專利名稱：重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組載體的構(gòu)建，尤其涉及一種重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a及其制備方法。
背景技術(shù)：
Wnt5a蛋白是一種分泌型的糖蛋白，屬于Wnt家族，它不但與胚胎發(fā)育有關(guān)， 它的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但在不同腫瘤中，Wnt5a發(fā)揮著不同的作用，如在它能 促使乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤生長甚至可促使腫瘤的侵襲，而在甲狀腺腫瘤、 結(jié)腸直腸癌等腫瘤中Wnt5a可能發(fā)揮著抑制腫瘤的作用。Wnt5a在腫瘤發(fā)生中的作用和 機(jī)理仍不清楚。目前有研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a主要激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用，在發(fā) 育的組織、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和造血細(xì)胞中有表達(dá)，可促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞分化發(fā)育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a，其包含載體片段pSEB和基 因片段Wnt5a。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述載體片段pSEB來自質(zhì)粒pSEB-flag。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述基因片段Wnt5a來自質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a。
本發(fā)明還提供上述的重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a的制備方法，其主要包含步驟
l)PCR擴(kuò)增獲得Wnt5a基因； 2)將含有pSEB片段的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產(chǎn)物酶切后連 接； 3)將步驟2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化受體菌；
4)鑒定陽性克隆，獲得pSEB-Wnt5a連接產(chǎn)物。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述步驟1)包含通過PCR從質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a中 擴(kuò)增獲得Wnt5a基因。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述步驟1)中的PCR擴(kuò)增中使用PCR引物5' -GGA AGA TCT GCC ACC ATG GCC ATG AAG AAG CCC ATT G-3'禾P 5' -A CGC GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述步驟2)中所述含有pSEB片段的載體為質(zhì)粒 pSEB-flag。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述步驟2)中采用Bg111、 Sal I酶對(duì)含有pSEB片段 的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上述步驟4)中所述鑒定陽性克隆的方法為Wnt5a重 組質(zhì)粒酶切鑒定和/或pSEB-Wnt5a重組質(zhì)粒插入片斷測(cè)序鑒定。 重組表達(dá)質(zhì)粒pSEB-Wnt5a的成功構(gòu)建，有利于進(jìn)一步的研究表達(dá)Wnt5a的逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體的構(gòu)建和研究Wnt5a基因?qū)τ谀[瘤細(xì)胞的作用。
3
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施 例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。


圖1為pSEB-flag質(zhì)粒圖譜；
圖2為質(zhì)粒pAdTrack-T04圖譜； 圖3為重組表達(dá)質(zhì)粒pSEB-Wnt5a包裝病毒后感染k562細(xì)胞后Western blot鑒定 結(jié)果，其中1.K562-Wnt5a細(xì)胞；2.K562-空載體細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明重組表達(dá)質(zhì)粒 pSEB-Wnt5a及制備方法的簡單改進(jìn)，都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
本發(fā)明從質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a中得到Wnt5a核酸序列，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pSEB-Wnt5a質(zhì)粒。本發(fā)明利用PCR法從質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a中擴(kuò)增得到Wnt5a核酸序列，并構(gòu)建 了表達(dá)載體pSEB-Wnt5a，測(cè)序證實(shí)其中Wnt5a序列與pAdTrack-Wnt5a中Wnt5a序列完 全一致，并與Genebank所報(bào)道Wnt5a序列相似度為99.9X。并利用其包裝得到的逆轉(zhuǎn)錄 病毒感染K562細(xì)胞，證實(shí)可以使細(xì)胞Wnt5a蛋白表達(dá)量增高。
材料和來源 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌克隆菌株DH5a(購自寶生物工程有限公司)和細(xì)胞 株K562、 HEK293購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，中國總代理北京中原公司， pSEB-flag(圖譜見圖1)、 pCL-Ampho(見文獻(xiàn)Naviaux RK， Costanzi E， Haas M， Verma IM， et al.The pCL vector system : rapid production of helper-free, high-titer， recombinant retrovirases.J Virol. 1996 Aug ; 70(8): 5701-5.)。 PCR引物Wnt5a引物由Invitrogen公司合成。上游引物為5' -GGA AGA TCT GCCACCATGGCCATGAAGAAGCCCATTG-3，，下游引物為5' -A CGC GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'。 其他主要試劑T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BglII、限制性內(nèi)切酶SalI、 pyrobest DNA多聚酶購買自TAKARA公司；TIANgel Midi Purification Kit購自天根生化科 技有限公司；脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)、滅瘟素(Blasticidin S HCL)購自Invitrogen 公司；質(zhì)粒普通純化試劑盒與去內(nèi)毒素純化試劑盒購自O(shè)mega公司；RMPI-1640、 DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Wnt5a抗體購自Santa Cruz公司，GAPDH內(nèi)參抗體購自 上海康成生物技術(shù)有限公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自Pierce 公司；蛋白酶抑制劑Cocktail購自Roche公司。
重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a的構(gòu)建
1 .pAdTrack-Wnt5a載體的構(gòu)建 1)委托生物公司合成下述序列(包括Kpnl和Xbal酶切位點(diǎn)以及Kozak序列)SEQ
ID NO : 1
4
cggggtacc atggccatga agaagcccat tggaatatta agcccgggag tggctttggg gaccgctgga
ggtgccatgt cttccaagtt cttcctaatg gctttggcca cgtttttctc cttcgcccag gttgttatag aagctaattc
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catcgactat ggctaccgct tcgccaagga gttcgtggac gctagagaaa gggaacgaat ccacgctaag [O(HO]ggttcctatg agagcgcacg catcctcatg aacttacaca acaatgaagc aggccgtagg acagtataca
acctggcaga tgtagcctgt aagtgtcatg gagtgtctgg ctcctgtagc ctcaagacgt gctggctgca
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acagtgcaga ccgaacgctg tcattgcaag tttcactggt gctgctatgt caaatgcaag aagtgcacgg
agattgtgga tcagttcgtg tgcaaatag tctagactag 2)使用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xbal對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行酶切，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒 pAdTrack-T04(芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，THE UNIVERSITY OF CHICAGO MEDICAL CENTER MOLECULAR ONCOLOGY LABORATORY,圖譜見圖2)進(jìn)行酶切(37。C消化 3小時(shí)，酶切反應(yīng)體系為14iUDNA， ， 2iU限制性內(nèi)切酶KpnI， 2iU限制性內(nèi)切酶 Xbal， 2ii 1 10 X Buffer)。 3)回收酶切產(chǎn)物。取酶切產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)得到大小為1100bp 左右和9000bp左右的特異性片段。使用TIANgel Midi Purification Kit回收向吸附柱中 (吸附柱放入收集管中)加入500iU平衡液BL， 12,000rpm離心l分鐘，倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱重新放回收集管中；紫外燈下切下含特異DNA條帶的膠條，放入EP管 中稱重，加入3倍體積溶膠液PN， 5(TC水浴10分鐘直至膠條完全融化，將l個(gè)吸附柱放 入收集管中，將全部樣品移入柱內(nèi)，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回 同一收集管中，加700iU的漂洗液于吸附柱內(nèi)，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將 吸附柱放回同一收集管中，重復(fù)洗滌，最后離心2分鐘，將吸附柱放入l個(gè)干凈的1.5ml 離心管，加50iU三蒸水于吸附柱上的膜中心，柱子放置1分鐘后離心1分鐘，收集洗脫 的DNA。 4)使用T4DNA連接酶連接酶切片段(16。C過夜，連接反應(yīng)體系為2 y 1T4DNA Ligase， 2 ii 110XT4 DNALigase Buffer,質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物6 y 1， PCR酶切回收產(chǎn)物 10iU)。取一無菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5a細(xì)菌200iU，冰浴，吸取5 y 1 連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5a菌，輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42"C水浴90秒，取 出離心管再冰浴2分鐘，加入800iU室溫的LB培養(yǎng)基，混勻，37t:搖床220rpm振蕩培 養(yǎng)1小時(shí)，取50iU菌液涂于含卡那霉素(濃度為50mg/L)的LB培養(yǎng)板上，37。C恒溫培 養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取單個(gè)菌落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。
5)按照Omega E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取重組質(zhì) 粒沉淀菌體，12000rpm，離心1分鐘，棄上清，盡量吸干，用250 y 1預(yù)冷的溶液I將上 述細(xì)菌沉淀重懸，劇烈振蕩，加入溶液II 250iU輕輕顛倒混勻5次，使其澄清，加入溶液 III 350 ii 1，輕輕混勻后12000rpm離心10分鐘；小心吸取水相(約800 y 1)移于另一 1.5ml 離心管(含吸附柱)中，加入GB buffer 500 iU洗滌，棄去洗滌液，加入700 y 1 Wash buffer 洗滌DNA 2次，最后一次洗滌后12000rpm離心2分鐘，室溫干燥2分鐘，加入Elution buffer 50 y 1溶解質(zhì)粒DNA， -20 °C保存。6)取10 y l質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Kpnl、 Xbal雙酶切后1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定， 酶切反應(yīng)體系為質(zhì)粒DNA 10 ii 1， Kpnl、 Xbal各1 y 1， 10 Xbuffer 2 y 1， ddH206 y 1， 37t:水浴3小時(shí)，取酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩個(gè)大小分別約為1100bp、 9000bp的特異片段。經(jīng)測(cè)序后比對(duì)，插入序列與預(yù)期插入序列一致。
2.PCR法獲得Wnt5a基因
(l)引物設(shè)計(jì)與合成
Wnt5a序列SEQ ID : 2 上游引物為(包括Bgl II酶切位點(diǎn)和Kozak序列)為5' -GGA AGA TCTGCC ACC ATG GCC ATG AAG AAG CCC ATT G-3'，下游引物(包括Sal I酶切位點(diǎn))5' -A CGC GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'，下劃線部分為酶切位點(diǎn)， 將上述引物委托Invitrogen公司進(jìn)行合成。
(2)PCRPCR按pyrobest DNA多聚酶試劑盒說明進(jìn)行pAdTrack-Wnt5a模板0.5ul， 10 XPyrobest Buffer II 5ul， dNTP Mixture 4 ii 1， Pyrobest DNA Polymerase 0.25ul， ddH20
40 ii 1，上下游引物各1 y l(終濃度為50pmol)。
94t:預(yù)變性5分鐘，然后94°C 30秒， 58.8t:30秒，72t:75秒，35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10分鐘，反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物做 1%瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)得到大小為1100bp左右的特異性片段。
(3)Wnt5a目的基因的回收 使用TIANgel Midi Purification Kit回收進(jìn)行柱平衡向吸附柱中(吸附柱放入 收集管中)加入500iU平衡液BL， 12,000rpm離心l分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。紫外燈下切下含DNA條帶的膠條，放入EP管中稱重，加入3倍 體積溶膠液PN， 5(TC水浴10分鐘直至膠條完全融化，將l個(gè)吸附柱放入收集管中，將全 部樣品移入柱內(nèi)，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回同一收集管中，加 700iU的漂洗液于吸附柱內(nèi)，離心1分鐘，倒出流過柱子的液體，將吸附柱放回同一收集 管中，重復(fù)洗滌，最后離心2分鐘，將吸附柱放入l個(gè)干凈的1.5ml離心管，加50iU三 蒸水于吸附柱上的膜中心，柱子放置1分鐘后離心1分鐘，收集洗脫的DNA。
3.Wnt5a重組質(zhì)粒構(gòu)建將pSEB-flag載體、回收的PCR產(chǎn)物用BglII、 Sal I雙酶切37°C消化3小時(shí) (酶切反應(yīng)體系為14iUDNA， ， 2iU限制性內(nèi)切酶Bgl II， 2 y 1限制性內(nèi)切酶Sal I， 2 ii 110XBuffer),電泳，回收(步驟參照PCR法獲得Wnt5a基因中DNA回收步驟)，用 T4DNA連接酶16t:過夜連接(連接反應(yīng)體系為2iU T4 DNALigase， 2iU10XT4DNA Ligase Buffer,質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物6 y 1， PCR酶切回收產(chǎn)物10 y 1)，取一無菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5a細(xì)菌200iU，冰浴，吸取5 y 1連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化 DH5a細(xì)菌，輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42。C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘， 加入800 ii 1室溫的SOC培養(yǎng)液(成分2 % (W/V)胰化(蛋白)胨，0.5 % (W/V)酵母提取 物，0.05%(W/V)NaCl， 2.5mM KC1 10mM MgCl2， 20mM葡萄糖)混勻，37。C搖床220rpm 振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，取50 iU菌液涂于含氨芐西林(濃度為50 ii g/mL)的LB培養(yǎng)板上，37°C 恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
4.Wnt5a重組質(zhì)粒酶切鑒定 按照Omega E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒 質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒沉淀菌體，12000rpm，離心1分鐘，棄上清，盡 量吸干，用250iU預(yù)冷的溶液I將上述細(xì)菌沉淀重懸，劇烈振蕩，加入溶液II 250iU輕輕 顛倒混勻5次，使其澄清，加入溶液III 350 ii 1，輕輕混勻后12000rpm離心10分鐘；小 心吸取水相(約800 ii 1)移于另一 1.5ml離心管(含吸附柱)中，加入GB buffer 500 y 1洗 滌，棄去洗滌液，加入700 ii 1 Wash buffer洗滌DNA 2次，最后一次洗滌后12000rpm離 心2分鐘，室溫干燥2分鐘，加入Elution buffer 50 ii 1溶解質(zhì)粒DNA， -20"保存。
取lOiU質(zhì)粒用BglII、 Sall雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶切反應(yīng)體系 為pSEB-Wnt5a質(zhì)粒DNA 10 y 1， Bgl II與Sal I各1 y 1， 10Xbuffer H 2 y 1， ddH206 y 1， 離心數(shù)秒，37t:水浴2小時(shí)，取酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩個(gè)大小分別約為 1100bp、 6000bp的特異片段，表明pSEB-flag質(zhì)粒中已插入大小約為1100bp的片段。
5.pSEB-Wnt5a重組質(zhì)粒插入片斷測(cè)序 將重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a送往上海生工公司測(cè)序。測(cè)序的結(jié)果顯示，插入片段 長度為1149bp(包含Kozak序列)，與pAdTrack-Wnta5a中插入序列完全一致。重組質(zhì)粒 命名為pSEB-Wnt5a。
發(fā)明效果 1.質(zhì)粒pSEB-Wnt5a、 pSEB-flag和pCL-Ampho去內(nèi)毒素大量提取
按照Omega質(zhì)粒DNA提取試劑盒操作(E.Z.N.A.Fastfilter Endo-free Plasmid maxi Kit):從抗性平板上挑取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌落，接種于4ml含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中37t:恒溫 培養(yǎng)，8小時(shí)后接種到含有氨芐西林的lOOmlLB培養(yǎng)基中37t:恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)12-16小時(shí)。 沉淀菌體，4500g，離心10分鐘，棄上清，盡量吸干，用lOml預(yù)冷的溶液I將上述細(xì)菌 沉淀重懸，劇烈振蕩，加入溶液II lOml輕輕顛倒混勻5次，使其澄清，加入Buffer N3， 溫和上下顛倒混勻后倒入針筒過濾器中，收集裂解液上清，加入0.1倍體積ETR溶液，靜 置，4000g離心5分鐘，將上清移置另一試管中，加入1/2體積的無水乙醇，顛倒5次放 置5分鐘，將HiBind大量結(jié)合柱套入50ml試管中，把過濾液倒入結(jié)合柱中，4000g離心 5分鐘，棄去收集管中的濾液，在結(jié)合柱中加入10ml HB Buffer, 4000g離心5分鐘，棄 去收集管中的濾液，在結(jié)合柱中加入15ml DNA Wash Buffer, 4000g離心5分鐘，棄去收 集管中的濾液，重復(fù)使用15ml DNA Wash Buffer洗滌柱子，待柱子干燥后加入2ml預(yù)熱的 ddH20，室溫放置2分鐘，5000g離心5分鐘，收集洗脫下的DNA溶液，-20"保存。
2.pSEB-Wnt5a、 pCL-Ampho與脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞
HEK293細(xì)胞使用含10X小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液，置37t:、5XC02 細(xì)胞培養(yǎng)箱中(50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，飽和濕度下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期且細(xì)胞
7濃度為30-40 %時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的試劑，包括250iUDMEM(無血清)、5 y 1 pCL-Ampho(約0.5-1.0 y g DNA)、 10 y 1 pSEB-Wnt5a或pSEB-flag(約1.0-2.0 y g DNA)、 15iULipofectamine 2000(Invitrogen)，混勻，放置15-20分鐘；仔細(xì)使用無血清的DMEM 沖洗細(xì)胞三次，加入2.5ml無血清的DMEM，小心加入轉(zhuǎn)染混合物；加入后3-5小時(shí)后， 把培養(yǎng)基吸出，加入4ml完整DMEM培養(yǎng)液；在36小時(shí)、60小時(shí)、84小時(shí)和108小時(shí) 收集含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清。-S(TC保存病毒。
3.感染K562細(xì)胞 使用以上所得上清液置換培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞的培養(yǎng)液(添加海美 溴銨最終濃度為12 y g/ml)，反復(fù)感染4次后，換為含有10%小牛血清的RMPI-1640完全 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后加入滅瘟素(最終濃度為40iig/ml)，培養(yǎng)6天后更換為含有10% 小牛血清的RMPI-1640完全培養(yǎng)基，未感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞已全部死亡，得到陽性的 抗性細(xì)胞克隆。 4.提取K562細(xì)胞蛋白以及Western blot鑒定Wnt5a蛋白的表達(dá)
離心收集10ml培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，0.1MPBS漂洗一次，取5X 106細(xì)胞收集于1.5ml 離心管中，加入100iU總蛋白提取液和10iUCocktail(0.1MPBS溶解)，混勻，冰浴30 分鐘，10000rpm、 4t:離心15分鐘，收集上清，測(cè)定總蛋白濃度。配制10^Tricine SDS-PAGE分離膠和濃縮膠。電泳80V 30分鐘，120V 1小時(shí)。電泳結(jié)束后，取下凝膠 置于轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡20-60分鐘，剪下凝膠大小的PVDF膜和厚濾紙，將PVDF膜在 100%的甲醇中浸泡1分鐘后與濾紙一起置于轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡5分鐘，12V恒壓電轉(zhuǎn)印 l小時(shí)，取下PVDF膜，蒸餾水洗膜5分鐘3次，TBST洗滌10分鐘3次，室溫下5%脫 脂奶粉封閉膜l小時(shí)，TBST洗滌10分鐘3次，加入用3XBSA/TBS稀釋至1 : 1000的 兔抗人Wnt5a多克隆抗體，4t:孵育過夜，TBST洗滌10分鐘3次，加入3^BSA/TBS稀 釋至l : 5000的羊抗兔二抗，37t:孵育2小時(shí)，TBST洗滌10分鐘3次，將發(fā)光液A和 B等體積混勻制成工作液，滴于膜上，作用5分鐘，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)并采集圖像。
結(jié)果顯示，通過與感染空載體K562細(xì)胞比較，所得到K562細(xì)胞株穩(wěn)定過表達(dá) Wnt5a基因，請(qǐng)見圖3，其中1.K562-Wnt5a細(xì)胞；2.K562-載體細(xì)胞，GAPDH為甘油 醛-3-磷酸脫氫酶。
序列表 <110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120>重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a及其制備方法
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<400>1cggggtacca tggccatgaa gaagcccatt ggaatattaa gcccgggagt ggctttgggg 60
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權(quán)利要求
一種重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a，包含載體片段pSEB和基因片段Wnt5a。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a，其特征在于所述載體片段pSEB來 自質(zhì)粒pSEB-flag。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a，其特征在于所述基因片段Wnt5a來 自質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a。
4. 權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a的制備方法，其特征在于包含步驟1) PCR擴(kuò)增獲得Wnt5a基因；2) 將含有pSEB片段的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產(chǎn)物酶切后連接；3) 將步驟2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化受體菌；4) 鑒定陽性克隆，獲得pSEB-Wnt5a連接產(chǎn)物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟l)包含通過PCR從質(zhì)粒 pAdTrack-Wnt5a中擴(kuò)增獲得Wnt5a基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟1)中的PCR擴(kuò)增中使用PCR引GTC GAC CTA TTT GCA CAC GAA CTG ATC CAC-3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟2)中所述含有pSEB片段的載體 為質(zhì)粒pSEB-flag。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟2)中采用Bgin、 Sall酶對(duì)含有 pSEB片段的載體與步驟1)獲得的含Wnt5a基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟4)中所述鑒定陽性克隆的方法 為Wnt5a重組質(zhì)粒酶切鑒定和/或pSEB-Wnt5a重組質(zhì)粒插入片斷測(cè)序鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組質(zhì)粒pSEB-Wnt5a及其制備方法，其中該重組質(zhì)粒包含載體片段pSEB和基因片段Wnt5a。上述載體片段pSEB來自質(zhì)粒pSEB-flag，基因片段Wnt5a來自質(zhì)粒pAdTrack-Wnt5a。重組表達(dá)質(zhì)粒pSEB-Wnt5a的成功構(gòu)建，有利于進(jìn)一步的研究表達(dá)Wnt5a的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和研究Wnt5a基因在腫瘤發(fā)生中的作用和機(jī)理研究。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101691585SQ20091010471
公開日2010年4月7日 申請(qǐng)日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者司維柯, 李軍, 李招權(quán), 潘靜, 牛長春, 趙宸 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)