專利名稱：一種重組質(zhì)粒、構(gòu)建方法和用于紅霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種基因工程構(gòu)建的重組質(zhì)粒，以及該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法和該質(zhì)粒在紅霉素產(chǎn)生菌遺傳改造上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
紅霉素是一類在臨床上廣泛使用的、用于治療革蘭氏陽性菌感染的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。自1952年Lily公司首次成功開發(fā)第一代紅霉素類抗生素--紅霉素A以來，以阿齊霉素、克拉霉素、羅紅霉素、氟紅霉素、地紅霉素和大威霉素為代表的第二代紅霉素類抗生素，和以泰利霉素、ABT-773為代表的第三代紅霉素類抗生素具有抗菌活性好、毒性低、不易誘導(dǎo)耐藥性的特點(diǎn)，同時(shí)療程短、用藥簡(jiǎn)便，在抗感染藥物的使用中保持了較高的增長(zhǎng)速度。目前，市場(chǎng)上廣泛使用的第二代和正在推向臨床的第三代紅霉素類抗生素，幾乎全部是通過微生物發(fā)酵合成紅霉素A，然后以紅霉素A為原料經(jīng)半化學(xué)合成修飾而得到的紅霉素衍生物。
目前我國是世界最大的紅霉素原料生產(chǎn)國，但是紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)還普遍存在著有效成分含量偏低的問題。發(fā)酵粗產(chǎn)物中紅霉素A的含量只有60～70％，為了達(dá)到優(yōu)級(jí)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)(92～95％)需經(jīng)多步純化，分離過程中其他紅霉素相關(guān)組分沒有被很好地利用，造成大量的環(huán)境污染和浪費(fèi)，提高了產(chǎn)品成本。因此，這是紅霉素發(fā)酵工業(yè)迫切需要解決的問題。
自從紅霉素作為一種廣譜抗生素藥物進(jìn)入臨床以來，以提高其產(chǎn)生菌種發(fā)酵單位為目的的常規(guī)遺傳育種和菌種選育工作一直未曾停止。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來，國際上在紅霉素生產(chǎn)菌種的基因工程改造方面進(jìn)行了諸多嘗試。但這些研究主要集中在與紅霉素生產(chǎn)相關(guān)的底物供應(yīng)或限制因素的改進(jìn)方面，并未就紅霉素生物合成的次級(jí)代謝途徑做特異性的遺傳修飾，因此，在解決紅霉素生產(chǎn)中經(jīng)常面臨的有效組分偏低等問題時(shí)缺乏有效的針對(duì)性。
紅霉素是迄今研究最多也最為詳盡的一個(gè)模式菌株。1991年Leadlay和Katz等人首次報(bào)道了紅霉素的生物合成基因簇。經(jīng)過多個(gè)實(shí)驗(yàn)室10余年的努力，其生物合成途徑及酶催化反應(yīng)機(jī)制得到了比較完善的闡述，這為代謝工程對(duì)其生物合成途徑進(jìn)行合理化改造提供了必須的遺傳基礎(chǔ)及生化基礎(chǔ)。
人們期望運(yùn)用代謝工程的手段對(duì)紅霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行遺傳改造，可以避免無效組分(如紅霉素B和C等)的產(chǎn)生或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為有效組分紅霉素A，改善紅霉素發(fā)酵產(chǎn)品的組分比例并間接提高紅霉素A的含量。然而菌種的遺傳改造需要合適的操作工具和操作方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因工程構(gòu)建的重組質(zhì)粒，由載體和在多克隆位點(diǎn)上加入一個(gè)含有紅霉素啟動(dòng)子，大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶，碳霉糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等類似的載體；所述的組合，主要特征是含有紅霉素啟動(dòng)子(ErmE*)為m個(gè)，羥基化酶(EryK)為n個(gè)，甲基化酶(EryG)為k個(gè)，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它們可以任意搭配組合。
本發(fā)明的目的還在于提供該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一目的還在于提供該重組質(zhì)粒在紅霉素產(chǎn)生菌遺傳改造上的應(yīng)用。
在本發(fā)明提供的一種重組質(zhì)粒，由載體和在多克隆位點(diǎn)上加入一個(gè)含有紅霉素啟動(dòng)子，大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶，碳霉糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等及其類似的載體；所述的組合，主要特征是含有紅霉素啟動(dòng)子(ErmE*)為m個(gè)，羥基化酶(EryK)為n個(gè)，甲基化酶(EryG)為k個(gè)，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，三者可以按所述的數(shù)目，任意搭配組合。優(yōu)選地，m＝1～2，n＝1～3，k＝0～2。最優(yōu)選地，m＝1，n＝2，k＝1。在本發(fā)明的優(yōu)選例中所述的組合可以為ermE*-eryK、ermE*-eryK-eryG、ermE*-eryK-eryK-eryG或ermE*eryK-eryG-eryK。
在本發(fā)明中所述的羥基化酶，是具有如下所示的核苷酸序列 CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG 在本發(fā)明中所述的甲基化酶，是具有如下所示的核苷酸序列 GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG 在本發(fā)明中所述的紅霉素啟動(dòng)子，是具有如下所示的核苷酸序列 TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA 如本發(fā)明所用，“所述的羥基化酶，甲基化酶和紅霉素啟動(dòng)子”包括上述的基因序列對(duì)應(yīng)的蛋白酶，也指經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的同功能酶。比如，所述的羥基化酶類似物的序列是對(duì)羥基化酶的一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸進(jìn)行替代所形成的，所述經(jīng)氨基酸替換后形成的序列并不影響其活性或保留了其大部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來說，在一種蛋白或多肽的非必要區(qū)域改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性(見Watson等Molecular Biology ofThe Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。
本發(fā)明提供的上述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，系由載體和在多克隆位點(diǎn)上加入一個(gè)含有紅霉素啟動(dòng)子，大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶，碳霉糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以為pKC1139、pOJ260，pWHM3或pSET152等及其類似的載體；所述的組合，是含有紅霉素啟動(dòng)子(ErmE*)為m個(gè)，羥基化酶(EryK)為n個(gè)，甲基化酶(EryG)為k個(gè)，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它們可以如所述的數(shù)目，任意搭配組合。
可以進(jìn)一步描述如下 針對(duì)現(xiàn)有紅霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造主要集中在與紅霉素生產(chǎn)相關(guān)的底物供應(yīng)或限制因素的改進(jìn)方面，并未就紅霉素生物合成的次級(jí)代謝途徑做特異性的遺傳修飾，因此，在解決紅霉素生產(chǎn)中經(jīng)常面臨的有效組分偏低等問題時(shí)缺乏有效的針對(duì)性。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期而深入的研究和試驗(yàn)，首次通過基因工程的手段對(duì)克隆的紅霉素生物合成后修飾酶，更具體的是指大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶和碳霉糖甲基化酶，以及克隆并改進(jìn)的紅霉素啟動(dòng)子，通過其不同搭配組合來構(gòu)建重組質(zhì)粒，并用于紅霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造，發(fā)現(xiàn)能明顯改善紅霉素組分，甚至獲得了只產(chǎn)生單一有效組分的生產(chǎn)菌種?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
(1)，以紅霉素生產(chǎn)菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAGCTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’克隆eryK基因的編碼序列，得到1.7kb的PCR產(chǎn)物，將其置于PermE*啟動(dòng)子下，通過酶切位點(diǎn)克隆到大腸桿菌和鏈霉菌穿梭載體中，得到含有ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒； (2)，以紅霉素生產(chǎn)菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，采用引物5’-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT ACTAGT GCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3’克隆eryK基因的編碼序列，得到1.3kb的PCR產(chǎn)物，其中不包含eryK基因下游自身含有的終止序列；同樣地，采用引物5’-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3’and 5’-TCG ACTAGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3’克隆eryG基因的編碼序列，得到1.5kb的PCR產(chǎn)物，將eryK-G的拷貝置于PermE*啟動(dòng)子下，通過酶切位點(diǎn)克隆到大腸桿菌和鏈霉菌穿梭載體中，得到含有ermE*-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒；或 (3)，將上述(2)得到的eryK基因PCR產(chǎn)物和eryG基因PCR產(chǎn)物，通過酶切位點(diǎn)克隆到載體中，得到兩種不同順序拷貝的基因，eryK-K-G和eryK-G-K，分別置于PermE*啟動(dòng)子下，再通過酶切位點(diǎn)連入大腸桿菌和鏈霉菌穿梭載體中，得到含有ermE*-eryK-eryK-eryG結(jié)構(gòu)或含有ermE*-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供一種所述的重組質(zhì)粒的用途，用于紅霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造，該紅霉素生產(chǎn)菌已經(jīng)同時(shí)申請(qǐng)發(fā)明名稱為‘一種優(yōu)化紅霉素發(fā)酵組分的菌種、構(gòu)建方法和用途’的中國專利。紅霉素生產(chǎn)菌可以含有所述的重組質(zhì)粒；或 它的基因組中整合有額外的所述數(shù)目的羥基化酶，甲基化酶和紅霉素啟動(dòng)子。
所述的紅霉素生產(chǎn)菌，是具有紅霉素生產(chǎn)能力的糖多孢紅霉菌，分類命名為Saccharopolyspora erythraea。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中所述的紅霉素生產(chǎn)菌可以為Saccharopolysporaerythraea HL3168E3、Saccharopolyspora erythraea E1、Saccharopolysporaerythraea NRRL2338或Saccharopolyspora erythraea A226。
可以進(jìn)一步描述如下 (1)，以含有ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒對(duì)紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraeaHL3168E3進(jìn)行改造，能夠完全消除原菌株的雜質(zhì)紅霉素B組分。
將含有含有ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒通過屬間接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3，通過抗性篩選初步得到接合子，進(jìn)一步通過southern確證，得到通過同源重組方式與原生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3基因組eryK基因發(fā)生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1001。其基因型為PermK*-K+PermE*-K+PermA*-G?；蛐偷姆治龊蛃outhern確證如圖8A，B所示。
如圖9所示，重組菌S.erythraea ZL1001的生物效價(jià)測(cè)定相對(duì)野生型S.erythraea HL3168E3沒有明顯變化。但發(fā)酵液的HPLC分析揭示(如圖8C)，Er-B幾乎完全排除，而同時(shí)Er-C卻相應(yīng)地從6％增加到19％，Er-AEr-B+C的比例也從出發(fā)菌株的2.9提高到3.9。這一結(jié)果說明使用這樣的重組質(zhì)粒對(duì)原生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造，能夠完全消除雜質(zhì)紅霉素B組分，達(dá)到有效改善紅霉素組分的目的。
(2)，以含有ermE*-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒對(duì)紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3進(jìn)行改造，能夠明顯降低原菌株的雜質(zhì)紅霉素B和C組分。
將含有含有ermE*-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒通過屬間接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3，通過抗性篩選初步得到接合子，進(jìn)一步通過southern確證，得到通過同源重組方式與原生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3基因組eryK基因發(fā)生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1002，其基因型為PermK*-K-G+PermE*-K+PermA*-G?；蚺c原生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3基因組ery G基因發(fā)生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1003，其基因型為PermK*-K+PermA*-G+PermE*-K-G?；蛐偷姆治龊蛃outhern確證如圖8A，B所示。
發(fā)酵液的HPLC分析(如圖8C)顯示，重組菌S.erythraea ZL1002和ZL1003的中間產(chǎn)物Er-B和Er-C明顯減少，ZL1002的Er-AEr-B+C的比例也提高到17.20。而生物效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示(圖9)，ZL1003與出發(fā)菌株的差異不是很顯著，但ZL1002的Er產(chǎn)量提高了21.5％，而相應(yīng)的Er-B+C下降了20.3％。這一結(jié)果說明使用這樣的重組質(zhì)粒對(duì)原生產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳改造，能夠明顯降低原菌株的雜質(zhì)紅霉素B和C組分，達(dá)到有效改善紅霉素組分的目的。
(3)，以含有ermE*-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒對(duì)紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3進(jìn)行改造，能夠完全去除原菌株的雜質(zhì)紅霉素B和C組分。
將含有含有ermE*-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒通過屬間接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3，通過抗性篩選初步得到接合子，進(jìn)一步通過southern確證，得到通過同源重組方式與原生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3基因組eryK基因發(fā)生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1007，基因型為PermK*-K-G-K+PermE*-K+PermA*-G，和ZL1008基因型為PermK*-K+PermE*-K-G-K+PermA*-G，或與原生產(chǎn)菌S.erythraea HL3168E3基因組ery G基因發(fā)生單交換重組的重組菌S.erythraea ZL1009，基因型為PermK*-K+PermA*-G-K+PermE*-K-G?；蛐偷姆治龊蛃outhern確證如圖8A，B所示。
從發(fā)酵液的HPLC分析(如圖8C)可以看出，采用這一策略能明顯改善紅霉素組分。有兩種重組菌能基本上去除雜質(zhì)組分，ZL1007的Er-B和Er-C基本上降低至0，只產(chǎn)生單一有效組份Er-A。這種重組菌的發(fā)酵粗產(chǎn)物已經(jīng)基本上達(dá)到了去除雜質(zhì)組分的目的。而且采用這一策略，也能更進(jìn)一步提高紅霉素產(chǎn)量(如圖9)。相對(duì)出發(fā)菌S.erythraea HL3168E3，重組菌S.erythraea ZL1007，ZL1008，ZL1009的Er產(chǎn)量提高了30.2％，27.7％，11.5％。
采用本發(fā)明的上述重組質(zhì)?？梢杂糜诩t霉素生產(chǎn)菌的遺傳改造，能夠明顯改善紅霉素組分，甚至獲得只產(chǎn)生紅霉素主要有效組份紅霉素A的生產(chǎn)菌種。



圖1PCR擴(kuò)增得到羥基化酶，甲基化酶基因的瓊脂糖電泳結(jié)果。
圖2含有ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程。
圖3含有ermE*-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程。
圖4含有ermE*-eryK-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程。
圖5含有ermE*-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程。
圖6組合分別為ermE*-eryK、ermE*-eryK-eryG、ermE*-eryK-eryK-eryG或ermE*-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的酶切鑒定。
圖7出發(fā)菌株S.erythraea HL3168E3發(fā)酵液的高效液相色譜(HPLC)分析以及和紅霉素A、B和C標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照。
圖8出發(fā)菌株S.erythraea HL3168E3和重組菌的基因型和表型。
圖9出發(fā)菌株S.erythraea HL3168E3和重組菌的生物效價(jià)測(cè)定。
符號(hào)說明 附圖1中A是羥基化酶的1.7kb PCR產(chǎn)物，其中泳道1.1kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2.EryK基因1.7kb PCR產(chǎn)物；B是羥基化酶1.3kb PCR產(chǎn)物和甲基化酶1.5kbPCR產(chǎn)物，其中泳道1.1kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2.eryG基因PCR產(chǎn)物，泳道3.eryK基因PCR產(chǎn)物。
附圖6中A是含有ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pCY1-56-B(A)的酶切鑒定，其中泳道1.1Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2.pCY1-56-B EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY1-56-B PstI酶切，泳道4.pCY1-56-B BamHI酶切；B是含有ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pCY1-96-1(B)的酶切鑒定，其中泳道5.1Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道6.pCY1-96-1EcoRI/HindIII酶切，泳道7.pCY1-96-1BamHI酶切；C是含有ermE*-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pCY3-69-1的酶切鑒定，其中泳道1.1Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2.pCY3-69-1EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY3-69-1XhoI酶切；D是含有ermE*-eryK-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pCY3-69-3的酶切鑒定，其中泳道1，4.1Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2.pCY3-69-3EcoRI/HindIII酶切，泳道3.pCY3-69-3XhoI酶切；E是含有ermE*-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pCY4-17-6的酶切鑒定，其中泳道4.1Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道5.pCY4-17-6EcoRI/HindIII酶切，泳道6.pCY4-17-6XhoI酶切；kb表示堿基對(duì)。
附圖8中誤差線I表示95％標(biāo)準(zhǔn)偏差；A是SmaI或SphI的限制酶切圖譜；B是以含有eryK基因的1.7kb的片段為探針，用SmaI或SphI消化的總DNA的southern圖譜；C，紅霉素發(fā)酵液的HPLC分析●，紅霉素C；★，紅霉素A；▲，紅霉素B；I表示出發(fā)菌株S.erythraea HL3168E3；II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和X分別表示重組菌；kb表示堿基對(duì)。
附圖9中Erythromycin表示紅霉素；HL3168表示出發(fā)菌株S.erythraeaHL3168E3；ZL1001～ZL1009分別表示相對(duì)應(yīng)的附圖8中的II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和X重組菌。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內(nèi)容。
實(shí)施例1含有ermE＊-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以工業(yè)生產(chǎn)上糖多孢紅霉菌S.erythraea HL3168E3的基因組DNA為模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’克隆eryK基因的編碼序列，結(jié)果如圖1.A所示，得到1.7kb的PCR產(chǎn)物。
將上述PCR產(chǎn)物回收純化后克隆至

-Teasy載體，酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行測(cè)序。我們將測(cè)序結(jié)果與Genebank中Stassi提交的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，有兩處不一致。一處位于啟動(dòng)子區(qū)，在起始密碼子上游38bp處，堿基由TGC變?yōu)門TC，這一位置的氨基酸由Genebank的半胱氨酸(Cys)變?yōu)槲覀兩a(chǎn)菌中的苯丙氨酸(Phe)；另一處位于編碼區(qū)內(nèi)，在起始密碼子下游988bp處，堿基由TTC變?yōu)镃TC，相應(yīng)氨基酸由數(shù)據(jù)庫中的苯丙氨酸(Phe)變?yōu)樯a(chǎn)菌中的亮氨酸(Leu)。
從測(cè)序正確的克隆載體pCY1-40-B中用PstI和HindIII雙酶切下1.7kb目的片段eryK基因，克隆至PstI/HindIII酶切的載體pWHM3得到重組質(zhì)粒pCY1-50-C，再從質(zhì)粒BSVII-41-F中用EcoRI/XbaI酶切下0.5kb含有改造的紅霉素自身的強(qiáng)啟動(dòng)子PermE＊，克隆到EcoRI/XbaI酶切的質(zhì)粒pCY1-50-C，于是得到含有PermE＊-eryK基因的重組質(zhì)粒pCY1-56-B。用EcoRI/HindIII酶切質(zhì)粒pCY1-56-B，回收2.2kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的pKC1139載體中，得到重組質(zhì)粒pCY1-96-1。構(gòu)建過程如圖2所示。
分別選用幾組酶來酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pCY1-56-B和pCY1-96-1，酶切圖譜如圖6.A和B所示，與理論預(yù)期完全一致，證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。
實(shí)施例2含有ermE＊-eryK-eryG結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以工業(yè)生產(chǎn)上糖多孢紅霉菌S.erythraea HL3168E3的基因組DNA為模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAG CTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’及5’-TTA CCA TGGGGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3’和5’-TCG ACT AGT CTA CCG CGTGCT GCG CTC CTA-3’克隆eryK基因和eryG基因的編碼序列，產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1.B所示，可見產(chǎn)物有非常特異的擴(kuò)增。
將eryK基因PCR產(chǎn)物克隆到載體pANT841中，測(cè)序鑒定，得到eryK基因序列正確的載體pCY3-48-K4。從質(zhì)粒BSVII-41-F中用EcoRI/SacI酶切下改造的紅霉素組成型啟動(dòng)子PermE＊片段，插入到EcoRI/SacI酶切的質(zhì)粒pCY3-48-K4，于是得到含有PermE＊-eryK基因的重組質(zhì)粒pCY3-58-B1。將eryG基因PCR產(chǎn)物用NcoI/SpeI酶切下克隆到載體pANT841中，測(cè)序鑒定，得到含有eryG基因序列正確的重組質(zhì)粒pCY3-48-G4。用NcoI/HindIII酶切質(zhì)粒pCY3-48-G4，回收1.5kb的eryG基因目標(biāo)產(chǎn)物，插入到NcoI/HindIII酶切的載體pET-28a，得到重組質(zhì)粒pCY3-60-A8，再用XbaI/HindIII酶切質(zhì)粒pCY3-60-A8，回收1.5kb的eryG基因目標(biāo)產(chǎn)物，利用SpeI和XbaI的同尾酶特點(diǎn)，將回收片段插入到SpeI/HindIII酶切的質(zhì)粒pCY3-58-B1，得到含有PermE＊-eryK-eryG基因拷貝的重組質(zhì)粒pCY3-64-KG1，并用EcoRI/HindIII酶切，回收3.3kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的載體pKC 1139中，得到pKC1139衍生的重組質(zhì)粒pCY3-69-1，構(gòu)建過程如圖3所示。
分別選用幾組酶來酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pCY3-69-1，酶切圖譜如圖6.C所示，與理論預(yù)期完全一致，證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。
實(shí)施例3含有ermE＊-eryK-eryK-eryG結(jié)構(gòu)和ermE＊-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 從eryK基因測(cè)序正確的質(zhì)粒pCY3-48-K4中用XhoI和HindIII雙酶切下1.3kb目的片段eryK基因，克隆至XhoI/HindIII酶切的載體pGEM-7zf，得到質(zhì)粒pCY3-58-F6，而后再用XbaI/HindIII酶切下目的片段eryK基因，利用XbaI和SpeI同尾酶的特點(diǎn)，克隆到SpeI/HindIII雙切的質(zhì)粒pCY3-58-B1，于是得到含有PermE＊-eryK-eryK基因串聯(lián)拷貝形式的重組質(zhì)粒pCY3-62-KK8。
另外從eryG基因測(cè)序正確的質(zhì)粒pCY3-60-A8中用XbaI/HindIII雙酶切下1.5kb目的片段eryG基因，再克隆到SpeI/HindIII雙切的質(zhì)粒pCY3-62-KK8中，得到含有PermE＊-eryK-eryK-eryG基因串聯(lián)拷貝形式的重組質(zhì)粒pCY3-66-KKG6，然后用EcoRI/HindIII酶切，回收4.6kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的載體pKC 1139中，得到pKC 1139衍生的重組質(zhì)粒pCY3-69-3，構(gòu)建過程如圖4所示。
從質(zhì)粒pCY3-58-F6用XbaI/HindIII酶切下目的片段eryK基因，克隆到SpeI/HindIII雙切的質(zhì)粒pCY3-64-KG1，得到含有PermE＊-eryK-eryG-eryK基因串聯(lián)拷貝形式的重組質(zhì)粒pCY4-16-8，然后用EcoRI/HindIII酶切，回收4.6 kb目的片段，克隆入EcoRI/HindIII酶切的載體pKC 1139中，得到pKC1139衍生的重組質(zhì)粒pCY4-17-6，構(gòu)建過程如圖5。
分別選用幾組酶來酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pCY3-69-3和pCY4-17-6，酶切圖譜如圖6.D和E所示，與理論預(yù)期完全一致，證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。
實(shí)施例4含有ermE＊-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒用于紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌HL3168E3的遺傳改造 將鑒定后的重組質(zhì)粒pCY1-96-1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli ET12567中，按如下方式將其導(dǎo)入S.erythraea HL3168E3中培養(yǎng)含有適當(dāng)質(zhì)粒的E.coli ET12567至OD600＝0.5-0.6，25mL培養(yǎng)液中的細(xì)菌細(xì)胞離心收集，用等體積的LB洗兩次，重懸于2mL LB中，作為大腸桿菌供體細(xì)胞。取適量?jī)龃嬗?80℃的S.erythraeaHL3168E3的20％甘油孢子懸液500μL，用等體積的TES buffer洗兩次，重懸于等體積的TES buffer，50℃熱激10min使孢子萌發(fā)。再加等體積的TSB，37℃溫育2-5hr。離心重懸于0.5-1mL LB中作為鏈霉菌受體細(xì)胞。將不同濃度的受體細(xì)胞100μL與等體積的供體細(xì)胞混合直接涂布在含有10mM MgCl2的MS平板上，30℃培養(yǎng)20hr后，采用無菌水輕輕洗滌平板表面以洗去大部分大腸桿菌，在每一平板的表面覆蓋含萘啶酮酸(終濃度為50ng/μL)和相應(yīng)抗生素的1mL無菌水。30℃培養(yǎng)5天以上挑取接合子。
所得到的重組菌株，取出10μL接種至液體培養(yǎng)基TSB(Am 25μg/ml)，37℃，振蕩培養(yǎng)2-3天，小量抽提基因組DNA，用SmaI酶切DNA，使用用于同源交換的含有eryK基因的1.7kb的片段作為探針進(jìn)行Southern雜交，鑒定其基因型。理論分析整合前基因組的基因型為PermK＊-eryK+PermA＊-eryG，整合后基因型為PermK＊-eryK+PermE＊-eryK+PermA＊-eryG(如圖8A所示)。雜交后結(jié)果如圖8B所示，出發(fā)菌株和重組菌株與理論分析整合前后的片段大小比較，完全一致，證明ermE*-eryK結(jié)構(gòu)的基因已經(jīng)整合到紅霉素生產(chǎn)菌S.erythraeaHL3168E3中。Southern鑒定獲得其基因型為PermK*-K+PermE*-K+PermA*-G，命名為重組菌S.erythraea ZL1001。
實(shí)施例5紅霉素的搖瓶發(fā)酵 紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株HL3168E3和它的重組菌株在斜面培養(yǎng)基[/L10g玉米淀粉，10ml玉米漿，3g氯化鈉，3g硫酸銨，5g碳酸鈣，pH 7.0，2g瓊脂粉](重組菌培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目股?34℃培養(yǎng)7天生長(zhǎng)孢子，作為液體發(fā)酵的種子。
液體發(fā)酵時(shí)，從斜面培養(yǎng)基上取1cm2大小方塊接入50ml發(fā)酵種子培養(yǎng)基[/L50g玉米淀粉，18g黃豆餅粉，13ml玉米漿，3g氯化鈉，1.2g硫酸銨，1.2g硝酸銨，5ml豆油，6g碳酸鈣，pH 6.8～7.0]，在34℃，250rpm培養(yǎng)2天。然后將5ml的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基[/L40g玉米淀粉，30g黃豆餅粉，30g糊精，2g硫酸銨，10ml豆油，6g碳酸鈣，pH自然]，在34℃，250rpm培養(yǎng)6天。接種24小時(shí)后補(bǔ)加0.5ml的正丙醇。
實(shí)施例6紅霉素發(fā)酵液產(chǎn)物抽提 在100ml燒杯中，準(zhǔn)確量取適量發(fā)酵液以NaOH調(diào)pH至8.9。若樣品冰凍，應(yīng)融化后混合均勻定量轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中，以水定容，混合均勻，8000～9000離心10min。
取25ml上述溶液于125ml分液漏斗中，加25ml正己烷，震蕩5min，收集水相(下層)于離心管中，用水洗滌己烷層2次后，水相與離心管水相混合，加入10ml氯仿，激烈震蕩5min，2500離心5min，依樣品情況，可能會(huì)在界面形成乳狀液，可用玻棒分散或再次離心，棄水相，將氯仿(下層)移至10ml的小瓶中，濃縮。
實(shí)施例7紅霉素發(fā)酵液生物效價(jià)測(cè)定 取直徑約90mm，高16-17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至48-50℃，加入短小芽孢桿菌菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為上層含菌層。放置水平臺(tái)上冷卻后，在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管(內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，高1.0±0.1mm，外徑7.8±0.1mm)四個(gè)，用瓦蓋覆蓋備用。將樣品分成高低兩個(gè)濃度以磷酸緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后加入牛津杯。高低濃度的稀釋倍數(shù)為2∶1或4∶1，二劑量法標(biāo)準(zhǔn)溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm以內(nèi)，抗生素濃度范圍為5-20單位/ml。37℃培養(yǎng)14-16小時(shí)后，測(cè)量抑菌圈大小。
[稀釋緩沖液磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g加水至1000ml，過濾，115℃滅菌30min。pH＝7.8 效價(jià)的計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)品(S)試驗(yàn)品(T)AT是T的估計(jì)效價(jià)效價(jià)PT 生物檢定將T和其S在相同的試驗(yàn)條件下同時(shí)對(duì)生物或離體器官等的作用進(jìn)行比較，通過對(duì)比計(jì)算出它們的等反應(yīng)效呈比值(R)，以測(cè)得T的效價(jià)PT R是S和T的等反應(yīng)劑呈(dS，dT)的比值，即R＝dS/dT M是S和T的對(duì)數(shù)等反應(yīng)劑呈(XS，XT)之差，即M＝lgdS-lgdT＝XS-XT R＝antilgM PT是通過檢定測(cè)得T的效價(jià)含量，稱T的測(cè)得效價(jià)，是將效價(jià)比值(R)用T的估計(jì)效價(jià)AT校正之后而得，即 PT＝AT*R 或試驗(yàn)品效價(jià)＝Q＊估計(jì)效價(jià) Q＝log-1[(T2+T1-S2-S1)＊I/(T2+S2-T1-S1) I為高劑呈與低劑呈之比，I為4∶1時(shí)logI＝0.6021 2∶1時(shí)logI＝0.3010 S2高劑呈標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈半徑 S1低劑呈標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈半徑 T2高劑呈試驗(yàn)品的抑菌圈半徑 T1低劑呈試驗(yàn)品的抑菌圈半徑] 實(shí)施例8紅霉素發(fā)酵液的色-質(zhì)譜分析 樣品分析前加入適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相，超聲助溶，進(jìn)樣20μl。
組分的分析采用HPLC檢測(cè) 色譜柱NUCLEOSIL 100-5CN(250×4.6mm，Ser.No.6105322，MACHEREY-NAGEL Inc.，Germany)。
流動(dòng)相69％A相(32mM potassium phosphate buffer，pH8.0)，31％B相(acetonitrile/methanol75/25)。
檢測(cè)條件流速1ml/min，UV檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，在Agilent 1100HPLCsystem(Agilent Technologies.Palo Alto，CA)上分析時(shí)間為50分鐘。
組分的鑒定采用LC-MS檢測(cè) 色譜柱Microsorb-MV C 18(250×4.6mm，Part No.281505，VARIAN Inc.，American)。
流動(dòng)相62％A相(30mM ammonium acetate，pH4.8)，38％B相(acetonitrile)。
檢測(cè)條件流速1ml/min，UV檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，在LCMS-2010A(LiquidChromatograph Mass Spectrometer，SHIMADZU，JP)上分析時(shí)間為30分鐘。
Er-A，Er-B和Er-C分子離子峰分別為m/z＝734.2，m/z＝718.3and m/z＝720.3，與對(duì)應(yīng)的分子式C37H67NO13，C37H67NO12and C36H65O13一致。
實(shí)施例9核酸分子雜交 1)DIG DNA標(biāo)記將待標(biāo)記的DNA用無菌水稀釋至總體積15μL，沸水浴中加熱變性10分鐘，立即置于冰鹽浴中冷卻。接著加入2μL引物混合物，2μLdNTP混合物，1μL酶，混合均勻后，37℃水浴約16小時(shí)。加入0.8μL 0.8MEDTA(pH8.0)以終止反應(yīng)，加入2.5μL 4M LiCl混合均勻，再加入75μL預(yù)冷的無水乙醇沉淀標(biāo)記后的DNA，置于-80℃沉降40分鐘。4℃，12000rpm離心20分鐘收集DNA，用預(yù)冷的70％乙醇洗滌DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μL TE((pH 8.0)中。
2)DIG DNA探針標(biāo)記后的質(zhì)量檢測(cè)稀釋經(jīng)1)標(biāo)記得到的DNA探針，至以下六個(gè)梯度，1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。稀釋標(biāo)記的對(duì)照DNA至以下濃度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分別取1μL上述梯度的DNA樣品點(diǎn)在雜交用的尼龍膜上，根據(jù)6)所述步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)，對(duì)比標(biāo)記的DNA探針和對(duì)照DNA的顯色強(qiáng)度以決定所標(biāo)記的DNA探針濃度。
3)Southern雜交的膜轉(zhuǎn)移DNA樣品在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠上電泳至適當(dāng)距離，做好標(biāo)記。浸泡于400mL 0.25M HCl中脫嘌呤20分鐘，使溴酚藍(lán)變黃，用去離子水洗數(shù)次。室溫下浸入堿性緩沖液(0.5M NaOH，1M NaCl)15分鐘并輕輕振蕩。換液一次繼續(xù)浸泡凝膠20分鐘，并輕輕振蕩，去離子水洗三次。取一張每邊都比凝膠大1mm的尼龍膜，用去離子水完全浸濕，做好標(biāo)記。采用向上毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法，用10×SSC轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移8-24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分鐘。
4)預(yù)雜交和雜交預(yù)熱雜交液(20mL/100cm2)至雜交溫度68℃，放入雜交尼龍膜，輕輕振蕩并保溫30分鐘。將DIG標(biāo)記的DNA探針在沸水浴中變性5分鐘，立即置于冰鹽浴中冷卻。冷卻后，將DNA探針與合適體積的DIG雜交液(2.5mL/100cm2)混合均勻。去除預(yù)雜交液并立即把DNA探針/DIG雜交液加入，輕輕振蕩保持雜交溫度64℃或68℃約16小時(shí)。
5)雜交后嚴(yán)緊洗脫室溫下用2×SSC/0.1％SDS漂洗兩次，每次5分鐘。68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS振蕩漂洗兩次，每次15分鐘。
6)顯色反應(yīng)和檢測(cè)嚴(yán)緊洗脫后的尼龍膜在洗滌緩沖液(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH＝7.5，0.3％(v/v)Tween 20)中平衡1-5分鐘，接著在封閉緩沖液(封閉試劑以10％的濃度溶于0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH＝7.5)中封閉30分鐘，然后在抗體中浸泡30分鐘。用洗滌緩沖液漂洗尼龍膜兩次后，用檢測(cè)緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH＝9.5)平衡2-5分鐘，最后將尼龍膜置于10mL新配制的顯色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶于70％DMF，濃度為70mg/mL，BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)溶于水，濃度為50mg/mL。用時(shí)10mL顯色溶液中加45μL NBT，35μL BCIP]中，置于黑暗中顯色。顯色合適后用去離子水漂洗以終止反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種基因工程構(gòu)建的重組質(zhì)粒，由載體和在多克隆位點(diǎn)加入一個(gè)含有紅霉素啟動(dòng)子ErmE*為m個(gè)，大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶EryK為n個(gè)，碳霉糖甲基化酶EryG為k個(gè)組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，其特征在于，所述的紅霉素啟動(dòng)子，羥基化酶和甲基化酶之間的組合，具有如下所示的結(jié)構(gòu)
(X)m-(Y)n-(Z)kI
其中，X為紅霉素啟動(dòng)子ErmE*，所述的紅霉素啟動(dòng)子具有如下的核苷酸序列
TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA；
Y為紅霉素生物合成過程中大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶EryK，具有如下的核苷酸序列
CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG；
Z為紅霉素碳霉糖甲基化酶EryG，具有如下的核苷酸序列
GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG；
其中m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4。
2.一種如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒，其特征是所述的組合為(X)1-(Y)1或(X)1-(Y)1-(Z)1或(X)1-(Y)2-(Z)1或(X)1-(Y)1-(Z)1-(Y)1的結(jié)構(gòu)。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒，其特征是所述的載體為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152及其類似的載體。
4.一種如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，通過下述(1)、(2)或(3)三種步驟分別獲得
(1)，以紅霉素生產(chǎn)菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，采用引物5’-AAA CTG CAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT AAGCTT CGC CGG GGC AGT GCA AGT ACG-3’克隆eryK基因的編碼序列，得到1.7kb的PCR產(chǎn)物，將其置于PermE*啟動(dòng)子下，通過酶切位點(diǎn)克隆到載體中，得到含有(X)1-(Y)1-(Z)0結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒；
(2)，以紅霉素生產(chǎn)菌株S.erythraea HL3168E3的基因組為模板，采用引物5’-AAA CTC GAG CAC CGC GGA AGT CTC GAC ACC-3’和5’-TTT ACTAGT GCT GCC CGA CTA CGC CGA CTG-3’克隆eryK基因的編碼序列，得到1.3kb的PCR產(chǎn)物，其中不包含eryK基因下游自身含有的終止序列；同樣地，采用引物5’-TTA CCA TGG GGT GCT GTT GCC GTC CCT GCG-3’and 5’-TCG ACTAGT CTA CCG CGT GCT GCG CTC CTA-3’克隆eryG基因的編碼序列，得到1.5kb的PCR產(chǎn)物，將eryK-G的拷貝置于PermE*啟動(dòng)子下，通過酶切位點(diǎn)克隆到載體中，得到含有(X)1-(Y)1-(Z)1結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒；或
(3)，將上述(2)得到的eryK基因PCR產(chǎn)物和eryG基因PCR產(chǎn)物，通過酶切位點(diǎn)克隆到載體中，得到兩種不同順序拷貝的基因，eryK-K-G和eryK-G-K，分別置于PermE*啟動(dòng)子下，再導(dǎo)入載體中，得到含有(X)1-(Y)2-(Z)1結(jié)構(gòu)或含有(X)1-(Y)1-(Z)1-(Y)1結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒。
5.一種如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒用于紅霉素生產(chǎn)菌種的遺傳改造。
6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒的用途，其特征是所述的紅霉素產(chǎn)生菌含有如權(quán)利要求1所述的載體；或它的基因組中整合有額外的如權(quán)利要求1所述數(shù)目的羥基化酶，甲基化酶和紅霉素啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程構(gòu)建的重組質(zhì)粒，以及該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法和該質(zhì)粒在紅霉素產(chǎn)生菌遺傳改造上的應(yīng)用。重組質(zhì)粒由載體和在多克隆位點(diǎn)加入一個(gè)含有紅霉素啟動(dòng)子，大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶，碳霉糖甲基化酶組合的片段組成，其中載體為大腸桿菌和鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可以為pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等類似的載體；所述的組合，主要特征是含有紅霉素啟動(dòng)子(ErmE*)為m個(gè)，羥基化酶(EryK)為n個(gè)，甲基化酶(EryG)為k個(gè)，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它們可以任意搭配組合。使用這樣的重組質(zhì)粒對(duì)紅霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行遺傳改造，可以明顯改善組分，甚至獲得只產(chǎn)生有效單一組分的生產(chǎn)菌種。
文檔編號(hào)C12N15/80GK101285073SQ20071017370
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者文 劉, 張嗣良, 云 陳, 瑋 鄧 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 華東理工大學(xué)