層析分離純化各重組蛋白-LPS偶聯(lián)物。具體為:首先將粗制偶聯(lián)產(chǎn)物W孔徑為0.22μ m的濾膜過濾，然后往柱體積為120mL的Se地ac巧1 S-300層析柱內(nèi)上樣10ml偶聯(lián)粗制物，W PBS緩沖液作為平衡與洗脫緩沖液，均勻?qū)⒘魉倏刂茷?ml/min，根據(jù)紫外吸收波收集樣品， 根據(jù)分子篩原理，分子量較大的偶聯(lián)產(chǎn)物將會(huì)首先分離獲得。將收集到的偶聯(lián)產(chǎn)物W超純 水透析，然后進(jìn)行冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 實(shí)施例3: flic亞單位口服微膠囊疫苗的制備：
[0031] 將上述制備的flic重組蛋白與LPS的偶聯(lián)產(chǎn)物按質(zhì)量比為2-4:1的比例與黃巧多 糖混合制成混合物，然后將抗原混合物與海藻酸鋼W質(zhì)量比1:3的比例混合，用蒸饋水配制 成乳濁液，保證乳濁液中海藻酸鋼終濃度為2%，在混勻器的攬拌作用下包埋30min。將該乳 濁液利用噴霧式銳孔凝固浴法，直接噴入經(jīng)混勻器攬動(dòng)的3%化C12溶液中，形成海藻酸巧 微膠囊，乳濁液與化C12溶液的體積比為1:1，噴霧完畢后繼續(xù)攬拌30min。離屯、收集微膠囊， 然后將微膠囊分散到0.2%的殼聚糖溶液中，充分?jǐn)埌?0-40min，離屯、收集微膠囊，蒸饋水 洗涂3次并離屯、后，再將收集的微膠囊分散在8%的甘露醇溶液中，混勻后冷凍，經(jīng)冷凍干燥 后，封蓋包裝，即制成亞單位口服微膠囊疫苗。利用顯微鏡對制備的微膠囊進(jìn)行表觀特性觀 察，可見微膠囊顆粒大小均勻，平均直徑為150 ± 1 Own。
[0032] 實(shí)施例4:fliC亞單位微膠囊疫苗對牙解的免疫保護(hù)效果
[0033] 準(zhǔn)備健康牙解共80尾，平均體重為50g±5g，利用可控溫循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)對牙解暫養(yǎng) 7天，水溫控制為2rC，期間正常投喂商品化顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)前，將魚平均分為2組，每組40 尾，在對供試魚體禁食2地后，對免疫組魚體投喂η iC亞單位口服微膠囊疫苗，投喂方法:將 口服微膠囊疫苗與魚飼料混合投入水體，供魚體自由采食，使用劑量為:每kg體重魚體投放 微膠囊疫苗〇.5g，連續(xù)投喂5天。首次投喂后15天，再次進(jìn)行二次免疫，用法及用量與首次相 同。對照組魚體投喂W不含免疫原與黃巧多糖的海藻酸鋼溶液制備的微膠囊顆粒，投喂方 法與投喂量與免疫組相同，在首次投喂后35天，利用生理鹽水配制遲純愛德華氏菌活菌懸 液，濃度為lXl〇7CFU/ml，采用肌肉注射方式對實(shí)驗(yàn)魚體進(jìn)行攻毒，每尾注射10化1。攻毒后 連續(xù)觀察并記錄魚體發(fā)病與死亡狀況，計(jì)算遲純愛德華氏菌亞單位口服微膠囊疫苗對牙解 的相對免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示對照組魚體累計(jì)死亡率超過90%，免疫組魚體在攻毒后20天 的累計(jì)死亡率不超過20%，通過計(jì)算得知，本發(fā)明研制的遲純愛德華氏菌亞單位口服微膠 囊疫苗對牙解的相對免疫保護(hù)率在80 % W上。
[0034] 而且，用遲純愛德華氏菌ET菌株攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的flic亞單位口 服微膠囊疫苗相比于市售的其它遲純愛德華氏菌有關(guān)的疫苗的免疫效果明顯更好(P< 0.05)，推測是由于flic基因的氨基酸序列差異導(dǎo)致的。
[0035] 綜上所述，本發(fā)明研制的遲純愛德華氏菌亞單位口服微膠囊疫苗，使用方便，粒徑 合適，具有良好的緩釋性和抗原保護(hù)性，且能有效刺激魚體腸道免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使 魚體獲得對遲純愛德華氏菌的特異性免疫保護(hù)力，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種微膠囊疫苗，其特征在于，所述的微膠囊疫苗中使用的抗原是氨基酸序列為SEQ ID NO: 1 的fliC蛋白。2. 如權(quán)利要求1所述的微膠囊疫苗，其特征在于，所述的fliC蛋白，其編碼基因的核苷 酸序列為SEQ ID NO:2。3. 如權(quán)利要求1所述的微膠囊疫苗，其特征在于，所述的fliC蛋白用脂多糖進(jìn)行了偶 聯(lián)。4. 權(quán)利要求1所述的微膠囊疫苗的制備方法，其特征在于，是將fliC蛋白與黃芪多糖混 合，再與海藻酸鈉混合，用蒸餾水配制成乳濁液，將乳濁液攪拌均勻后，噴入濃度為3%的 CaCl2的溶液中，形成海藻酸鈣微膠囊，噴霧完畢后繼續(xù)攪拌20min;離心收集海藻酸鈣微膠 囊，然后將微膠囊分散到〇. 2%的殼聚糖溶液中，充分?jǐn)嚢韬?，離心收集微膠囊，蒸餾水洗滌 后，再將收集的微膠囊分散在甘露醇溶液中，混勻后冷凍，經(jīng)冷凍干燥后制成微膠囊疫苗。5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的乳濁液中海藻酸鈉的終濃度為 2%〇6. 權(quán)利要求1所述的微膠囊疫苗作為飼料添加劑的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的飼料添加劑為牙鲆的飼料添加劑。8. -種牙鲆飼料，其特征在于，所述的飼料中使用了權(quán)利要求1所述的微膠囊疫苗。
【文檔編號】A61K9/50GK105920594SQ201610411274
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】類延樂, 張銘, 李明亮, 沈彤, 孫翠彥
【申請人】類延樂