專(zhuān)利名稱(chēng)：用于分段合成生物聚合物的多孔片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物聚合物的化學(xué)合成，特別涉及一種用于同時(shí)合成大量多苷核酸、多肽和多糖之類(lèi)生物聚合物的裝置。
近年來(lái)，一些所需順序的生物聚合物的化學(xué)合成方案的開(kāi)發(fā)已引起了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)許多領(lǐng)域內(nèi)的重大進(jìn)展。例如，合成DNA片段的結(jié)構(gòu)和相互作用的物理和生物化學(xué)研究已導(dǎo)致有關(guān)遺傳過(guò)程中分子作用機(jī)理(包括DNA代謝和基因表達(dá)的調(diào)節(jié))方面新的重大發(fā)現(xiàn)。合成多核苷酸通過(guò)用作DNA定序的引物，以及在基因克隆過(guò)程中作為雜交探測(cè)劑、連接子和轉(zhuǎn)接子，從而在遺傳機(jī)制的研究中起了關(guān)鍵性的作用。合成多核苷酸的另一用途是將DNA探查技術(shù)應(yīng)用于對(duì)疾病的診斷。此外，合成多核苷酸可用于基因置換療法中，以治療遺傳紊亂，以及用于其他基因組工藝過(guò)程，提供對(duì)疾病和饑餓的抵抗力。合成多核苷酸通常用于位點(diǎn)定向的體外誘變;研究遺傳調(diào)節(jié)元件內(nèi)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系;以及確定特定的氨基酸取代位置對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。后一用途稱(chēng)為蛋白質(zhì)工程，它不僅有助于理解酶和其他蛋白質(zhì)的作用機(jī)理，而且也有可能設(shè)計(jì)功能優(yōu)良的蛋白質(zhì)和藥物，導(dǎo)致醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)的重大進(jìn)展。而且，合成特定順序多肽的獲得，使蛋白質(zhì)化學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)和生物工藝學(xué)產(chǎn)生了同樣驚人的進(jìn)展。
許多遺傳工程項(xiàng)目需要使用大量不同確定順序的多核苷酸，有時(shí)在一次實(shí)驗(yàn)中需要幾百種不同的順序。同樣，某些蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)需要幾百種不同的肽順序。為了確定人類(lèi)基因組的核苷酸順序(這一項(xiàng)目將立即著手進(jìn)行，并涉及許多實(shí)驗(yàn)室)，將需要大約5千萬(wàn)不同的多核苷酸引物。近來(lái)的努力，連同許多能由私人實(shí)驗(yàn)室從事的其他很好的研究項(xiàng)目，就其目前的費(fèi)用而言，在經(jīng)濟(jì)上對(duì)合成多核苷酸的研究者是不現(xiàn)實(shí)的(每個(gè)核苷酸殘基為5-20美元)。
限定順序的多核苷酸化學(xué)合成的實(shí)現(xiàn)應(yīng)歸應(yīng)于五十年代Michelson和Todd的開(kāi)創(chuàng)性工作(Michelson，A.M.&Todd，SirA.R.，“NucleotidesPartⅩⅩⅩⅠⅠ.SynthesisofaDithymidineDinucleotideContaininga3′∶5′InternuclestideLinkage，”J.Chem.Soc.1955，pp.2632-2638)，他們研制出一種核苷酸內(nèi)部的5′-3′磷酸二酯鍵合的特種化學(xué)合成法。在以后的20年中，該法得到進(jìn)一步的發(fā)展，并以Khorana及其同事最終完全合成轉(zhuǎn)化RNA的基因而達(dá)到頂峰。(Khorana，H.G.，“TotalSynthesisofaGene，”Science，Vol.203，pp.614-625，(1979)。最近，磷酸二酯法已被磷酸三酯法(Letsinger，R.L.andOgilvie，K.K.，“AConvenientMethodforStepwiseSynthesisofOligothymidylateDerivativesinLarge-ScaleQuantities，”J.Am.Chem.Soc.，Vol.89，pp.4801-4803，(1967);Narong，S.A.，Brousseau，R.，Hsiung，H.M.andMichniewicz，J.J.，“ChemicalSynthesisofDeoxyoligonucleotidesbytheModifiedTriesterMethod，Method，Meth.Enzymol，Vol.65，pp.610-620，(1980))和亞磷酸三酯法(Letsinger，R.L.，F(xiàn)innan，J.L.，Heavener，G.A.andLunsford，W.B.，”P(pán)hosphiteCouplingProcedureforGeneratingInternucleotideLinks，“J.Am.Chem.Soc.，Vol.97，pp.3278-3279，(1975);Beaucage，S.L.andCaruthers，M.H.，”DeoxynucleotidePhosphoramidites-ANewClassofKeyIntermediatesForDeoxypolynucleotideSynthesis，”Tet.Lett.，Vol.22，pp.1859-1862，(1981)所取代，后二種方法的優(yōu)點(diǎn)是合成速度較快，副反應(yīng)較少。這二種方法均可按最初設(shè)計(jì)的方式，在溶液中進(jìn)行，但近來(lái)已修改成多核苷酸的固相合成[Matteucci，M.D.andCaruthers，M.H.，“SynthesisofDeoxyoligonucleotidesonaPolymerSupport，”J.Am.Chem.Soc.，Vol.103，pp.3185-3191，(1981);Sproat，B.S.andBannwarth，W.，“ImprovedSynthesisofOligodeoxynucleotidesOnControlledPoreGlassUsingPhosphotriesterChemistryandaFlowSystem，”Tet.Lett.，Vol.24，pp.5771-5774，(1983)]。在固相合成中，由于生長(zhǎng)中的鏈以共價(jià)鍵的形式結(jié)合到不溶性載體上，因而具有合成速度較快的優(yōu)點(diǎn)，而且在兩個(gè)化學(xué)步驟之間可洗去試劑，避免了在每次添加單體后對(duì)多核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行提純的需要。而且，固相合成可使過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，以致每次加入堿基(通過(guò)多級(jí)反應(yīng)循環(huán))可在室溫下進(jìn)行，時(shí)間約10分鐘。在這些條件下的高縮合效率(通常大于99%)可使之自動(dòng)合成鏈長(zhǎng)大于100的多聚脫氧核苷酸。
用于固相合成多肽的化學(xué)方法通常是基于Merrifield的原始實(shí)驗(yàn)記錄，后者曾被成功地用于合成具有酶活性的124-殘基核糖核酸酶A[Gutte，B.andMerrifield，R.B.，“TheSynthesisofRibonucleaseA，”J.Biol.Chem.，Vol.246，pp.1922-1941，(1971)]。這種方法系采用標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯-二乙烯基苯載體，叔丁氧基羰基(BoC)的氨基保護(hù)，以及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與對(duì)稱(chēng)的酐中間體的活化縮合。該法業(yè)已成功地用于自動(dòng)肽合成裝置，以及下述的Houghton多級(jí)同步合成法中。
業(yè)已設(shè)計(jì)了幾種其他的肽合成法。其中最佳的一種方法(Auffret，A.D.andMeade，L.G.，“AlternativeStrategiesinPeptideSynthesis，”SyntheticPeptidesinBiologyandMedicine，Alitalo，K.，Partanen，P.andVaheri，A.(Eds..)，ElsevierSciencePublishers，Amsterdam，1985)系使用聚酰胺-硅藻土復(fù)合載體(此種載體對(duì)于連續(xù)流動(dòng)合成顯現(xiàn)出優(yōu)良的性能)，基甲氧基羰基(Fmoc)的氨基保護(hù)，用活化1-羥基苯三氮唑(1-hydroxybenzatriazole)與五氟苯基酯(PFPE)中間體縮合。活性酯中間體的高度穩(wěn)定性使它們比之較不穩(wěn)定的酐中間體能更為方便地用于肽的合成。
JohnSmith[“AutomatedSolidPhaseOligodeoxyribonucleotideSynthesis”，AmericanBiotechnologyLaboratory，pp.15-24(December1983)]和MarrinCaruthers[“GeneSynthesisMachinesDNAChemistryandItsUses”，Science，Vol.230pp.281-85(1985)]的綜述性文章中概括了多核苷酸合成方法(包括對(duì)化學(xué)反應(yīng)的描述)的新進(jìn)展。一個(gè)最有希望的新進(jìn)展是有關(guān)從花費(fèi)不多的被保護(hù)的核苷就地產(chǎn)生氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)中間體的成本-效果分析法的研究[Barone，A.D.，Tang，J.-Y.andCaruthers，M.H.，“InSituActivationofBis-Dialkylaminophosphines-ANewMethodforSynthesizingDeoxyoligonucleotidesonPolymerSupports，”Nucl.AcidsRes.，Vol.12，pp.4051-4061，(1984);Nielsen，J.，Taagaard，M.，Marigg，J.E.，vanBoom，J.H.andDahl，O.，“Applicationof2-cyanoethylN，N，N′，N′-tetraisopropylphosphorodiamiditeforInSituPreparationofDeoxyribonucleosidePhosphoramiditesandTheirUseinPolymer-SupportedSynthesisofOligodeoxyribonucleotides，”Nucl.AcidsRes.，Vol.14，pp.7391-7403，(1986)]。
另一有利的新進(jìn)展體現(xiàn)在使用脒基來(lái)保護(hù)環(huán)外氨基(e.g.，Caruthers，M.H.，McBride，L.J.，Bracco，L.P.andDubendorff，J.W.，“StudiesonNucleotideChemistry15.SynthesisofOligodeoxynucleotidesUsingAmidineProtectedNucleosides，”NucleosidesandNucleotides，Vol.4，pp.95-105，(1985))。用脒保護(hù)的基團(tuán)能穩(wěn)定脫氧腺(嘌呤核)苷殘基，防止其發(fā)生酸催化的脫嘌呤反應(yīng)(這種脫嘌呤反應(yīng)發(fā)生在合成循環(huán)中的脫三苯甲基步驟)，由此可合成更長(zhǎng)的多核苷酸。
此外，最近有人報(bào)道了在二氧化硅載體上合成RNA聚合物的方法，該法涉及一種改進(jìn)的氨基亞磷酸酯方法[Kierzek，R.，Caruthers，M.H.，Longfellow，C.E.，Swinton，D.，Turner，D.H.andFreier，S.M.，“Polymer-SupportedRNASynthesisanditsApplicationtoTesttheNearest-NeighborModelforDuplexStability，”Biochemistry，Vol.25，pp.7840-7846，(1986)]。
雖然上述這些方法能以中等費(fèi)用同時(shí)合成一種或幾種核苷酸順序，但仍然極需在此領(lǐng)域進(jìn)行技術(shù)開(kāi)發(fā)，以降低合成費(fèi)用，并能同時(shí)合成大量多核苷酸順序。業(yè)已沿著這一目標(biāo)在方法和裝置方面取得了一些進(jìn)展，從而能多級(jí)同時(shí)合成多核苷酸或多肽。
Frank等人[“ANewGeneralApproachfortheSimultaneousChemicalSynthesisofLargeNumbersofOligonucleotidesSegmentedSolidSupports”，NucleicAcidResearch，Vol.11，No.13，pp.4365-77(1983)]最近用纖維素濾紙作為固相載體，進(jìn)行多核苷酸的合成。被保護(hù)的核苷通過(guò)3′-0-琥珀酸鍵合，以共價(jià)鍵的形式連接到濾紙的羥基上，然后借助于前面所用的磷酸三酯法，用疏松的粒狀固相載體材料使之延伸。在上述論文中，作者報(bào)道了兩種八聚物的合成，并提出下述方案將濾紙疊成四種不同的反應(yīng)柱，并指定將A、G、C和T殘基加到生長(zhǎng)的鏈中，在反應(yīng)循環(huán)之間選分圓盤(pán)，由此可同時(shí)合成大量不同的多核苷酸順序。作者證明，由該法合成得到的二種八聚物(在大多數(shù)循環(huán)期間存在于同一的反應(yīng)柱內(nèi))具有相當(dāng)?shù)氖章剩鳧NA順序分析表明，所得產(chǎn)物，包括預(yù)期的核苷順序，彼此并未發(fā)生相互沾染。
所推薦的用濾紙法來(lái)同時(shí)合成許多順序的方案后來(lái)由Matthes等人付之實(shí)現(xiàn)[“SimultaneousRapidChemicalSynthesisofOverOneHundredPolynucleotidesonaMicroscale”，TheEMBOJournal，Vol.3，No.4，pp.801-05(1984)]。這些作者采用磷酸三酯法(類(lèi)似于Frank等人所報(bào)道的方法)，在二周內(nèi)同時(shí)合成一百多種多核苷酸順序。但Matthes等人的方法存在一些局限性。由于濾紙圓盤(pán)的低負(fù)載容量，以及它們較差的質(zhì)量傳遞性能(導(dǎo)致試劑不是最佳地進(jìn)入生長(zhǎng)鏈中)，因而與標(biāo)準(zhǔn)固相合成法相比，該法各步的耦合效率偏低，僅僅產(chǎn)生非常少量具有有限鏈長(zhǎng)度(直至20個(gè)鏈節(jié)左右)的所需的多核苷酸。所得的產(chǎn)物嚴(yán)重地被較短的失效順序污染，在使用前必須用耗費(fèi)時(shí)間的方法提純。然而，這一方法顯現(xiàn)了以較低費(fèi)用產(chǎn)生大量順序的可能性。顯然，許多實(shí)驗(yàn)室已對(duì)該法進(jìn)行了嘗試，但看來(lái)只有很少的實(shí)驗(yàn)室已能用這一技術(shù)獲得有用的產(chǎn)物。
一份最新的報(bào)告[Bannwarth，W.andLaiza，P.，“ASystemfortheSimultaneousChemicalSynthesisofDifferentDNAFragmentsonSolidSupport，”DNA，Vol.5，pp.413-419，(1986)]中描述了一種能同時(shí)合成幾種不同多核苷酸的裝置。該裝置包括一系列可重疊和旋轉(zhuǎn)的金屬盤(pán)，每只盤(pán)在其徑向?qū)ΨQ(chēng)位置上具有單獨(dú)的一個(gè)反應(yīng)室，以及一些旁通狹孔。重疊的金屬盤(pán)可進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，以使所有的反應(yīng)室在垂直方向?qū)R，并由旁通孔使它們彼此相連，在這些反應(yīng)室中，需按指定要求將特定的核苷酸殘基加到置于其內(nèi)的，并與載體相結(jié)合的DNA鏈上。因此，通過(guò)在每一反應(yīng)循環(huán)后使金屬盤(pán)適當(dāng)旋轉(zhuǎn)(由試劑和溶劑通過(guò)系統(tǒng)順序流動(dòng)而產(chǎn)生)，在各重疊的金屬盤(pán)中合成了各不相同的DNA順序。與分段的濾紙方法相比，此種裝置的主要優(yōu)點(diǎn)是耦合率較高，這是通過(guò)在反應(yīng)室中放置可控微孔玻璃載體而實(shí)現(xiàn)的。利用氨基亞磷酸酯的化學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生了最長(zhǎng)達(dá)到36殘基的DNA鏈。裝置的另一優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。但其主要缺點(diǎn)在于同時(shí)合成的量較低(至多同時(shí)產(chǎn)生12個(gè)DNA片段)。
在另一個(gè)用于同時(shí)合成不同多肽的方法中[Houghten，“GeneralMethodfortheRapidSolid-PhaseSynthesisofLargeNumbersofPeptidesSpecificityofAntigen-AntibodyInteractionoftheLevelofIndividualAminoAcids”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.82，pp.5131-35(August1985)]，Houghten使用了裝有用于肽的標(biāo)準(zhǔn)固相合成的固相載體樹(shù)脂的聚丙烯網(wǎng)袋。將一些含有這些樹(shù)脂的袋放入一只單獨(dú)的帶攪拌的反應(yīng)室內(nèi)，欲加入給定氨基酸的所有肽順序即能同時(shí)進(jìn)行耦合反應(yīng)。作者使用這一方法同時(shí)合成了不同的13鏈節(jié)的鏈共248種，其收率與標(biāo)準(zhǔn)單肽固相法不相上下。在這一研究工作中，各13鏈節(jié)的肽，除了單個(gè)氨基酸替換外，實(shí)際上都包含一個(gè)與“對(duì)照順序”相同的順序。因此，在加入每一種氨基酸時(shí)，把絕大多數(shù)含有樹(shù)脂的袋放入同一只帶攪拌的反應(yīng)容器中，而僅有那些含有肽(一個(gè)獨(dú)特的氨基酸將在順序中的這一位置加到此肽中)的樹(shù)脂是與大部分物料分開(kāi)反應(yīng)的。雖然在Houghten的原來(lái)工作中合成得到的“不同”肽順序分別由相同的順序組成，僅有單個(gè)氨基酸與“對(duì)照順序”不同，他提出使用許多只帶有攪拌的反應(yīng)容器，而每一只容器裝有許多盛有樹(shù)脂的袋，此種方法能用于同時(shí)合成大量完全獨(dú)特的肽順序。Houghten的“茶葉袋”方法，包括其用于同時(shí)合成120種完全不同的15鏈節(jié)肽的說(shuō)明，在最近的一篇文章中作了進(jìn)一步描述[Houghtenetal，“SimultaneousMultiplePeptideSynthesisTheRapidPreparationofLargeNumbersofDiscretePeptidesforBiologicalImmunological，andMethodologicalStudies，”Biotechnigues，Vol.4，No.6，pp.525-28(1986)]。
Houghten的“茶葉袋”方法尚有二個(gè)困難，以致可能使其難以實(shí)現(xiàn)大量核苷酸順序的同時(shí)合成?？擅芊獾木郾┚W(wǎng)袋對(duì)于目前用于多核苷酸合成的磷酸三酯法和亞磷酸三酯法的應(yīng)用尚不具備足夠的化學(xué)惰性性質(zhì)。由惰性材料(如聚四氟乙烯)構(gòu)成的含有載體的多孔袋，如果不能加以密封，則難于防止合成過(guò)程中袋中固相載體的漏失。更為嚴(yán)重的問(wèn)題是，在多核苷酸合成的固相方法中，必須在柱的載體層上面留有足夠的空間，這樣從下面泵入溶劑和試劑時(shí)，載體就被向上的流動(dòng)“托起”，產(chǎn)生幾乎是定量的化學(xué)反應(yīng)所需的顆粒內(nèi)必需的質(zhì)量傳遞。但非剛性“茶葉袋”的物理性質(zhì)決定了在溶劑和試劑通過(guò)柱的過(guò)程中，載體材料不能實(shí)現(xiàn)這種必需的“托起”。
因此，鑒于目前這些裝置和方法的不足之處，人們需要一種能快速地同時(shí)合成具有不同順序的大量任意種類(lèi)的生物聚合物，而且收率高，費(fèi)用低。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于生物聚合化學(xué)合成的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用來(lái)同時(shí)合成大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于以很低的成本同時(shí)生產(chǎn)大量限定順序的生物聚合物。
本發(fā)明的第4個(gè)目的是提供一種適用于同時(shí)固相合成任何種類(lèi)生物聚合物的裝置。
本發(fā)明的第5個(gè)目的系在高收率下同時(shí)生產(chǎn)大量限定順序的生物聚合物。
本發(fā)明的第6個(gè)目的是提供一種用于能同時(shí)生產(chǎn)生物聚合物的改進(jìn)型分段裝置。
本發(fā)明的第7個(gè)目的是提供一種在較低的試劑和溶劑的需求量下，同時(shí)生產(chǎn)大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的第8個(gè)目的是提供一種在較短的合成時(shí)間內(nèi)同時(shí)生產(chǎn)大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的第9個(gè)目的是提供一種同時(shí)生產(chǎn)大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置，其中許多節(jié)段[以下稱(chēng)為“片段”(Wafer)]在每次反應(yīng)循環(huán)后彼此易于分離。
本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種用于生物聚合物化學(xué)合成的改進(jìn)型固相載體節(jié)段(或稱(chēng)片段)。
因此，為達(dá)到上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明人提供了一種分段的片段合成裝置，用于合成多種限定順序的生物聚合物，該裝置包括(1)溶劑輸送系統(tǒng);
(2)至少一個(gè)柱，它與溶劑輸送系統(tǒng)相連，以供溶劑和試劑流動(dòng)通過(guò)該柱;以及
(3)在柱內(nèi)至少有一個(gè)片段，在其上發(fā)生聚合反應(yīng)。
在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，合成裝置至少包括4個(gè)用以接受4種試劑的柱;以及位于各柱內(nèi)的許多片段，其中每一個(gè)片段用以合成一種限定順序的聚合物。根據(jù)用戶(hù)的需要，裝置可設(shè)計(jì)成自動(dòng)、半自動(dòng)或手動(dòng)形式。
在另一實(shí)施例中，該裝置包括許多重疊的片段，這些疊片連結(jié)在一起構(gòu)成一個(gè)柱，同時(shí)溶劑輸送系統(tǒng)與該柱相連接，以提供流體通過(guò)柱的流動(dòng)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明人提供了一種用于合成多核苷酸、多肽和多糖之類(lèi)生物多聚物的片段，它包括(1)固相載體材料;
(2)持留環(huán)，用以將載體材料保持在由該環(huán)內(nèi)壁所形成的腔室內(nèi);
(3)薄膜或燒結(jié)(frlt)之類(lèi)的部件，其作用是使流體能流經(jīng)持留環(huán)并進(jìn)入載體材料，并防止載體材料從持留環(huán)中沖出。持留環(huán)最好包括一個(gè)密封反應(yīng)內(nèi)室，以容納和持留環(huán)載體材料，持留環(huán)的二端開(kāi)口。上述多孔流動(dòng)件是基本上呈惰性的多孔材料，最好設(shè)置在持留環(huán)的每一端，并橫越內(nèi)室，將其密封。另外，片段最好還包括一個(gè)惰性固定件，用以使載體材料固定在持留部件上。
固相載體材料宜選自由下列物質(zhì)所組成的這一組中的任一種，這些物質(zhì)是二氧化硅、可控微孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚酰胺樹(shù)脂、聚酰胺-硅藻土復(fù)合樹(shù)脂、大網(wǎng)絡(luò)樹(shù)脂、二苯甲基胺樹(shù)脂，以及諸如MONOBEADS樹(shù)脂(Pharmacia出品)之類(lèi)的大孔塑料樹(shù)脂。多孔載體材料包括一個(gè)含有以共價(jià)鍵形式連結(jié)的殘基(例如，在多核苷酸合成的情況下是核苷)的衍生物質(zhì)。
多孔膜或燒結(jié)塊最好包括由聚四氟乙烯或其他惰性的碳氟化合物所制成的撓性膜，或由玻璃、不銹鋼或鈦制成的剛性燒結(jié)塊。薄膜或燒結(jié)塊孔隙大小應(yīng)合適，既能容許流體通過(guò)片段，又能使多孔載體材料持留在片段上。
在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，所說(shuō)的片段包括(1)一種固相載體材料;
(2)一個(gè)內(nèi)持留環(huán)(內(nèi)環(huán))，它包括一個(gè)由環(huán)的內(nèi)壁所形成的內(nèi)反應(yīng)室，用以容納和持留載體材料，持留環(huán)的兩端開(kāi)開(kāi);
(3)一種惰性的多孔薄膜或燒結(jié)塊，它位于并橫越持留環(huán)的各開(kāi)口端，膜的直徑較之內(nèi)環(huán)大;以及(4)二個(gè)外環(huán)，其內(nèi)徑稍大于內(nèi)環(huán)，并圍繞著內(nèi)環(huán)，將膜的邊固定在內(nèi)、外環(huán)之間。最佳的外固定件系包括被設(shè)置在環(huán)繞持留環(huán)的每一端外表面的固定環(huán)。
在另一個(gè)較佳實(shí)施例中，所說(shuō)的片段包括(1)一種固相載體材料，(2)一個(gè)惰性的圓筒形持留環(huán)，兩端開(kāi)口;以及(3)一個(gè)惰性的環(huán)形燒結(jié)塊，它嵌入靠近持留環(huán)開(kāi)口處的凹槽內(nèi)。
本發(fā)明的片段結(jié)構(gòu)可供同時(shí)生產(chǎn)多種生物多聚物。載體材料的幾何形狀可導(dǎo)致高的偶合效率，則性片段在每次反應(yīng)循環(huán)后易于分選。這種結(jié)構(gòu)方式可同時(shí)合成許多不同的順序。通過(guò)使用不同容量(衍生密度)的載體材料，并改變各片段的高度，可使合成規(guī)模從每個(gè)節(jié)段小于0.1微摩爾至大于10微摩爾。而且，可將不同高度的節(jié)段重疊在各個(gè)柱內(nèi)，使之能同時(shí)合成規(guī)模相差懸殊的產(chǎn)物。這種方法的靈活性和效率應(yīng)能達(dá)到在費(fèi)用大為降低的情況下可合成大量的生物聚合物。例如在理想條件下(如有(機(jī)構(gòu))內(nèi)部合成設(shè)施時(shí))，目前的多核苷酸合成費(fèi)用以每個(gè)殘基計(jì)，一般為10至15美元。而分段的片段(以下簡(jiǎn)稱(chēng)分片段)裝置的相應(yīng)價(jià)格大為減低，可能低至0.50至2.00美元(以每個(gè)殘基計(jì))。由于目前價(jià)格仍然是應(yīng)用合成生物多聚物的限制因素，分片段裝置的開(kāi)發(fā)是生物聚合物在科學(xué)研究中應(yīng)用的另一定量飛躍，應(yīng)當(dāng)加快今后生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。
以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施例進(jìn)行描述，借此可清楚地顯現(xiàn)出本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，以下是附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明。
參照附圖

圖1是本發(fā)明之片段的一個(gè)實(shí)施例的分解透視圖;
圖2是本發(fā)明之片段的一個(gè)實(shí)施例的其組裝狀態(tài)時(shí)的剖面圖;
圖3是本發(fā)明之片段的一個(gè)實(shí)施例在其組裝狀態(tài)時(shí)的透視圖;
圖4是按照本發(fā)明設(shè)計(jì)的分片斷合成裝置的柱組裝件的示意圖;
圖5是按照本發(fā)明設(shè)計(jì)的分片斷合成裝置的示意圖;
圖6至圖8是本發(fā)明所產(chǎn)生的DNA的紫外光陰影顯像照片;
圖9為本發(fā)明的一個(gè)流程圖。
圖中全部數(shù)字標(biāo)記均前后一致，因此不同圖內(nèi)的相同部分具有同一的編號(hào)。。
首先參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。在以下所揭示的各個(gè)部分，均就多核苷酸的合成而言，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行討論。正如已指出的那樣，本發(fā)明同樣適用于生產(chǎn)可在固相載體上合成的任何生物聚合物。而且，以下的討論和附圖主要系描述和說(shuō)明一個(gè)具體的片段結(jié)構(gòu)。應(yīng)該明白，這一描述僅用于說(shuō)明而已，其他的片段結(jié)構(gòu)也可符合要求的。并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
圖1表示裝配前的本發(fā)明之片段10的結(jié)構(gòu)，亦即是其分解示意圖。該片段包含一個(gè)外固定件，后者又包括上、下固定環(huán)12和14。內(nèi)持留環(huán)16位于二個(gè)相對(duì)的固定環(huán)12和14之間，它與薄膜18和20一起構(gòu)成反應(yīng)室。該片段還包括多孔材料或膜18和20，它們各設(shè)置在持留環(huán)16的一端，橫過(guò)端口，并被固定在持留環(huán)16與固定環(huán)12和14之間。
持留環(huán)16的外徑略小于固定環(huán)12和14的內(nèi)徑。而多孔薄膜18和20的外徑大于持留環(huán)的外徑。
應(yīng)當(dāng)指出，此外所用的有關(guān)內(nèi)持留環(huán)和固定環(huán)的環(huán)、其結(jié)構(gòu)可包括圓形、長(zhǎng)方形、正方形、以及其他幾何變體。重要的設(shè)計(jì)準(zhǔn)則在于，這些環(huán)應(yīng)具有一個(gè)空心的內(nèi)部空間，以便持留反應(yīng)物組分(參見(jiàn)下文)。
片段10的組裝狀態(tài)示下圖2和圖3。在其組裝時(shí)，先將多孔膜20置于下固定環(huán)14上，并使膜的邊沿著環(huán)的整個(gè)外周邊伸出環(huán)外。然后將持留環(huán)16置于下膜20上，并推入至下固定環(huán)14內(nèi)。環(huán)12、14和16的直徑系根據(jù)膜的大小而選定，以在環(huán)之間形成流體緊密封。將固相載體材料放入持留環(huán)后，將薄膜18放于環(huán)16上，并將環(huán)12推入就位，再使上膜18、固定環(huán)12和持留環(huán)16按上述同樣方式進(jìn)行密封。除了形成流體緊密封外，這種結(jié)構(gòu)有助于在化學(xué)反應(yīng)期間將膜牢固地保持在合適的位置上。通過(guò)使膜的邊緣搭接在持留環(huán)6上，并使薄膜緊固在固定環(huán)12和14與持留環(huán)之間，即可達(dá)到上述目的。
如圖2和圖3所示，組裝后的片段10中，薄膜18和20跨越并伸出內(nèi)持留環(huán)16的邊緣，而膜的邊固定在外固定環(huán)12和14與內(nèi)持留環(huán)16之間。
組裝的片段裝有反應(yīng)物組分22。該反應(yīng)物組分是固相載體，系由殘基(例如核苷)經(jīng)由有機(jī)間隔臂，以共價(jià)鍵的形式結(jié)合到固相載體中而制得。聚合物的生長(zhǎng)系從殘基或初級(jí)堿基開(kāi)始，這樣就與載體材料表面分開(kāi)。在用薄膜18和固環(huán)12將片段密封前，將反應(yīng)物組分22放入內(nèi)持留環(huán)16中。由此，持留環(huán)16與薄膜18和20一起形成反應(yīng)物組分22的反應(yīng)室。
如前面所指出的，上述揭示是針對(duì)一種具體的片段結(jié)構(gòu)。應(yīng)當(dāng)著重指出，許多片段結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)是可行的，并在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，此種片段可以包括嵌接(snape)或螺紋連結(jié)的結(jié)構(gòu)。具體地說(shuō)，片段10的另一種實(shí)施例可包括剛性的多孔燒結(jié)塊，后者嵌入套環(huán)上、下邊緣附近內(nèi)表面的凹槽內(nèi)。
片段是一種剛性的化學(xué)惰性室，因而不會(huì)干擾生物聚合物的合成，亦不會(huì)與合成所用的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)。外固定環(huán)和內(nèi)持留環(huán)可由諸如聚四-氟乙烯和其他氟碳化物(例如KEVLAR和KALREZ)之類(lèi)的各種惰性材料制成。
片段的尺寸可在很大的范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于毫克量級(jí)多核苷酸的合成，內(nèi)持留環(huán)的內(nèi)徑宜在約2-10毫米的范圍內(nèi)，高度宜為2-10毫米左右。而對(duì)于合成克量級(jí)的產(chǎn)物，則內(nèi)徑和高度最好分別為20-100毫米左右。而且，可以增高由重疊的片段所組成的柱，以便同時(shí)合成大量不同的多核苷酸鏈。顯然該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，根據(jù)具體合成反應(yīng)的特性，可使片段較之上述的尺寸大或小些。而且，該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，柱尺寸的改變?nèi)Q于欲被合成的生物聚合物及所用的固相載體。在肽類(lèi)的生產(chǎn)中，片段的尺寸一般趨向于上述范圍的上限。
可使試劑流過(guò)片段的多孔材料也由化學(xué)惰性的材料制成。例如，推薦的惰性材料包括聚四氟乙烯和其他氟碳化物材料，如KEVLAR、熔接或燒結(jié)玻璃、鈦和不銹鋼燒結(jié)物?？讖娇梢宰儎?dòng)，其選定原則是應(yīng)能使足夠流量的試劑和洗滌液通過(guò)片段，同時(shí)又能將載體材料和正在生長(zhǎng)著的生物聚合物鏈保持在片段內(nèi)。若與CPG載體(直徑一般為120-180微米)一起使用時(shí)，建議孔徑為50-100微米。多孔材料可設(shè)計(jì)成不同的結(jié)構(gòu)，只要能達(dá)到必需的流量和保留作用。正如本文所列舉和描述的，多孔材料可以制成撓性膜、剛性燒結(jié)結(jié)構(gòu)等形狀。
固相載體是生物聚合物鏈形成之處，它們可選自各種已知的載體。推薦用于多核苷酸合成的載體包括聚苯乙烯-二乙烯基苯(DVB)、聚酰胺-硅藻土、二氧化硅、可控微孔玻璃(CPG)、以及MONOBEADS(一種由Pharmacia生產(chǎn)的樹(shù)脂)之類(lèi)的塑料樹(shù)脂。由于CPG、二氧化硅和MONOBEADS呈剛性，亦即它們不會(huì)膨脹或收縮，因而是最佳的固相載體。推薦用于多肽類(lèi)合成的載體包括聚苯乙烯和乙烯基苯樹(shù)脂、聚酰胺-硅藻土樹(shù)脂、二苯甲基胺樹(shù)脂、以及大網(wǎng)絡(luò)樹(shù)脂。
大孔徑(例如200-2000埃)的載體材料可使試劑易于達(dá)到生長(zhǎng)的鏈，并能有效地洗去反應(yīng)物。而且，這類(lèi)載體有助于聯(lián)成較長(zhǎng)的鏈(例如50-200個(gè)殘基)，在聚合物之間不存在位阻現(xiàn)象。
裝入片段的載體材料22的量可以變動(dòng)。在確定所加載體材料的量時(shí)，欲考慮的因素包括所需的DNA、RNA、多肽、多糖或其他的生物聚合物，以及流量和固相載體的衍生程度(例如每克載體中單體殘基的微摩爾數(shù))。在片段達(dá)到滿(mǎn)載的2/3至3/4時(shí)，可獲得良好的效果，因這一負(fù)載量已將混合和任何可能的膨脹因素估計(jì)在內(nèi)。使用孔徑非常大的剛性固相載體，例如孔徑為3000-4000埃的二氧化硅可使載體內(nèi)發(fā)生良好的質(zhì)量傳遞，因而片段能完全充滿(mǎn)衍生載體。
參見(jiàn)圖4，片段組裝后，立即將其放入柱24內(nèi)，試劑和洗滌溶劑通過(guò)柱流動(dòng)，形成一個(gè)反應(yīng)循環(huán)。柱24被設(shè)計(jì)成可容納許多的片段10。如圖4和圖5所示，輸送系統(tǒng)20可利用諸如氬氣壓力之類(lèi)的動(dòng)力，使試劑和洗滌液通過(guò)柱24和片段10。流體最好自下而上通過(guò)柱，使確定片段中的多孔載體材料混合和分布，借此有利于反應(yīng)的進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，輸送系統(tǒng)至少與4個(gè)平行的柱相連接，這四個(gè)柱對(duì)應(yīng)于下述4種堿基，即胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和腺嘌呤(A)。若在合成中還使用改性的堿基堿基混合物，則可設(shè)置更多的柱。在每一柱內(nèi)可放入任意數(shù)量的片段，這取決于所需產(chǎn)生的生物聚合物的順序數(shù)量。例如亦可在柱內(nèi)只放一個(gè)片段。然而，通常這樣做是昂貴的，且效率低，正如前面已指出的，目前已有的一些設(shè)計(jì)則存在此種問(wèn)題。通常，每一柱內(nèi)的片段數(shù)可在15-25左右。但是也可使用較之更多或更少數(shù)量的片段。當(dāng)然，所述的片段數(shù)必須能使足夠的流量的片。當(dāng)然，所選的片段數(shù)必須能使足夠的流量通過(guò)柱子。就這點(diǎn)而言，所選的片段外徑應(yīng)能使之與柱的內(nèi)表面緊貼地吻合，迫使流體流過(guò)片段本體，而不是沿著柱的則壁流動(dòng)。若需更大的流量，則可使用不同的溶劑輸送系統(tǒng)。此外，片段數(shù)顯然是隨著不同的柱高度而改變。
柱24可由任何惰性材料制成，例如玻璃和不銹鋼是兩種較佳的材料。通常，柱包括一個(gè)柱活塞28，以便柱內(nèi)可裝入不同數(shù)量和高度的片段。
在另一個(gè)實(shí)施例中，片段可嵌合在一起，進(jìn)而由其自身形成一個(gè)分段的片段柱，不需要一個(gè)單獨(dú)的支承柱。在該實(shí)施例中，輸送系統(tǒng)26直接與分段的片段柱相連接。
如前指出，對(duì)于這類(lèi)合成，需設(shè)置一系列含有片段的柱。每一個(gè)柱配備一種試劑，以便添加殘基。例如，在合成DNA時(shí)，四個(gè)柱將分別加入胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鳥(niǎo)嘌呤(G)和腺嘌呤(A)。同樣在RNA合成時(shí)，可用添加尿嘧啶(U)所必需的試劑來(lái)代替胸腺嘧啶。然而正如前面指出的，所用柱的數(shù)目對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不重要。單個(gè)柱將足以滿(mǎn)足要求，但這將增加完成生物聚合物合成所需的時(shí)間。對(duì)于每一種合成都必須改變?cè)噭?，在一個(gè)柱內(nèi)所能合成的樣品數(shù)較之4個(gè)柱為少。因些，使用多級(jí)柱有助于進(jìn)行多種反應(yīng)，并可提高工藝的效率。另一種方法涉及添加二聚物、三聚物等。在這一合成中，增添了另外的柱。例如，對(duì)于二聚物，將需使用20個(gè)柱，亦即，每一種可被添加的二聚物對(duì)應(yīng)于一個(gè)柱;而每一種單獨(dú)的欲被添加的核苷堿基則又對(duì)應(yīng)于一個(gè)柱。
再回到DNA方法中，根據(jù)所需加入的第一個(gè)堿基，將片段選擇性地設(shè)置在T、G、C或A柱中和某一柱內(nèi)。在通過(guò)適當(dāng)量的試劑和化學(xué)物，而將上述的堿基加到多核苷酸鏈中后(構(gòu)成一個(gè)反應(yīng)循環(huán))，從柱中取出片段，并進(jìn)行分選，以供下一步的合成，然后將其插入相應(yīng)的柱內(nèi)，重復(fù)合成步驟。重復(fù)這一操作，直至合成所需的多核苷酸順序。因此，在使用不同的柱添加堿基時(shí)，每個(gè)片段經(jīng)歷了其單獨(dú)的合成模式。采用這種方法可同時(shí)合成許多不同的多核苷酸。
通過(guò)固相合成，本發(fā)明可用來(lái)生產(chǎn)任何生物聚合物。倘若這些方法采用本發(fā)明中所用的徑流設(shè)計(jì)，則最佳的合成包括用固相方法合成多核苷酸、多肽類(lèi)和多糖類(lèi)。對(duì)于采用本發(fā)明合成肽的最佳固相方法是前述的Fmoc五氟苯基酯法，使用聚酰胺-硅藻土作為載體。
該法適合用人工操作、半自動(dòng)或全自動(dòng)方法來(lái)同時(shí)合成多種限定順序的生物聚合物。例如可使用由微機(jī)控制的半自動(dòng)設(shè)備。程序編制容許運(yùn)行人員控制所有試劑向固相載體的輸送。計(jì)算機(jī)也可在每一步向操作人員提供分選片段，并將它們放入正確柱內(nèi)的指令。而在半自動(dòng)系統(tǒng)中，后面這些任務(wù)則由運(yùn)行人員完成。當(dāng)然，該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的熟練人員明白，全自動(dòng)系統(tǒng)是較佳的系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，分選片斷，以及其后將它們放入下一個(gè)柱內(nèi)的操作均由機(jī)器完成。
分段的片段裝置是專(zhuān)用于能由固相、徑流方法完成的生物聚合物的合成。固相化學(xué)在合成生物聚合物中的優(yōu)點(diǎn)如下由于在每一步縮聚后，產(chǎn)物不必再進(jìn)行提純，因而使逐步添加而形成聚合物的操作大為方便。反應(yīng)物和試劑可方便地洗去。這種固相合成法業(yè)已開(kāi)發(fā)，使之能適用于生物聚合物合成中所用的一些不同的化學(xué)過(guò)程。分段的片段能用于所有這些方法中。
在合成多核苷酸時(shí)，固相合成的每一步反應(yīng)效率經(jīng)測(cè)定約為95%至大于99%的范圍內(nèi)，每添加一次核苷的循環(huán)時(shí)間約為5-30分鐘。當(dāng)所需產(chǎn)物的量在毫克范圍內(nèi)時(shí)(對(duì)大多數(shù)應(yīng)用來(lái)說(shuō)均已足夠)，這一方法是較佳的。另外，對(duì)于合成混合探測(cè)用多核苷酸，而其中殘基混合物存在于順序中某些位置時(shí)，則固相合成的方法極佳。
固相合成的氨基亞磷酸酯法(參見(jiàn)圖9)最好與本發(fā)明一起使用。
該法的活化中間體是5′-DMT-2′-脫氧核苷-3′-氨基亞磷酸酯。隨著第1個(gè)核苷的3′-羥基經(jīng)由烷基長(zhǎng)鏈間隔臂，以共價(jià)鍵的形式結(jié)合到固相載體上，即開(kāi)始這一方法。
經(jīng)由稀二氯乙酸處理，從結(jié)合在載體上的核苷的5′-OH中切去酸一穩(wěn)定的二甲氧基三苯甲基(DMTr)。在無(wú)水條件下，用四唑使核苷氨基亞磷酸酯(NucleosidePhosphoramidites)(較之結(jié)合在載體上的核苷5′-OH過(guò)量10-20倍摩爾)的氮原子質(zhì)子化，從而使其活化，并如第二步所示，發(fā)生縮合反應(yīng)。在完成相繼的各步耦合后，用碘在四氫呋喃和水中的溶液將活性亞磷酸酯轉(zhuǎn)化成較穩(wěn)定的磷酸酯(第4步)。根據(jù)需要，下一步可進(jìn)行封端反應(yīng)(使用乙酸酐二甲基氨基吡啶/二甲基吡啶，第5步)，使前述耦合反應(yīng)中未與活化氨基亞磷酸酯反應(yīng)的5′-羥基基團(tuán)乙?；?，以防止“截頭”和“無(wú)義”和(混亂)順序擴(kuò)散。
在每一合成循環(huán)結(jié)束時(shí)，A、C和G和環(huán)外胺基仍然處于酰胺保護(hù)狀態(tài)，間核苷酸磷酸酯基團(tuán)處于甲基酯化狀態(tài)，而生長(zhǎng)鏈中的3′-OH端仍然是丁二酸與載體鍵合的狀態(tài)。在加入下一個(gè)殘基前，重復(fù)脫三苯甲基步驟。亮橙色的DMTr陽(yáng)離子可通過(guò)分光光度法進(jìn)行測(cè)定，以計(jì)算耦合效率。利用分段的片段法，耦合效率約可達(dá)95%-99%。
在合成結(jié)束時(shí)，磷酸鹽化甲基(phosphatemethyl)保護(hù)基被苯硫氧化物離子切開(kāi)，后者系在三乙胺(第6步)存在下，由苯硫酚生成。若在合成中使用2-氰基乙基氨基亞磷酸酯，則不需要這一步。然后用氨水處理(第7步和第8步)，將對(duì)堿不穩(wěn)定性的?；?保護(hù)A、G和C中的環(huán)外氨基)和與固相載體相結(jié)合的共價(jià)鍵切開(kāi)。若DMTr基仍然存在，則用濃乙酸將該基團(tuán)切開(kāi)(第9步)。
如前如述，另一種方法(磷酸三酯法)常用于多核苷酸的合成。雖然磷酸三酯法可適用于本發(fā)明，但由于它需要較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，并嚴(yán)格要求無(wú)水條件(這在分選片段時(shí)是難以達(dá)到的)，因而甚為遜色。
前面提到的在固相多核苷酸合成中的新進(jìn)展，包括在原處氨基亞磷酸酯的產(chǎn)生，脒保護(hù)基和核聚合物的合成，均可用于本發(fā)明。而且，將本發(fā)明應(yīng)用于今后生物聚合物合成化學(xué)的發(fā)展，包括對(duì)縮合、保護(hù)反應(yīng)和去保護(hù)反應(yīng)或固相載體的改進(jìn)，這對(duì)該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將是顯而易見(jiàn)的。
使用市場(chǎng)上可買(mǎi)到的系統(tǒng)，可使上述合成方法在分段的片段合成生物聚合物中的應(yīng)用自動(dòng)化。例如一種具有4個(gè)柱和Cruachen型PS200合成器的自動(dòng)機(jī)可由IBMPC兼容微機(jī)控制。程序編制可使操作人員控制所有試劑向固相載體的輸送。這對(duì)于改進(jìn)欲用于分段片段法的反應(yīng)循環(huán)是需要的。而且，通過(guò)計(jì)算機(jī)記錄片段插入柱的順序，將有助于分選過(guò)程。在合成期間，計(jì)算機(jī)程序被用于指導(dǎo)各片段放入合適柱內(nèi)的操作。因此，計(jì)算機(jī)的打印輸出表明，在每次反應(yīng)循環(huán)后，哪些片段(由數(shù)字標(biāo)記)需放入所指定的柱內(nèi)，所以片段易于分選，而分離的片段被放入用以產(chǎn)生合適的合成反應(yīng)順序的柱內(nèi)。計(jì)算機(jī)程序的應(yīng)用減少了差錯(cuò)，并使合成的可靠性得以提高。另外，亦由計(jì)算機(jī)控制的，并與現(xiàn)有合成裝置相連接的自動(dòng)分選機(jī)的開(kāi)發(fā)，使之可能用分段片段裝置完全自動(dòng)合成生物聚合物。
以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1本實(shí)施例描述了一般用于在化學(xué)惰性的多孔片段內(nèi)分段合成多核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法。該法的具體運(yùn)用細(xì)節(jié)在給出的以下的實(shí)施例中。
A.交互式合成準(zhǔn)備程序的操作在IBM兼容計(jì)算機(jī)上，用數(shù)字處理程序輸入欲被合成的DNA順序(5′→3′方向)。順序文件被存儲(chǔ)在非資料性文件中，并以此格式命名。一俟順序輸入后，片段-DNA準(zhǔn)備程序(用Basic編寫(xiě))按磁盤(pán)機(jī)中的順序文件運(yùn)行。片段-DNA程序檢查順序文件，并產(chǎn)生一個(gè)包括下述信息的硬拷貝(1)包括所有輸入順序，并連同賦于各順序的識(shí)別號(hào)碼和名稱(chēng)一覽表;
(2)欲裝載各類(lèi)衍生CPG載體的編號(hào)片段一覽表(定義每一順序中的3′-末端堿基);和(3)用于指導(dǎo)每次反應(yīng)循環(huán)后分選片段的示意圖。
B.試劑制備、片段組件和Cruachem型PS200DNA合成裝置的布置。
使用配有CruachemDNA合成裝置的軟件，已產(chǎn)生一個(gè)稱(chēng)為“片段-CE20”的方法。該法描述如下方法片段-Ce20貯存器1乙腈貯存器2DMAP/四氫呋喃貯存器3乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶貯存器4碘/四氫呋喃/二甲基吡啶/水貯存器5乙腈貯存器6DCA/DCE
方法片段-CE20第一次循環(huán)第1步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝2.15分第2步解封DCA/DCE堿(可變)A持續(xù)時(shí)間＝1.30分G持續(xù)時(shí)間＝1.30分C持續(xù)時(shí)間＝2.30分T持續(xù)時(shí)間＝2.30分嘌呤(A/G)持續(xù)時(shí)間＝2.30分嘧啶(T/C)持續(xù)時(shí)間＝2.30分N(A/C/G/T)持續(xù)時(shí)間＝2.30分第3步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分正常循環(huán)第1步反應(yīng)(固定)持續(xù)時(shí)間＝4.30分第2步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分第3步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間-0.12分第4步DMAP/THF洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝0.12分第5步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝0.12分第6步DMAP/THF洗滌(固定)
持續(xù)時(shí)間＝0.12分第7步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝0.12分第8步DMAP/THF洗滌(固定)第9步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝0.12分第10步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝0.12分第11步封端/功能化(functionalie)(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分第12步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分第13步碘/THF/二甲基吡啶/水洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝2.00分第14步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分第15步封端/功能化(固定)持續(xù)時(shí)間＝60.00分第16步解決DCA/DCE基變量A持續(xù)時(shí)間＝1.30分G持續(xù)時(shí)間＝1.30分C持續(xù)時(shí)間＝2.30分T持續(xù)時(shí)間＝2.30分嘌呤(A/G)持續(xù)時(shí)間＝1.30分嘧啶(T/C)持續(xù)時(shí)間＝2.30分N(A/C/G/T)持續(xù)時(shí)間＝2.30分第17步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分最終循環(huán)第1步反應(yīng)(固定)持續(xù)時(shí)間＝4.00分第2步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝1.30分第3步碘/THF/二甲基吡啶/水洗滌(固定)持續(xù)時(shí)間＝2.00分第4步乙腈固定，洗滌持續(xù)時(shí)間＝4.00分開(kāi)始合成前，必須先裝配片段。對(duì)于每個(gè)片段，應(yīng)先裝配片段底部，這樣就可通過(guò)頂部加入衍生的可控微孔玻璃(CPG)載體材料。如片段-DNA準(zhǔn)備程序的打印輸出所示，約加入了18毫克合適的CPG。最后，在反應(yīng)室上放置另一塊多孔聚四氟乙烯布，并用另一個(gè)聚四氟乙烯固定環(huán)將其緊固。然后如片段-DNA準(zhǔn)備程序的打印輸出中第2步所示，將片段裝入合適的柱內(nèi)。
運(yùn)行所需的合成裝置準(zhǔn)備如下使用配有Gruachem合成裝置的運(yùn)行程序，使貯存器充滿(mǎn)各自的試劑，并對(duì)溶劑管路進(jìn)行沖洗。最后配制的試劑是氨基亞磷酸酯和升華的四唑。下表描述了用分段法合成多核苷酸時(shí)所用的試劑。
正常循環(huán)片段-CE20方法對(duì)于每一個(gè)具有10個(gè)片段的柱的溶劑/試劑1.乙腈-12.5毫升(設(shè)有溶劑發(fā)送臺(tái)，使用11臺(tái)貯存槽);
2.65%(單位容積中重量百分比，以下用W/V表示)的二甲基氨基吡啶的四氫呋喃溶液-1.2毫升;
3.乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶-1.6毫升4.碘(0.1M，用水/二甲基吡啶/四氫呋喃(1∶10∶4)配制)-4毫升5.3%(w/v)的二氯乙酸/二氯乙烷，4毫升溶劑流量2毫升/分平均循環(huán)時(shí)間18分鐘合成規(guī)模0.5-1微摩爾/片段載體核苷-CPG，一般為15-20毫克/片段單體溶液0.1MCE氨基亞磷酸酯6.67毫升乙腈/0.5克T-氨基亞磷酸酯6.00毫升乙腈/0.5克G-氨基亞磷酸酯5.80毫升乙腈/0.5克A-氨基亞磷酸酯6.00毫升乙腈/0.5克C-氨基亞磷酸酯催化劑-0.5M四唑(20毫升乙腈/0.7克四唑)將0.5毫升單體和0.5毫升催化劑混合后注入柱內(nèi)。
C.多核苷酸的合成使用PS200CruachemDNA合成裝置及常駐操作軟件，片段-CE20法，以及圖5中所描述的分段片段合成裝置，并應(yīng)用前述的2-氰基乙基氨基亞磷酸酯化學(xué)過(guò)程，進(jìn)行多核苷酸的分段合成。使裝有片段的柱與合成裝置連接后，僅包括脫三苯甲基和洗滌的第一次循環(huán)按該法所指明的步驟(“第一次循環(huán)”，步驟1至3)進(jìn)行。緊接在第1步前(“正常循環(huán)”)，一俟注入氨基亞磷酸酯，各相繼的循環(huán)開(kāi)始進(jìn)行。第15步(“正常循環(huán)”)并不是重復(fù)第11步的封端操作，而是一個(gè)不同的“暫停”時(shí)期，在此期間，如片段-DNA準(zhǔn)備程序的打印輸出所示，對(duì)片段進(jìn)行分選。在每一正常循環(huán)中，一旦片段的分送完畢，隨即將柱重新連接到合成裝置中，恢復(fù)合成循環(huán)，進(jìn)行脫三苯甲基和洗滌的操作。最終循環(huán)與正常循環(huán)相同，但免去封端和脫三苯甲基反應(yīng)。根據(jù)需要，在所有片段的合成完畢后，將片段重新裝入柱內(nèi)，使之進(jìn)行脫三苯甲基化反應(yīng)，以除去剩留的5′-DMT保護(hù)基團(tuán)。
合成完畢后，將片段內(nèi)的物質(zhì)倒入帶有螺旋塞的管形瓶中，然后按照CruachemPS200操作手冊(cè)所提供的指令，用已有技術(shù)的方法，使DNA與載體分開(kāi)，接著再進(jìn)行解封和提純。
上述方法已進(jìn)行了許多次，結(jié)果在一天內(nèi)同時(shí)合成了3至79個(gè)不同的DNA順序(合成規(guī)模為0.5-1.0微摩爾)，其長(zhǎng)度在15至25個(gè)殘基范圍內(nèi)。每一步的耦合效率一般為95%左右，而DNA順序業(yè)已由Maxam-Gilbert定序法得以證實(shí)。
實(shí)施例2三種多核苷酸試樣的同時(shí)合成為了評(píng)價(jià)分段片段合成裝置對(duì)于生物聚合物合成的效能，用圖1-5所示的設(shè)備，以及實(shí)施例1中所述的通用方法，同時(shí)合成三種15鏈節(jié)(詳見(jiàn)下文)。DNA分子試樣的核苷酸順序是1.5′-GAGCCATCAAGCCAG-3′2.5′-GCTGCAGAGAGGCCA-3′3.5′-GAGGTGTTGGAGCTG-3′合成過(guò)程的詳細(xì)情況陳述如下試劑來(lái)源Cruachem合成規(guī)模和片段尺寸每一片段(外徑10毫米，高度4毫米)包括10毫克的核苷-CPG(約0.6微摩爾)，系由下述尺寸的部件組裝而成(參見(jiàn)圖1至圖3)多孔聚四氟乙烯布，直徑為12毫米;內(nèi)持留環(huán)，內(nèi)徑和高度分別為4毫米;外固定環(huán)，外徑10毫米，高度2毫米;內(nèi)容積為0.050毫升。
反應(yīng)循環(huán)和試劑/溶劑的使用將CruachemPS200合成裝置說(shuō)明書(shū)中譯述的有關(guān)已有技術(shù)操作的標(biāo)準(zhǔn)“CE-氨基亞磷酸酯”實(shí)驗(yàn)方法(protocal)和反應(yīng)循環(huán)用于本實(shí)驗(yàn)中。
使反應(yīng)循環(huán)中已確定的步驟(第1步的縮聚和第11步的封端)進(jìn)行一段時(shí)間，持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短與實(shí)施例1的“片段-CE20”法中所給出的時(shí)間相同(分別為4.0分和1.5分)。將0.1毫升的0.1MCE-氨基亞磷酸酯和0.1毫升的0.5M四唑(均在無(wú)水乙腈中)在注射器中混合后，注入各柱中，由此開(kāi)始反應(yīng)循環(huán)的第一步。反應(yīng)循環(huán)中其余的“流水線”步驟進(jìn)行(2毫升/分)的持續(xù)時(shí)間為實(shí)施例1的“片段-CE20”法中“正常循環(huán)”所規(guī)定的時(shí)間的一半。就在分選步驟15之前，用氬氣將柱簡(jiǎn)單地沖洗一下。平均循環(huán)時(shí)間為11分鐘。每個(gè)“片段”在每次循環(huán)中消耗的試劑量，連同每次加堿基的大致費(fèi)用(根據(jù)核苷-CPG、試劑和溶劑的產(chǎn)品目錄價(jià)格估算)如下3.7毫升乙腈;
0.4毫升6.5%的二甲基氨基吡啶的四氫呋喃溶液;
0.5毫升乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶;
1.2毫升碘(0.1M濃度，以水/二甲基吡啶/四氫呋喃的配比為1∶10∶4配制而成);
1.2毫升的6.3%二氯乙酸/二氯乙烷;
0.06毫升的0.5M四唑的乙腈溶液;
0.06毫升的M2-氰基乙基氨基亞磷酸酯在乙腈中的溶液。
每次加堿基的費(fèi)用為1.98美元，若用CruachemPS200合成裝置，按標(biāo)準(zhǔn)(已有技術(shù))方式運(yùn)行而進(jìn)行合成，則相應(yīng)的費(fèi)用達(dá)5.42美元。
合成后的解除保護(hù)、DNA提純和分析最后脫三苯甲基的步驟系在柱上進(jìn)行(如同“正常循環(huán)”的第16步)。將片段內(nèi)物質(zhì)注入1.5毫升eppendorf管形瓶中后，加入1毫升新配制的濃氫氧化銨溶液，然后將瓶子封蓋，并進(jìn)行混合。在室溫下保持20分鐘(在此期間，多核苷酸與CPG發(fā)生分離)后，將瓶?jī)?nèi)液體連同所加的1毫升濃氫氧化銨一起轉(zhuǎn)移到一只帶有螺旋塞的玻璃管形瓶(外徑15毫米，高度45毫米)中，用聚四氟乙烯襯里的塞子緊緊密封后，在55℃溫度下培養(yǎng)6-15小時(shí)(解除C、A和G中的環(huán)外氨基保護(hù))。使用Savant Speed Vac濃縮器，通過(guò)抽真空將氨除去(用水噴射泵抽1小時(shí)，然后在高真空下放置過(guò)夜)。將干燥后的DNA溶于少量水中，然后用電泳法(20%聚丙烯酰胺，7M脲)提純，由20A260單位粗反應(yīng)產(chǎn)物所產(chǎn)生的“紫外先陰影”凝膠顯影示于圖6。
在每一凝膠中最高的色帶代表所需的全長(zhǎng)產(chǎn)物，較低處的暗淡色帶代表“失效”順序，而底部深色的色帶代表溴酚蘭標(biāo)記染料。這些凝膠與在自動(dòng)應(yīng)用生物系統(tǒng)380型合成裝置(AppliedBiosystemModel380ASynthesizer)(采用已有技術(shù)的氨基亞磷酸酯法)上所產(chǎn)生的同樣DNA產(chǎn)物而得到的凝膠類(lèi)同，在此過(guò)程中所測(cè)得的耦合效率(采用標(biāo)準(zhǔn)三苯甲基釋放分析法)為98-99%。因此，用分段的片段合成裝置來(lái)合成這三種十五鏈節(jié)的平均耦合效率經(jīng)估算約為98-99%。
評(píng)注這些DNA產(chǎn)物成功地達(dá)到了5′-磷酸化(用T4多核苷酸激酶)，并可采用已有技術(shù)的方法，使之用作雜交探子。產(chǎn)物的高產(chǎn)率、高質(zhì)量，以及成本的降低均證明了本發(fā)明在同時(shí)合成多核苷酸方面的效能。而且，一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是，在每次反應(yīng)循環(huán)后所進(jìn)行的人工分選過(guò)程不會(huì)給合成帶來(lái)不利影響。
實(shí)施例362種生物聚合物的同時(shí)合成為了確定本發(fā)明對(duì)于同時(shí)合成大量生物聚合物方面的效用，本發(fā)明人用圖1至5中所示的設(shè)備，及實(shí)施例1所述的通用方法合成了62種不同的DNA十九鏈節(jié)聚合物(以下將作詳細(xì)描述)。DNA分子試樣的核苷酸順序?yàn)?.5'-GAAAGGTTAGATTCCTCAC-3'2.5'-AAGAAAGGTCAAATTCCTC-3'3.5'-TGGTGGAAGCAAGGTTAAA-3'4.5'-GCTTGGTGGCAGAAAGGTT-3'5.5'-GAATGGTTTCTAACTGCTT-3'6.5'-TTTTCAAAGCGAATGGTTT-3'7.5'-GGTTTAATGTCCTGTTTTT-3'8.5'-GGCGTTTTCATCAGCGGTT-3'9.5'-CCACCCGGCCTTTTCTTCA-3'10.5'-GACGGCGCGTCACCCGGCC-3'11.5'-GTTGACGGCTCGCCACCCG-3'12.5'-TCTTCCAGTTCCTCTTCCG-3'13.5'-AGTTCTTCCCGTACCTCTT-3'14.5'-CCAGACCACCATACTCCAG-3'15.5'-GATTTCAGCATCGCCAGAC-3'16.5'-AGCGGCAGCATGTCGGTGT-3'17.5'-TGCACACGCTCGGTTTTCG-3'18.5'-TATGCACACCCCCGGTTTT-3'19.5'-AAGAGGTATCCACACGCCC-3'20.5'-GGTGATAAGCGGTATGCAC-3'
21.5'-CAACGTCCCCTTGCAGTTA-3'22.5'-ATAAACGTCTCGTTGCAGT-3'23.5'-ACGATAAACCTCCCGTTGC-3'24.5'-TTTGCAGGTCAGGATCGGT-3'25.5'-ATCTTTTGCCGGTTAGGAT-3'26.5'-CGCACCGGACTGTTTTGCA-3'27.5'-TCGTTACGCTCCGGAATGT-3'28.5'-CTTCGTTACCCACCGGAAT-3'29.5'-TACGACGACGTTCTTCGTT-3'30.5'-ACGCCTGGCCGATACGACG-3'31.5'-GCAATAAACTCCTGGCGGA-3'32.5'-GGCGCAATAGACGCCTGGC-3'33.5'-TCCTCTGGCTCAATAAACG-3'34. 5'-CAATCTGCGCGTAG
CCGC-3'35.5'-ATAATGCGCCGTTCAATCT-3'36.5'-CCATAATGCCCAGTTCAAT-3'37.5'-GAAAGATGCTCCATAATGC-3'38.5'-GAAAGATGCTCCATAATGC-3'39.5'-GCGAAAGATCCGCCATAAT-3'40.5'-CGCTACGGCCTTGCTCGCT-3'41.5'-ATCGCTTTCTCGCTACGGC-3'42.5'-TGATCGCTTCCGCGCTACG-3'43.5'-AAATCAGACGAAAGTTGAT-3'44.5'-TCATGCCATCAATCAGACC-3'45.5'-CACTCATGCGATAAATCAG-3'46.5'-GAGCACGGGCGCGTTCCAT-3'47.5'-TTCGCCTGATCACGGGTGC-3'48.5'-TGCTCTTTCTCCTGAGCAC-3'49.5'-CGTCCGTCCCGCGTTTCAA-3'50.5'-GACGGCGTCTGTCCAGCGT-3'51.5'-ACAGACGGCCTCCGTCCAG-3'52.5'-GATACAGACCGCGTCCGTC-3'53.5'-TTAATGGCTTCACGTTCAG-3'54.5'-GCGTTAATGTCTGCACGTT-3'55.5'-TTGGCGCGTCAATGGCTGC-3'
56.5'-CGGTTCCCTCCATTGGCGC-3'57.5'-ATGTCGGCGTCGGTTCCCT-3'58.5'-CGTTTGATACTGTCGGCGG-3'59.5'-TCGCCCGTTCGATAATGTC-3'60.5'-TCAACGGCACTCATCGCCC-3'61.5'-TCATCGTGTTCCTGCATGA-3'62.5'-GTTCATCGTCTACCTGCAT-3'詳細(xì)的合成細(xì)節(jié)如下試劑來(lái)源Cruachem;
合成規(guī)模和片段尺寸如實(shí)施例2所述，將18毫克衍生CPG(約0.6微摩爾)放入各片段中，片段的尺寸為外徑10毫米，高度4毫米。
反應(yīng)循環(huán)用“片段-CE20”法進(jìn)行合成(反應(yīng)循環(huán)如實(shí)施例1所示)。將由0.5毫升的0.5M四唑和0.5毫升的0.1M2-氰基乙基氨基亞磷酸酯所組成的混合物自下向上注入片段柱內(nèi)，以啟動(dòng)第一步。平均反應(yīng)循環(huán)的持續(xù)時(shí)間為18分鐘。分選(第15步)所需的平均時(shí)間為12分鐘。
每次反應(yīng)循環(huán)的試劑和溶劑的用量0.8毫升乙腈;
0.08毫升的6.5%二甲基氨基吡啶的四氫呋喃溶液;
0.10毫升乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶;
0.26毫升碘(0.1M，用水/二甲基吡啶/四氫呋喃以1∶10∶4的比例配置);
0.26毫升的6.3%二氯乙酸/二氯乙烷;
0.03毫升的0.5M四唑的乙腈溶液;
0.03毫升的0.1M2-氰基乙基氨基亞磷酸酯的乙腈溶液。
每次加堿基費(fèi)用0.65美元。這一數(shù)值僅是用CruachemPS200合成裝置，或用全自動(dòng)應(yīng)用生物系統(tǒng)380A型設(shè)備，并按標(biāo)準(zhǔn)(已有技術(shù))方法來(lái)合成這些同樣的多核苷酸的合成費(fèi)用的八分之一。
合成62種多核苷酸所需的全部時(shí)間合成在一天內(nèi)完成，共持續(xù)12小時(shí)。而用3-柱全自動(dòng)運(yùn)用生物系統(tǒng)380A型合成裝置，每天每個(gè)柱進(jìn)行二次合成，則產(chǎn)生同樣數(shù)量的多核苷酸需要10天。
合成后解除保護(hù)，DNA提純和分析所用的方法與實(shí)施例2所述的相同。圖7和圖8中所示的“紫外光陰影”凝膠代表用本實(shí)驗(yàn)中生成的20A260單位的粗反應(yīng)產(chǎn)物所得的相應(yīng)凝膠圖。
根據(jù)紫外光陰影凝膠分析和提純后DNA產(chǎn)物的定量測(cè)定結(jié)果，在這一多級(jí)同時(shí)合成期間的平均耦合效率估計(jì)為92-98%。
評(píng)注提純后的多核苷酸在已有技術(shù)的方法中用于寡核苷酸-定向誘變。在本實(shí)驗(yàn)中，DNA產(chǎn)物成功地進(jìn)行了5′-磷酸化(用T4多核苷酸激酶)，對(duì)合(annealed)成DNA模板，并用DNA聚合酶延伸。由此產(chǎn)生了高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，與已有技術(shù)的方法相比，該法收率高，費(fèi)用大幅度降低，而且所需的時(shí)間也大大減少。
因此，本發(fā)明的片段可供多種限定順序的生物聚合物的合成。載體材料的幾何形狀導(dǎo)致高耦合效率，而剛性片段有助于每次反應(yīng)循環(huán)后的分選。本發(fā)明最大的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在由之所須用的合成費(fèi)用降低，以及合成大量生物聚合物所需的時(shí)間減少。由分段片段法所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)和省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)當(dāng)提高對(duì)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中商品和燃料今后發(fā)展的需求。
因此，本發(fā)明很適宜實(shí)現(xiàn)這些目的，達(dá)到這些目標(biāo)和上述提到的，及內(nèi)中固有的優(yōu)點(diǎn)。雖然，為了揭示起見(jiàn)，業(yè)已給出本發(fā)明目前最佳的實(shí)施例，但是仍可對(duì)零部件的結(jié)構(gòu)和配置作出許多變換，而這些變換將容易地顯現(xiàn)在該技術(shù)領(lǐng)域熟練人員的面前，并在本發(fā)明的精神和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于合成生物聚合物的組合式化學(xué)惰性片段，它適合于多級(jí)對(duì)接重疊，在重疊狀態(tài)下，所說(shuō)的各片段具有單獨(dú)的上多孔件和下多孔件，其特征在于它包括(1)一種能與生物聚合物殘基相結(jié)合的固相截體材料；(2)一個(gè)具有內(nèi)、外壁的持留環(huán)，用來(lái)使所說(shuō)載體材料保持在由內(nèi)壁形成的室內(nèi)，該室與所說(shuō)持留環(huán)的軸心在同一直線上；(3)上多孔件和下多孔件，分別設(shè)置在所說(shuō)持留環(huán)的每一端，其中所說(shuō)的多孔件可使流體流經(jīng)所說(shuō)的持留環(huán)到達(dá)所說(shuō)的載體材料，并防止所說(shuō)的載體材料沖出所說(shuō)的持留環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)的持留環(huán)包括一個(gè)內(nèi)封閉反應(yīng)室，用以容納和持留所說(shuō)的載體材料，而所說(shuō)的持留環(huán)在兩端開(kāi)口。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段，其特征在于所說(shuō)的多孔流通件包括設(shè)置在所說(shuō)持留環(huán)每一端的獨(dú)立部件，并穿越過(guò)所說(shuō)的開(kāi)口端，以密封所說(shuō)的室。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于它還包括固定件，用以使所說(shuō)的多孔流通件固定在所說(shuō)的持留環(huán)上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的片段，其特征在于所說(shuō)的固定件是化學(xué)惰性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)的持留環(huán)是化學(xué)惰性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)的固相載體材料系選自由下述物質(zhì)所組成的這一組中的任一種，這些物質(zhì)是二氧化硅、可控微孔玻璃、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚酰胺-硅藻土、苯甲基連接的聚苯乙烯樹(shù)脂、間隔基團(tuán)連接的苯乙烯樹(shù)脂、聚酰胺樹(shù)脂和大網(wǎng)絡(luò)樹(shù)脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的片段，其特征在于所說(shuō)固相載體材料包括可控微孔玻璃。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)的固相載體材料包括一種與之以共價(jià)鍵形式結(jié)合的殘基的衍生材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)的多孔流通件包括氟碳化物材料、熔接或燒結(jié)玻璃、鈦或不銹鋼燒結(jié)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)流通件的孔隙大小應(yīng)合適，既能使流體流動(dòng)通過(guò)片段，又能將固相載體材料保留在片段中。
12.一種用于合成生物聚合物的組合式化學(xué)惰性片段，它適合于多級(jí)對(duì)接重疊，在重疊狀態(tài)下，所說(shuō)各片段具有單獨(dú)的上多孔件和下多孔件，其特征在于它包括(1)一種能與生物聚合物殘基相結(jié)合的固相載體材料;(2)一個(gè)具有內(nèi)、外壁的持留環(huán)，它包括由所說(shuō)環(huán)的內(nèi)壁形成的內(nèi)反應(yīng)室，并沿著相同的軸向延伸，以容納和持留所說(shuō)的載體材料，所說(shuō)的持留環(huán)的兩端開(kāi)口;(3)惰性多孔膜，設(shè)置在所說(shuō)的內(nèi)持留環(huán)每一開(kāi)口處，并穿越過(guò)該開(kāi)口端，所說(shuō)膜的外徑大于所說(shuō)內(nèi)持留環(huán)的最外直徑，以致所說(shuō)的膜能延伸出所說(shuō)的外壁;和(4)二個(gè)套筒狀外環(huán)，其內(nèi)徑略大于所說(shuō)內(nèi)環(huán)與所說(shuō)膜的厚度之和，以使所說(shuō)膜的邊固定在所說(shuō)的內(nèi)持留環(huán)和所說(shuō)的套筒狀外環(huán)之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的片段，其特征在于所說(shuō)的多孔流通件與所說(shuō)的持留環(huán)緊壓密接。
14.一種用于合成多種限定順序生物聚合物的分段片段合成裝置，它包括(1)一個(gè)溶劑輸送系統(tǒng);(2)至少一個(gè)與所說(shuō)溶劑輸送系統(tǒng)相連接的柱，以供溶劑和試劑流動(dòng)通過(guò)所說(shuō)的柱;和(3)至少一個(gè)如權(quán)利要求1所述的片段，該片段設(shè)置在所說(shuō)的產(chǎn)生聚合物合成反應(yīng)的柱內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的合成裝置，其特征在于它至少包括四個(gè)柱，以接受四種試劑，在每一柱內(nèi)設(shè)置多個(gè)片段，其中所說(shuō)的各片段系供合成限定順序的生物聚合物之用。
16.一種用于合成多種限定順序生物聚合物的分段片段合成裝置，其特征在于它包括(1)一個(gè)溶劑輸送系統(tǒng);(2)如權(quán)利要求1所述的多個(gè)重疊片段，所說(shuō)的每一個(gè)片段包括一種生物聚合物合成材料，并與相鄰的片段相連接，由此形成一個(gè)柱，其中所說(shuō)的每個(gè)片段與相鄰的片段直接對(duì)接，而且所說(shuō)的溶劑輸送系統(tǒng)與所說(shuō)的柱相接，以使流體流過(guò)所說(shuō)的柱。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說(shuō)的多孔件包括所說(shuō)的固相載體材料。
全文摘要
一種用于合成生物聚合物的片段，它包括(1)固相載體材料，(2)一個(gè)反應(yīng)室，它用于容納和持留載體材料，以及(3)至少一種惰性多孔材料，以使流體流動(dòng)通過(guò)片段。本發(fā)明也涉及一種分段片段合成裝置，該裝置至少設(shè)有一個(gè)(最好是許多個(gè))片段，以供同時(shí)合成多種限定順序的生物聚合物。
文檔編號(hào)C07KGK1039250SQ88104418
公開(kāi)日1990年1月31日 申請(qǐng)日期1988年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1987年1月6日
發(fā)明者克內(nèi)夫·洛倫·貝蒂, 詹姆斯·達(dá)勒·弗羅斯特Ⅲ 申請(qǐng)人:貝勒醫(yī)學(xué)院