專利名稱：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種中編碼毒素的新型dan片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼殺蟲蛋白的新型DNA片段，以及利用這些蛋白來防治昆蟲，尤其是防治蚊蟲。具體地說，本發(fā)明涉及編碼130KD的殺蚊蛋白的DNA片段，該蛋白由蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Bacillusthuringiensissubsp.israelensis)產(chǎn)生。另外，還對含有新型DNA片段的嵌合基因和摻入了此片段的細(xì)菌、組織、種子和植株進(jìn)行了討論。
蘇云金芽孢桿菌以色列亞種是一種能形成孢子的革蘭氏陽性細(xì)菌(Goldberg等，MosquitoNews37∶355-358，1977)，它在形成孢子時(shí)產(chǎn)生伴孢的δ-內(nèi)毒素晶體(Somerville，TrendsBiochem.Sci3∶108-110，1978;Bulla等，Crit.Rev.Microbiol.8∶147-204，1980)。該δ-內(nèi)毒素對蚊和蚋的幼蟲有劇毒(deBarjac，CRAcad.Sci.Paris，SerD286∶797-800，1978，Thomas等，J.CellSci.60∶181-197，1983)，另外對紅細(xì)胞還有溶解活性(Thomas等，J.CellSci.60∶181-197，1983)。純化的以色列亞種晶體內(nèi)含物主要包含幾種不同分子量的多肽，其中有MW為130KD的二聚體(即兩個(gè)蛋白各自的MW為130KD)、MW為65KD和MW為27KD，以及其他小分子蛋白，見Huber等，“PathogenesisofMicrobialDiseases”，Davidson，E.W.編，AllanheldOsmun，NewJersey，209-234，1981;Thomas等，J.CellSci.60∶181-197，1983;Yamamoto等，Curr.Microbiol.9∶279-284，1983)。這些多肽對以色列亞種晶體總毒性的相對貢獻(xiàn)已引起足夠的重視。
最近已有兩種方法來揭示組成以色列亞種晶體的各種多肽成分的活性，有好幾個(gè)研究小組報(bào)道用生化技術(shù)從晶體或晶體/孢子混合物中分離以色列亞種蛋白，見Davidson等，Curr.Microbiol.11∶171-174，1984;Thomas，Ph.DThesis，UniversityofCambridge，1984;Armstrong等，J.Bacteriol.161∶39-46，1985;Wu等，F(xiàn)EBSLetts190∶232-236，1985;Lee等，Biochem.Biophys.Res.Commun.126∶953-960，1985;Hurley等，Biochem.Biophys.Res.Commn.126∶961-965，1985;Cheung等，Curr.Microbiol.12∶121-126，1985;Wisser等，F(xiàn)EBSLetts.30∶211-214，1985;Ibarra等，J.Bacteriol，165∶527-533，1986。利用該方法，在無其他多肽存在的條件下，對130KD二聚體、65KD和27KD多肽進(jìn)行了研究。
另外一種方法是用遺傳方法進(jìn)行分離，已有幾例報(bào)道，見Ward等，F(xiàn)EBSLetts.175∶377-381，1984;Waalwijk等，NucleicAcidRes.13∶8207-8216，1985;Sekar等，Gene33∶151-158，1985;Ward等，J.Mol.Biol.191∶1-11，1986;Thorne等，J.Bacteriol.166∶801-811，1986。編碼27KD蛋白的結(jié)構(gòu)基因已在大腸桿菌(Escherichiacoli)中克隆和表達(dá)(Ward等，F(xiàn)EBSLetts.175∶377-381，1984;Waalwijk等，NucleicAcidRes.13∶8207-8216，1985)，在枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)的兩個(gè)品系中也已克隆和表達(dá)(Ward等，J.Mol.Biol.191∶13-22，1986)。另外，該基因的核苷酸序列也已報(bào)道。見Waalwijk等，NucleicAcidRes.13∶8207-8216，1985;Ward等，J.Mol.Biol.191∶1-11，1986。編碼MW為72KD的殺蚊蛋白的結(jié)構(gòu)基因已被克隆，其順序也已測定(Thorne等，J.Bacteriol.166∶801-811，1986)，它與從古爾西亞種HD1-Dipel(Subsp.KurstakiHD1-Dipel)中分離的“5.3Kb”基因有部分同源性(Schnepf等，J.Biol.Chem.260∶6264-6272，1985)。另外，用巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)作為克隆宿主，也已分離得到了編碼殺蚊蛋白的以色列亞種基因(Sekar等，Gene33∶151-158，1985)。最近Yamamoto等在“FundamentalandAppliedAspectsofInvertebratePathology”，Samson等編(FourthInternationalColloquiumofInvertebratePathology，Netherlands，1986)中報(bào)道了該基因的核苷酸序列，開放解讀框長度表明它編碼MW為130KD二聚體中的一個(gè)蛋白。含有該基因的巨大芽孢桿菌的重組細(xì)胞能合成130KD多肽，它能與用以色列亞種晶體蛋白誘發(fā)的抗血清進(jìn)行免疫反應(yīng)(Sekar，Biochem.Biophys.Res.Commn.137∶748-751，1986)。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了編碼以色列亞種的第二種130KD蛋白的基因。該基因編碼的蛋白有殺蟲特性，為防治昆蟲害蟲提供了又一個(gè)有用的試劑。
本發(fā)明涉及編碼殺蟲蛋白的新型DNA片段。具體說是涉及這樣一種編碼殺蟲蛋白的DNA片段，它包括一個(gè)與圖7所示的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種新型基因序列及其殺蟲劑部分同源或基本同源的核苷酸序列(該基因從bp1至bp4451為止)。所述的殺蟲劑部分包括，例如，一個(gè)與圖7所示的bp891至bp4430的核苷酸序列同源或基本同源的核苷酸序列。作為發(fā)明主題的DNA片段編碼殺蟲蛋白，尤其是殺蚊蛋白，其氨基酸順序與圖7所示的氨基酸順序及其殺蟲劑部分同源或基本同源，本發(fā)明也涉及這些蛋白。一種優(yōu)選的蛋白質(zhì)是分子量約為130KD的蛋白。本發(fā)明還包括含有殺蟲劑量的這種蛋白的殺蟲組合物，和在防治地點(diǎn)施用殺蟲劑量的這種蛋白以控制昆蟲的方法。
本發(fā)明還涉及能在微生物中表達(dá)的嵌合基因，尤其是在大腸桿菌中表達(dá)。該基因包含(1)一個(gè)含啟動子區(qū)的DNA片段和(2)一個(gè)如上所述的編碼殺蟲蛋白的DNA片段。一個(gè)較好的啟動子區(qū)是含有l(wèi)acZ啟動子的片段。在一個(gè)優(yōu)選的具體方案中，嵌合基因還包括一個(gè)3′-倒位重復(fù)序列。在使用大腸桿菌的最佳具體方案中，嵌合基因還包括一個(gè)3′-倒位重復(fù)序列和含有l(wèi)acZ啟動子的啟動子區(qū)。最佳具體方案示于圖9中。本發(fā)明還涉及含有這種嵌合基因的微生物，尤其是大腸桿菌，和利用這些嵌合基因改變微生物的性質(zhì)和特征。
另外，本發(fā)明還涉及能直接在植物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的嵌合基因，它包括(1)含有一個(gè)啟動子區(qū)的DNA片段和(2)一個(gè)如上所述的編碼殺蟲蛋白的DNA片段。本發(fā)明還涉及含有這些嵌合基因的植物細(xì)胞和植物組織、植物種子和在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有這些嵌合基因的植株，以及利用這些嵌合基因改變植物細(xì)胞、植物組織、植物種子和/或植株的性質(zhì)或特征。


圖1表示以p130/P1-1DNA啟動的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)在大腸桿菌中合成35S標(biāo)記的多肽后在13%聚丙烯酰胺SDS凝膠上的熒光X-線顯影圖。泳道1為利用免疫前的血清在體外反應(yīng)的沉淀物，泳道2為利用以色列亞種130KD二聚體誘發(fā)的抗血清在體外反應(yīng)得到的沉淀物。泳道3為14C標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)分子量。標(biāo)準(zhǔn)分子量的大小(KD)在左沿標(biāo)出。
圖2表示構(gòu)建完整的130KDδ-內(nèi)毒素基因(pPC130)的方案，由Sekar等在Gene33∶151-158(1985)中和Yamamoto等在“FundamentalandAppliedAspectsofInvertebratePathology”，Samson等編(FourthInternationalColloquiumofInvertebratePathology，Netherlands，1986)中描述。黑色環(huán)狀線代表來自pUC18載體的DNA，由Yanisch-Perron等在Gene33∶103-119(1985)中描述。作為放射性標(biāo)記探針的限制性片段由p130/P1-1下面的粗直線標(biāo)出。
圖3表示在以新型pCC130DNA啟動的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)和添加有35S-甲硫氨酸的條件下，在大腸桿菌中合成35S標(biāo)記的多肽后在13%聚丙烯酰胺SDS凝膠上得到的熒光X-線顯影圖。泳道1為利用免疫前的血清在體外反應(yīng)得到的沉淀物;泳道2為利用以色列亞種130KD二聚體誘發(fā)的抗血清在體外反應(yīng)得到的沉淀物;泳道3為14C標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)分子量。標(biāo)準(zhǔn)分子量的大小(KD)在左沿標(biāo)出。
圖4表示pCC130中以色列亞種的新型DNA插段的部分限制性圖譜。開放解讀框(ORF)編碼的N-末端氨基酸由黑線標(biāo)出。
圖5(a)、(b)、(c)表示pCC130中3.94Kb插段的新型核苷酸序列，相應(yīng)于截?cái)嗟拈_放解讀框(始于核苷酸891)的氨基酸序列在相應(yīng)序列之下標(biāo)出。SD表示Shine-Dalgarno序列位置，Shine等，Nature，245∶34-38(1975)。
圖6表示以色列亞種130KD新型基因羧基端克隆的方案。首先，用一個(gè)放射性標(biāo)記的1.8KbHindⅢ-ClaⅠ片段分離編碼羧基末端的2.3KbHindⅢ片段。然后再用該片段構(gòu)建pCH130(它包括完整的δ-內(nèi)毒素基因)。
圖7(a)、(b)、(c)、(d)表示pCH130的4.46Kb插段的新型核苷酸序列，它構(gòu)成了以色列亞種130KD的新型δ-內(nèi)毒素基因。4.46Kb插段的獲得過程如下來自pCC130插段的3.94Kb片段和0.52KbC-末端ClaⅠ-HindⅢ片段(利用放射性標(biāo)記的HindⅢ-ClaⅠ片段分離HindⅢ片段得到)。相應(yīng)于開放解讀框的氨基酸序列(bp891至bp4430)在相應(yīng)的序列下面標(biāo)出。在相應(yīng)的序列之上標(biāo)出了若干限制性酶切割位點(diǎn)。SD表示Shine-Dalgarno序列的位置，Shine等，Nature245∶34-38(1975)。三個(gè)星號“＊＊＊”表示終止密碼TGA(對應(yīng)于mRNA中UGA的DNA)。
圖8表示利用矩陣分析，將pCH130ORF的新型結(jié)構(gòu)基因序列與以前報(bào)道的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素基因的核苷酸序列進(jìn)行比較。用來比較的已知基因序列如下(a)pPC130，它編碼一個(gè)MW為130KD的以色列亞種δ-內(nèi)毒素，見Sekar等，Gene33∶151-158(1985)和Yamamoto等在“FundamentalandAppliedAspectsofInvertebratePathology”中，Samson等編(FourthInternationalColloquiumofInvertebratePathology，Netherlands，1986);(b)編碼72KD多肽的以色列亞種基因(Thorne等，J.Bacteriol.166∶801-811，1986);(c)編碼MW為27KD的以色列亞種δ-內(nèi)毒素的基因(Waalwijk等，NucleicAcidsRes.13∶8207-8216，1985和Ward等，J.Mol.Biol.191∶1-11，1986);(d)編碼鱗翅昆蟲特異性毒素的古爾西亞種δ-內(nèi)毒素基因(Schnepf等，J.Biol.Chem.260∶6264-6272，1985)。每個(gè)基因的核苷酸數(shù)在相應(yīng)的邊緣標(biāo)出，調(diào)查部分的長度＝15，錯(cuò)配的最大數(shù)＝3。
圖9表示以色列亞種新型δ-內(nèi)毒素基因與lacZ啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄融合的構(gòu)建。利用合成的寡核苷酸
5′-CTCAATTTGGATCCACTCTTTT-3′()在核苷酸861至867位點(diǎn)產(chǎn)生單一的BamHⅠ位點(diǎn)。然后，該1.3Kb的BamHⅠ-HindⅢ片段用來與pCH130的2.3KbHindⅢ片段連接，構(gòu)建以lacZ為啟動子的完整毒素基因的轉(zhuǎn)錄融合。另外，利用來自pPC130的HindⅢ-ClaⅠ片段(編碼基因外3′倒位重復(fù)序列)構(gòu)建pBC130。
圖10表示利用以色列亞種130KD二聚體誘發(fā)的抗血清獲得的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的免疫印跡。泳道1為來自含pBC130的大腸桿菌溶菌產(chǎn)物的大約200μg蛋白;泳道2為大約100μg的與泳道1相同的溶菌產(chǎn)物;泳道3為取自含pUC18的大腸桿菌溶菌產(chǎn)物的大約200μg蛋白;泳道4為50μg以色列亞種的純化晶體蛋白。箭頭表示以色列亞種130KD二聚體的位置。
下面為本發(fā)明說明書和/或權(quán)利要求書中涉及的略縮語、術(shù)語和短語的解釋。
這里采用的單字母C、G、A和T分別表示DNA中的胞嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷的縮寫，U表示RNA中的尿嘧啶核苷的縮寫。
本文采用的氨基酸縮寫如下Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn門冬酰胺Asp門冬氨酸Cys半胱氨酸Gly甘氨酸Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸His組氨酸Lys賴氨酸
Ile異亮氨酸Leu亮氨酸Met甲硫氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val纈氨酸縮寫“bp”表示堿基對，“Kb”表示千堿基對，“KD”表示千道爾頓，“mD”表示兆道爾頓和“MW”表示分子量。
短語“DNA片段或序列”在本文中包括單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸和單鏈的核糖核酸。
短語“順序同源性”或“同源的”在這里根據(jù)具體內(nèi)容表示(1)一個(gè)DNA片段與另外一個(gè)DNA片段有相同的核苷酸序列或(2)一個(gè)蛋白質(zhì)與另外一個(gè)蛋白質(zhì)有相同的氨基酸序列。
短語“基本同源的序列”或“基本同源的”在這些根據(jù)具體內(nèi)容表示(1)一個(gè)DNA片段與另外一個(gè)片段有足夠相似的核苷酸序列，使得兩者編譯的蛋白質(zhì)有相似的性質(zhì)或特征或(2)一個(gè)蛋白與另外一個(gè)蛋白有足夠相同的氨基酸序列，使得兩者表現(xiàn)出相似的性質(zhì)或特征。
術(shù)語“殺蟲劑部分”在這里根據(jù)具體內(nèi)容表示(1)DNA片段中編碼殺蟲蛋白的部分或(2)殺蟲蛋白中起殺蟲作用的片段本身。
短語“嵌合基因”在這里表示一個(gè)雜合的DNA部分，它包含一個(gè)來自某基因源的啟動子區(qū)，并與至少一個(gè)來自另一基因源的編碼殺蟲蛋白的DNA片段融合。
術(shù)語“3′-倒位重復(fù)序列”在這里表示位于本發(fā)明中編碼殺蟲劑的新型DNA片段3′端下游的一個(gè)DNA序列，在轉(zhuǎn)錄為mRNA時(shí)，它能形成一個(gè)發(fā)夾式環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“啟動子”在這里表示一個(gè)DNA片段，該片段位于編碼序列3′端的上游，它與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。
術(shù)語“微生物”在這里包括單細(xì)胞生物如原核生物，如藍(lán)藻門(藍(lán)綠藻)，或類似大腸桿菌屬的細(xì)菌、低等真核生物，如類似酵母的真菌和類似脈孢菌屬(Neurospora)和曲霉菌屬(Aspergillus)的發(fā)酵真菌，或類似于紅藻門、褐藻門和綠藻門的藻類、原生生物(如變形蟲、原生動物)和病毒(如棒狀病毒或核多角體病毒)。
術(shù)語“植物細(xì)胞”在這里表示來自多細(xì)胞高等植物的細(xì)胞(無論是完整植株的或培養(yǎng)的細(xì)胞)。
術(shù)語“植物組織”在這里表示分化的或未分化的植物細(xì)胞，包括但不限于在完整植株中的或培養(yǎng)的根、枝、腫瘤組織(如冠癭瘤)、花粉等。
術(shù)語“殺蟲劑的”在這里單獨(dú)使用或與其他術(shù)語聯(lián)合使用時(shí)，表示對昆蟲有毒的(致死的)或有害的(半致死的)。
本發(fā)明編碼殺蟲劑的新型DNA片段可從蘇云金芽孢桿菌的72mD質(zhì)粒中得到，通過本文所述的遺傳工程和分子克隆技術(shù)及其改變完成這個(gè)過程。這些技術(shù)的適當(dāng)改變對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，遺傳工程和分子克隆方法見于普通的參考文獻(xiàn)，見Maniatis等，“MolecularCloning∶ALaboratoryManual”，ColdSpringHarbor(1982)。一個(gè)帶有72mD質(zhì)粒的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種菌株已保藏在NationalCollectionofIndustrialandMarineBacteria，TorryResearchStation，POBOX31，135AbbeyRoad，Aberdeen，ScotlandAB98DG，保藏號為NCIB12492。
本發(fā)明的DNA片段包括一個(gè)與蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的新基因核苷酸序列同源或基本同源的核苷酸序列，如圖7所示從bp1開始至bp4451為止，或與其中的殺蟲劑部分(如bp891至bp4430或bp891至bp2700)同源或基本同源。優(yōu)選的DNA片段與圖7的bp1至bp4451或bp891至bp4430或bp891至bp2700的片段同源。
本發(fā)明的DNA片段編碼的蛋白質(zhì)能夠殺蟲，尤其能夠殺蚊。這些蛋白能有效殺傷的蚊蟲種類有(但不限于)埃及伊蚊(Aedesaegypti)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)和庫蚊(Culex)。伊蚊和按蚊的控制尤為重要，因?yàn)檫@些蚊蟲在世界某些地區(qū)分別攜帶能引起致命的黃熱病和痢疾的寄生蟲，優(yōu)選的目標(biāo)蚊蟲為埃及伊蚊。
盡管蛋白質(zhì)可與圖7所示的氨基酸序列或其殺蟲部分同源或基本同源，但優(yōu)選蛋白的氨基酸序列與該圖中的序列同源或與其殺蟲部分同源。所謂的殺蟲部分包括(例如)由這樣的DNA片段編碼的蛋白質(zhì)，該片段包括一個(gè)與圖7所示的bp891至約bp2700的核苷酸序列同源或基本同源的DNA片段。一種較好的蛋白質(zhì)具有大約130KD的分子量，它最好與圖7所示的氨基酸序列同源。
本發(fā)明還涉及能在微生物或植物細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因，它包括(1)一個(gè)含啟動子區(qū)的DNA片段和(2)一個(gè)能編碼上述殺蟲劑部分的DNA片段。所用的特定啟動子區(qū)必須是微生物或植物細(xì)胞能識別的，即，它必須能夠結(jié)合微生物或植物細(xì)胞中的RNA聚合酶，并將此酶引導(dǎo)至編碼殺蟲劑的DNA片段的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
在希望用來進(jìn)行表達(dá)的微生物中，優(yōu)選微生物為大腸桿菌或藍(lán)綠藻。其他許多微生物，尤其是原核生物或低等真核生物如真菌也可采用。例如原核生物包括腸細(xì)菌科，如大腸桿菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和變形桿菌屬(Proteus);桿菌科;根瘤菌科，例如根瘤菌屬(Rhizobium)和土壤桿菌屬(Agrobacterium);螺旋菌科，例如發(fā)酵八疊球菌屬(Zymomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、氣單孢菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、巨大脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺菌屬(Spirillum);乳桿菌科;假單孢菌科，例如假單孢菌屬(Pseudomonas)和醋桿菌屬(Acetobacter);固氮菌科;硝化細(xì)菌科;和藍(lán)藻門(藍(lán)綠藻)。用來舉例說明的真核生物包括如紅藻門、褐藻門、綠藻門的藻類;如藻狀真菌和子囊菌類的真菌，其中有酵母屬(Saccharomyces)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces);如紅酵母菌屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的擔(dān)子菌類;和菌根真菌。
利用大腸桿菌作為宿主時(shí)的優(yōu)選啟動子區(qū)是含有l(wèi)acZ啟動子的片段，適用于大腸桿菌和此處其他微生物的其他啟動子區(qū)和其他促進(jìn)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，如見Old等，“PrinciplesofGeneManipulation”，Carr等編(BlackwellScientificPublications，1985);Rosenburg等，Ann.Rev.ofGenetics13∶319(1979)。
在一個(gè)優(yōu)選的具體方案中，嵌合基因還包括一個(gè)3′-倒位重復(fù)序列。如上所述，此3′倒位重復(fù)序列涉及一個(gè)位于本發(fā)明編碼殺蟲劑的新型片段3′端下游的DNA序列，當(dāng)它轉(zhuǎn)錄為mRNA時(shí)，能形成一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾式環(huán)狀結(jié)構(gòu)。加入這個(gè)倒位重復(fù)序列是為了提高編碼殺蟲劑的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的DNA片段的表達(dá)水平。就本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，要形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這個(gè)倒位重復(fù)的DNA序列必須包含兩個(gè)相互鄰接的區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域有同源或基本同源的序列，但是方向相反。人們認(rèn)為，環(huán)狀結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，蛋白質(zhì)表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)越大。就本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，倒位重復(fù)序列中的兩個(gè)區(qū)域同源程度越大和相鄰越緊密，得到的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性就越大。對于本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員來說，合適的倒位重復(fù)序列是很明顯的，它包括(例如)序列5′-TTAAAAACCATGGAGAAAGTTTTCTCCATGGTTTTTAA-3′，以及古爾西亞種δ-內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)基因3′端外的倒位重復(fù)序列，見于Wong等，“MolecularBiologyofMicrobialDifferentiation”，ProceedingsoftheNinthInternationalSporesConference，Asilomer，California，September1984，Hoch等編，AmericanSocietyofMicrobiology，Washington，D.C.。優(yōu)選的重復(fù)序列為5′-TTAAAAACCATGGAGAAAGTTTTCTCCATGGTTTTTAA-3′就本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知，還有一些位于本發(fā)明片段3′端下游的其他DNA片段也能起到促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)的作用。這些片段中有多聚腺苷酸序列，在下列文獻(xiàn)中有描述“MolecularMechanismsofProteinBiosynthesis”，Weissbach等編，562-565頁(AcademicPress，NY1977);Watson等，“RecombinantDNAAShortCourse”(W.H.Freedman&Co.，NY，1983);Alberts等，“MolecularBiologyoftheCell”(GarlandPublishing，NY.1983)。
在使用大腸桿菌的最佳具體方案中，嵌合基因的啟動子區(qū)包括lacZ啟動子，該基因還進(jìn)一步包括3′-倒位重復(fù)序列。最佳具體方案是如圖9所示的構(gòu)建物。
適于本發(fā)明嵌合基因表達(dá)的植物細(xì)胞，以及啟動子和有助于這種表達(dá)的其他調(diào)節(jié)序列在歐洲專利193，259和142，924及Rosenburg等，Ann.Rev.ofGenetics13∶319(1979)中已有描述。其他適宜的植物細(xì)胞和啟動子對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明還涉及包含這些嵌合基因的微生物和植物細(xì)胞，以及在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中包含這些嵌合基因的植物組織、植物種子和植株。這些嵌合基因用來改變這些微生物、植物細(xì)胞，植物組織、植物種子和/或植株的性質(zhì)或特征，如在Maniatis等“MolecularCloningALaboratoryManual”，ColdSpringHarbor(1982)和歐洲專利193，259和142，924中所述，可用普通的遺傳工程方法，用嵌合基因來轉(zhuǎn)化微生物和植物細(xì)胞。需要修飾的性質(zhì)或特征應(yīng)該是殺蟲劑的性質(zhì)或特征，而不應(yīng)是微生物、植物細(xì)胞、植物組織、植物種子和/或植株本身的性質(zhì)或特征。
含有殺蟲劑量前述蛋白質(zhì)的殺蟲組合物和在防治地點(diǎn)為控制昆蟲而使用殺蟲劑量的這種蛋白的方法也屬于本發(fā)明范圍。
在使用時(shí)，將分離的蛋白質(zhì)或含這些蛋白質(zhì)的完整微生物或植物細(xì)胞(包括植物組織、植物種子和/或植株)施用于防治地點(diǎn)(或地區(qū))。防治地點(diǎn)包括如昆蟲害蟲的棲息地或生長的植被或種植植被的地方。分離這些蛋白時(shí)，可利用合適的方法，如酶法降解或去污劑或類似物，來溶解微生物或植物細(xì)胞，用普通技術(shù)，如層析、萃取、電泳或類似方法來去除和純化蛋白。另外，可將微生物或植物細(xì)胞收獲后干燥或施用完整的活的微生物、植物細(xì)胞、植物組織、植物種子和/或植株。
分離的蛋白或收獲后干燥的含蛋白的微生物或植物細(xì)胞可以單獨(dú)使用或制成組合物。組合物配制有多種方法，根據(jù)特定的使用目的，可利用任一常規(guī)的添加劑，濕的或干的均可。添加劑包括濕潤劑、洗滌劑、穩(wěn)定劑、粘結(jié)劑、分散劑或擴(kuò)散劑。具體的組合物有膏劑、粉末、可濕性粉末、顆粒、毒餌和氣溶膠組合物。其他殺蟲劑和殺真菌劑、殺生物劑、除草劑或化肥也可與這些蛋白、微生物或植物細(xì)胞一起使用，以獲得更多的優(yōu)點(diǎn)或效益。
這些組合物可用常規(guī)方法制備。蛋白或含蛋白的微生物或植物細(xì)胞的使用量依賴許多因子，如目標(biāo)害蟲、所用組合物類型、使用組合物的地區(qū)的性質(zhì)和一般的氣候狀況。通常，殺蟲蛋白的濃度至少占配方總重的0.1%至100%，通常使用的是0.15%至0.8%。
在實(shí)踐中，在防治地區(qū)飼喂某些昆蟲，在該地區(qū)已使用了殺蟲蛋白(單獨(dú)使用或使用組合物)。另外，某些昆蟲喂以完整的和活的帶有嵌合基因的微生物、植物細(xì)胞、植物組織、植物種子和/或植株。在任一種狀況下，昆蟲攝取某些殺蟲蛋白后死亡或損傷。
以下實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)例只是進(jìn)一步解釋而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例中給出的分子量全是由聚丙烯酰胺凝膠電泳估計(jì)得到的近似平均分子量。
實(shí)例一般程序-材料和方法大腸桿菌TGl(K12，α(lac-pro)，supE.thi，hsdD5/f′tra D36，proA+B+，lacIq，lac Z△M15，ampS)可從Medical Research Council(MRC)，Laboratory of Molecular Biology，Cambridge，England得到，pUC18(Yanisch-Perron等，Gene 33∶103-119，1985)可從New England Biolabs，Bethesda Research Labs，Bethesda，MD，USA得到，它們分別作為克隆宿主和載體，用M13tg 130進(jìn)行DNA序列測定(從Amersham PLC，Amersham，Buckinghamshire，England獲得)。
限制性酶可從NewEnglandBiolabs，BethesdaResearchLabs，Bethesda，MD，USA得到，并在Maniatis等在“MolecularCloningALaboratoryManual”，ColdSpringHarbor(1982)中推薦的緩沖液中使用。T4DNA連接酶和DNA聚合酶的Klenow片段也被采用，它們的來源廣泛而方便。在中性鹽緩沖液中用牛腸磷酯酶(從BCL得到，TheBoehringerCorp.(London)Ltd.，EastSussex，England)使載體DNA脫磷酸(參見Maniatis等，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor，1982)。35S甲硫氨酸、α-32P-dATP和α-35S-dATP從Amersham PLC，Amersham，Buckinghamshire，England購買。
雙脫氧核苷酸鏈終止法的描述見于Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5463-5468(1977)和Bankier等，在“TechniquesintheLifeScience”Vol.B508∶1-34(1983)，用此方法測定DNA順序。利用杯角型聲波處理器(CuphornSonicator)(HeatSystems-Ultrasonics，Inc.，Plainfield，Ny.USA，ModelW-375)處理產(chǎn)生隨機(jī)的DNA片段。對聲波處理的DNA末端進(jìn)行修復(fù)，然后通過低溫膠凝的瓊脂糖(FMCCorporation，MarineColloidsDivision，Rockland，ME04841)凝膠電泳根據(jù)大小對所需組分進(jìn)行分離和純化。然后將末端修復(fù)并按大小分離的DNA與SmaⅠ切割并用磷酯酶作用過的M13tg130相連接。
重組細(xì)胞在2XTY培養(yǎng)基(BankierandBarrell，1983)中培養(yǎng)，其中含有100μg/ml氨芐青霉素，使之生長至指數(shù)生長期中期，然后加入誘導(dǎo)劑IPTG(Sigma)至濃度為0.5mM。培養(yǎng)40-44小時(shí)后通過離心收獲細(xì)胞，獲得的細(xì)胞沉淀用蒸餾水沖洗2次，然后重新懸浮于50mlTris-醋酸pH8.0，10%W/V蔗糖，2mg/ml溶菌酶的溶液中。懸浮液在冰上保溫10分鐘，然后用聲波處理(DawesInstruments，London，England)4-5次，每次以最大強(qiáng)度作用30秒。得到的溶菌產(chǎn)物部分用來進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或毒性分析。
這里采用的抗血清是用以色列亞種130KD二聚體注射新西蘭白兔誘發(fā)的，該二聚體通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Walker等，“MethodsinPeptideandProteinSequenceAnalysis”，257-265(Elsevier/NorthHollandBiomedicalPress，1980))純化。在皮下注射以前將純化的蛋白用Freunds完全(第一次注射)或不完全(后續(xù)注射)佐劑乳化。Freunds完全和不完全佐劑可從DifcoLaboratories，Detroit，MI得到。通過免疫印跡法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76∶4350-4354，1979)分析抗血清的專一性和滴度，用辣根過氧化物酶聯(lián)的抗兔免疫球蛋白檢測結(jié)合的抗體(參照Hawke等，Anal.Biochem.119∶142-147，1982)。
實(shí)例1以色列亞種130KDδ-內(nèi)毒素新型基因的克隆根據(jù)Ward等，F(xiàn)EBSLetts175∶337-381(1984)以前描述的方法，從蘇云金芽孢桿菌以色列亞種分離純化72mD質(zhì)粒，并用它作為克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)的以色列亞種DNA庫。將PstⅠ限制性酶解的72mD質(zhì)粒與PstⅠ磷酯酶作用過的pUC18連接，用得到的連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，使其產(chǎn)生氨芐青霉素抗性。利用Triton溶解法(Ward等，F(xiàn)EBSLetts175∶337-381，1984)從重組體中分離出DNA，用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯體外系統(tǒng)以引導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成(轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)可從AmershamPLC.Amersham，Buckinghamshire，England得到)。體外系統(tǒng)的產(chǎn)物用免疫沉淀法(參見Howe等，Mol.Gen，Genet.186∶525-530，1982)分析，采用純化的以色列亞種130KD蛋白誘發(fā)的抗血清，然后通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Laemmli，Nature227∶680-685，1970)和熒光X-線顯影(Chamberlain，AnalBiochem.98∶131-135，1979)。利用這個(gè)程序，分離得到一個(gè)重組體(鑒定為p130/P1-1)，該重組體能指導(dǎo)合成MW為110KD的交叉反應(yīng)多肽，在體外系統(tǒng)中分離得到這種截?cái)嗟难苌?。該重組體含有一個(gè)72mD質(zhì)粒的8KbPstⅠ片段與克隆載體pUC18的嵌合體。參見圖1。使用這種大腸桿菌轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)時(shí)，經(jīng)常觀察到截?cái)嘌苌?，它們可能是由于在體外轉(zhuǎn)譯的起始和終止發(fā)生異常而產(chǎn)生的偽跡。
然后用XbaⅠ限制性酶解p130/P1-1DNA，得到的片段用Dretzen等，Biochem.112∶295-298(1981)的程序進(jìn)行凝膠純化。限制性分析表明，1.8Kb和1.54KbXbaⅠ片段來自Sekar等，Gene33∶151-158(1985)描述過的3.34KbPstⅠ-XbaⅠ-XbaⅠ片段，最近的序列分析表明，它編碼一個(gè)130KD以色列亞種多肽(Yamamoto等，“FundamentalandAppliedAspectsofInvertebratePathology”，Samson等編(FourthInternationalColloquiumofInvertebratePathology，Netherlands，1986)。
為了分離相應(yīng)于此130KD基因上游的序列，采用Feinberg等，Anal.Biochem.132∶6-13(1983)的方法，將獲自3.34KbPstⅠ-XbaⅠ片段的1.54KbPstⅠ-XbaⅠ和1.8Kb XbaⅠ片段進(jìn)行放射性標(biāo)記，使其比活為108-109cpm/μg。將ClaⅠ限制性酶解的以色列亞種72mD質(zhì)粒連接至ClaⅠ限制性磷酯酶作用的pUC18中而構(gòu)建一個(gè)基因庫。用得到的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl而得到重組細(xì)胞，然后，利用Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78∶6091-6095(1975)描述的放射性標(biāo)記探針篩選同源基因。參見圖2。利用這些片段作為探針時(shí)，含有3.5Kb ClaⅠ插段的重組細(xì)胞顯示出很強(qiáng)的雜交信號。進(jìn)一步分析表明，這些插段與p130/P1-1的8Kb PstⅠ片段交迭。如圖2所示制備一個(gè)含完整130KDδ-內(nèi)毒素基因的構(gòu)建物，它被稱為pPC130。
有趣的是，在ClaⅠ限制性酶解的72mD質(zhì)?；驇斓碾s交研究中，鑒定到其他一些雜交菌落，它們在放射性自顯影后產(chǎn)生的信號比含有3.5Kb插段菌落的強(qiáng)度稍弱。這些菌落含有3.9KbClaⅠ片段和pUC18的嵌合體(稱為pCC130)。如圖3所示，在大腸桿菌的體外系統(tǒng)中，這些重組體之一的萃取DNA的分析表明，除了一個(gè)截?cái)嘌苌锿?，它還編碼一個(gè)約100KD的多肽，該衍生物與抗130KD二聚體血清有免疫沉淀反應(yīng)。pCC130的限制性圖譜如圖4所示。用雙脫氧核苷酸鏈終止法測定3.9Kb的核苷酸序列，并鑒別出一個(gè)擴(kuò)展的始于bp891的3.05Kb開放解讀框(ORF)。參見圖5。
為了分離pCC130攜帶的編碼截?cái)唳?內(nèi)毒素基因的羧基端DNA片段，用凝膠純化圖6所示的1.8KbHindⅢ-ClaⅠ片段，并進(jìn)行放射性標(biāo)記，按Feinberg等，Anal.Biochem.132∶6-13(1983)的方法進(jìn)行，用該片段作為基因?qū)Ｒ恍蕴结?。將HindⅢ限制性酶解的以色列亞種72mD質(zhì)粒DNA與克隆載體pUC18連接以建成基因庫，對此基因庫進(jìn)行的雜交研究分離出圖6所示的2.3KbHindⅢ片段，它由圖5中核苷酸3936處的ClaⅠ位點(diǎn)的3′端延伸520Kb。DNA的序列分析表明，該片段編碼由pCC130的截?cái)嗟拈_放解讀框編碼的蛋白的3′端。
利用標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組技術(shù)構(gòu)建pCH130(如圖6所示)，它包括一個(gè)pUC18和一個(gè)編碼MW為130KD多肽的開放解讀框的嵌合基因。圖7表示pCH130的4.46Kb插段的全部核苷酸序列，它構(gòu)成來自以色列亞種的130KDδ-內(nèi)毒素的新型基因。與從核苷酸891至4430為止的開放解讀框相對應(yīng)的氨基酸序列在相應(yīng)序列的下面標(biāo)出。
利用大腸桿菌重組細(xì)胞的免疫印跡法分析MW為130KD的蛋白在體內(nèi)的表達(dá)。用以色列亞種130KD二聚體誘發(fā)的純化的抗血清檢測δ-內(nèi)毒素的表達(dá)。含pCH130的大腸桿菌重組細(xì)胞表達(dá)MW為130KD的基因產(chǎn)物，然而，表達(dá)水平極低。
通過圖8的矩陣分析對pCH130ORF的新型結(jié)構(gòu)基因序列與以前報(bào)道的蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素基因進(jìn)行比較。具體地說，圖8(a)比較了pCH130基因和以色列亞種pPC130的130KD基因的核苷酸序列，后者的描述見于Sekar等，Gene33∶151-158(1985)和Yamamoto等，“FundamentalandAppliedAspectsofInvertebratePathology”，Samson等編，(FourthInternationalColloquiumofInvertebratePathology，Netherlands，1986)。圖8(b)是與以色列亞種72KD多肽的比較，該多肽已由Thorne等，J.Bacteriol.166∶801-811(1986)中描述。以色列亞種27KD基因核苷酸序列(Waalwijk等，NucleicAcidsRes.13∶8207-8216，1985和Ward等，J.Mol.Biol.191∶1-11，1986)和pCH130基因核苷酸序列的比較見圖8(c)。最后，圖8(d)為pCH130基因與古爾西亞種Plδ-內(nèi)毒素基因(Schnepf等，J.Biol.Chem.260∶6264-6272，1985)核苷酸序列的比較。盡管與已知基因相比有一些區(qū)域同源，但還是有明顯的區(qū)域不同。
實(shí)例2以色列亞種130KDδ-內(nèi)毒素新型基因的表達(dá)為了增強(qiáng)該蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的表達(dá)，利用圖9的步驟，將pUC18可誘導(dǎo)的lacZ啟動子與pCH130的ORF進(jìn)行轉(zhuǎn)錄融合。利用合成的寡核苷酸進(jìn)行定位誘變，如Cater等在“OligonucleotideSite-DirectedMutagenesisinM13”(AnglianBiotechnology，Ltd.，Colchester，Essex，England，1985)中描述，使得bp862與bp867之間的2個(gè)堿基對改變，在該位點(diǎn)產(chǎn)生單一的BamHⅠ限制性位點(diǎn)。然后用此修飾過的DNA構(gòu)建pBC130(如圖3所示)。質(zhì)粒pBC130包括130KDδ-內(nèi)毒素基因與相應(yīng)的SD序列(Shine等，Nature254∶34-38，1975)，它們與帶有l(wèi)acZ啟動子的轉(zhuǎn)錄框相融合。另外，最近的報(bào)道(見Wong等，“MolecularBiologyofMicrobialDifferenfiation”，ProceedingsoftheNinthInternationalSporesConference，Asilomar，California，September1984，Hoch等編，AmericanSocietyofMicrobiology，Washington，D.C.)表明，對古爾西亞種的δ-內(nèi)毒素基因來說，在古爾西亞種結(jié)構(gòu)基因3′端外的倒位重復(fù)序列對促進(jìn)克隆基因在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平很重要。所以，在pBC130的構(gòu)建中，來自pPC130的HindⅢ-ClaⅠ片段的3′倒位重復(fù)序列與ORF外的以色列亞種DNA融合，具體采用的3′倒位重復(fù)序列為5′-TTAAAAACCATGGAGAAAGTTTTCTCCATGGTTTTTAA-3′發(fā)現(xiàn)此倒位重復(fù)序列的存在促進(jìn)克隆的δ-內(nèi)毒素基因的表達(dá)。
采用標(biāo)準(zhǔn)程序(Maniatis等，“MolecularCloning.ALaboratoryManual”，ColdSpringHarbor，1982)，用pBC130質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。然后，如上述將含pBC130的大腸桿菌細(xì)胞在有l(wèi)acZ誘導(dǎo)劑(IPTG)存在下液體培養(yǎng)44小時(shí)(采用培養(yǎng)重組細(xì)胞的一般程序)。如前述裂解收獲的細(xì)胞，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用免疫印跡法進(jìn)行分析?？?30KD二聚體δ-內(nèi)毒素血清與MW為130KD(圖10)的多肽進(jìn)行專一性的交叉反應(yīng)。
實(shí)例3以色列亞種130KDδ-內(nèi)毒素新型基因的殺蟲活性含pUC18和pBC130的大腸桿菌的培養(yǎng)方法用標(biāo)準(zhǔn)程序中培養(yǎng)重組細(xì)胞的方法，載體的lacZ啟動子用IPTG誘導(dǎo)。把重組大腸桿菌的溶菌產(chǎn)物加到2ml含25個(gè)三齡期的埃及伊蚊幼蟲的自來水中(根據(jù)Thomas等，J.CellSci.60∶181-197，1983)。36小時(shí)后，用含pBC130的大腸桿菌處理的幼蟲，70-80%死亡，用含pUC180大腸桿菌細(xì)胞處理的幼蟲沒有病理影響。
殺死埃及伊蚊所需大腸桿菌pBC130溶菌產(chǎn)物的最低劑量還未測定。假如用于試驗(yàn)中的pBC130溶菌產(chǎn)物中δ-內(nèi)毒素抗原是總蛋白的1%，那么該試驗(yàn)中每毫升含10μgδ-內(nèi)毒素蛋白。所以在36小時(shí)內(nèi)，該濃度足夠使伊蚊幼蟲的死亡率達(dá)到70%。
通過上面的解釋和說明，本發(fā)明方法的各種改變形式對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，這些改變也落在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種編碼殺蟲蛋白的DNA片段，其特征在于它包括一個(gè)與圖7中bp1至bp4451的核苷酸序列及其殺蟲劑部分同源或基本同源的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA片段，它包括與圖7中bp891至bp4430的核苷酸序列及其殺蟲劑部分同源或基本同源的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA片段，它包括與圖7中bp891至約bp2700的核苷酸序列及其殺蟲劑部分同源或基本同源的序列。
4.一種DNA片段，其特征在于它含有一個(gè)編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列，該蛋白的氨基酸序列與圖7中的氨基酸序列同源或基本同源。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA片段，它編碼的殺蟲蛋白的氨基酸序列與圖7中的氨基酸序列同源或基本同源。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA片段，它編碼的殺蟲蛋白的分子量約為130KD。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的DNA片段，它編碼的殺蟲蛋白的分子量約為130KD。
8.一種能在微生物體內(nèi)表達(dá)的嵌合基因，其特征在于它包括的DNA片段含有一個(gè)啟動子區(qū)和一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求2的DNA片段。
9.一種能在微生物中表達(dá)的嵌合基因，其特征在于它包括的DNA片段含有一個(gè)啟動子區(qū)和一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求4的DNA片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的嵌合基因，其中的微生物是大腸桿菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的嵌合基因，其中的微生物是指藍(lán)綠藻。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的嵌合基因，其中的啟動子區(qū)含有l(wèi)acZ啟動子。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的嵌合基因，它還含有一個(gè)3′倒位重復(fù)序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的嵌合基因，它還含有一個(gè)3′倒位重復(fù)序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的嵌合基因，其中的啟動子區(qū)含有l(wèi)acZ啟動子。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的嵌合基因，它的結(jié)構(gòu)如圖9所示。
17.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求8的嵌合基因。
18.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求9的嵌合基因。
19.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求10的嵌合基因。
20.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求11的嵌合基因。
21.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求12的嵌合基因。
22.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求13的嵌合基因。
23.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求14的嵌合基因。
24.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求15的嵌合基因。
25.一種微生物，其特征在于它含有權(quán)利要求16的嵌合基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求8的嵌合基因，其特征在于可以用它改變微生物的性質(zhì)或特征。
27.一種能在植物細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因，其特征在于它包括的DNA片段含有一個(gè)啟動子區(qū)和一個(gè)權(quán)利要求2的DNA片段。
28.一種能在植物細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因，其特征在于它包括的DNA片段含有一個(gè)啟動子區(qū)和一個(gè)權(quán)利要求4的DNA片段。
29.一種植物細(xì)胞，其特征在于它含有權(quán)利要求27的嵌合基因。
30.一種植物細(xì)胞，其特征在于它含有權(quán)利要求28的嵌合基因。
31.一種植物組織，其特征在于它的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有權(quán)利要求27的嵌合基因。
32.一種植物組織，其特征在于它的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有權(quán)利要求28的嵌合基因。
33.一種植物種子，其特征在于它的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有權(quán)利要求27的嵌合基因。
34.一種植物種子，其特征在于它的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有權(quán)利要求28的嵌合基因。
35.一種植株，其特征在于它的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有權(quán)利要求27的嵌合基因。
36.一種植株，其特征在于它的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有權(quán)利要求28的嵌合基因。
37.根據(jù)權(quán)利要求27的嵌合基因，其特征在于可以用它改變植物細(xì)胞、植物組織、植物種子或植株的性質(zhì)或特征。
38.一種殺蟲蛋白，其特征在于它含有與圖7所示的氨基酸序列及其殺蟲劑部分同源或基本同源的氨基酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的殺蟲蛋白，其特征在于它的分子量約為130KD。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼殺蟲蛋白的新型DNA片段和使用這些殺蟲蛋白控制昆蟲，尤其是蚊蟲，還涉及含新型DNA片段的嵌合基因和摻入了這些基因的細(xì)菌、組織、種子和植株。
文檔編號C07K14/325GK1031396SQ88104708
公開日1989年3月1日 申請日期1988年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1987年6月26日
發(fā)明者戴維·約翰·埃拉, 伊麗莎白·薩利·沃德 申請人:納幕爾杜邦公司