專利名稱：產(chǎn)生o-乙酰高絲氨酸的微生物和利用所述微生物產(chǎn)生o-乙酰高絲氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬(Escherichia sp.)的菌株。另外，本發(fā)明還涉及利用所述菌株產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法。
背景技術(shù)：
可以通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方式合成在動(dòng)物飼料、食品和醫(yī)藥中使用的蛋氨酸。在化學(xué)合成途徑中，蛋氨酸基本上是通過(guò)水解5-[2_甲基巰基乙基]乙內(nèi)酰脲產(chǎn) 生的。然而，合成蛋氨酸的不利之處在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，這需要困難 的額外方法將它們彼此分開(kāi)。為了解決該問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了用于選擇性地合成 L-蛋氨酸的生物學(xué)方法，L-蛋氨酸是已有專利申請(qǐng)(W0 2008/103432)要求保護(hù)的化學(xué)物 質(zhì)。該方法(簡(jiǎn)稱為“兩步法”)包括發(fā)酵產(chǎn)生L-蛋氨酸前體以及由L-蛋氨酸前體向L-蛋 氨酸的酶促轉(zhuǎn)化。所述蛋氨酸前體優(yōu)選包括0-乙酰高絲氨酸和0-琥珀酰高絲氨酸。就對(duì) 常規(guī)方法存在的問(wèn)題的克服對(duì)所述兩步法進(jìn)行評(píng)價(jià)，所述常規(guī)方法存在的問(wèn)題例如硫化物 的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反饋調(diào)控，以及胱硫醚γ合酶、0-琥珀酰高絲氨 酸硫化氫解酶和0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶對(duì)中間產(chǎn)物的降解。另外，與產(chǎn)生DL-蛋氨酸 的常規(guī)化學(xué)合成法相比，所述兩步法具有以下優(yōu)點(diǎn)僅對(duì)L-蛋氨酸具有選擇性，并且伴隨 產(chǎn)生作為有用副產(chǎn)物的有機(jī)酸，例如琥珀酸和乙酸。作為蛋氨酸生物合成途徑中的中間產(chǎn)物，0-乙酰-高絲氨酸被用作產(chǎn)生蛋氨酸 的前體(W0 2008/013432)。如下式所示，在0-乙酰轉(zhuǎn)移酶的協(xié)助下由L-高絲氨酸和乙 酰-CoA合成0-乙酰-高絲氨酸L-高絲氨酸+乙酰-CoA — 0-乙酰-高絲氨酸。在本申請(qǐng)的受讓人的美國(guó)專利申請(qǐng)第12/062835號(hào)中公開(kāi)了其中引入了負(fù)責(zé)天 冬氨酸激酶活性和高絲氨酸脫氫酶活性的thrA基因和編碼高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的源自奇 球菌(Deinococcus)的metX基因從而分別提高L-高絲氨酸和0-乙酰高絲氨酸的生物合 成的微生物株，和利用所述微生物株高產(chǎn)量地產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為增強(qiáng)負(fù)責(zé)高絲氨酸生物合成途徑中催化反應(yīng)的 其他三種酶能夠以更高于US12/062835所述方法的產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸，其中所述其 他三種酶為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)和天冬氨酸半醛 脫氫酶(asd)。與根據(jù)本發(fā)明的共同增強(qiáng)(concomitant enhancement)參與從磷酸烯醇式丙酮酸 到0-乙酰高絲氨酸的轉(zhuǎn)化的一系列酶類似，已經(jīng)嘗試通過(guò)同時(shí)表達(dá)在由天冬氨酸衍生的 L-氨基酸(例如L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-蛋氨酸)的生物合成中發(fā)揮重要作用的酶來(lái)提
高L-氨基酸的產(chǎn)量。EP00900872涉及在大腸桿菌(Escherichia coll)中有效地產(chǎn)生L-賴氨酸， 其特征在于提高參與賴氨酸生物合成的一系列酶的活性，所述酶包括二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、二氨基庚二酸脫氫酶 (ddh)、四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶(tetrahydropicolinatesuccinylase，dapD)、琥珀酰二 氨基庚二酸脫酰酶(succinyl diaminopimelatediacylase, IysE)、天冬氨酸半醛脫氫酶 (asd)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)。日本專利第JP2006-520460和JP2000-244921號(hào) 公開(kāi)了通過(guò)提高天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸激 酶(thrA)、高絲氨酸脫氫酶(thrA)、高絲氨酸激酶(thrB)和蘇氨酸合酶(thrC)的活性從 而在大腸桿菌中有效產(chǎn)生L-蘇氨酸。另外，WO 2007/012078公開(kāi)了能夠產(chǎn)生水平增加的 L-蛋氨酸的棒桿菌(Corynebacterium)重組菌株，其中編碼天冬氨酸激酶(IysC)、高絲氨 酸脫氫酶(hom)、高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metX)、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(metY)、胱硫 醚Y合酶(metB)、維生素B12依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶(metH)、維生素B12非依賴性蛋氨酸合酶 (metE)、甲基四氫葉酸還原酶(metF)和葡萄糖6-磷酸脫氫酶(zwf)的基因的表達(dá)水平提 高，而編碼蛋氨酸阻遏物蛋白(mcbR)、高絲氨酸激酶(hsk)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK) 和蘇氨酸脫氫酶(IivA)的基因的表達(dá)水平降低。所有這些專利均涉及有效產(chǎn)生天冬氨酸衍生的L-氨基酸，即分別為L(zhǎng)-絲氨酸、 L-蘇氨酸和L-蛋氨酸，特征在于應(yīng)用依賴于各自產(chǎn)物的基因組合。在本發(fā)明中，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)使負(fù)責(zé)0-乙酰高絲氨酸生物合成途徑中從磷酸烯醇式丙 酮酸到0-乙酰高絲氨酸的催化步驟中的一系列酶的表達(dá)水平提高，從而以較高的產(chǎn)量產(chǎn) 生O-乙酰高絲氨酸，這在之前的文獻(xiàn)中并沒(méi)有提及。另外，由于終產(chǎn)物不同，本發(fā)明中應(yīng)用 的酶組合不同于用于產(chǎn)生天冬氨酸衍生的L-氨基酸(例如L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-蛋 氨酸)的酶組合。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)以最大產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸進(jìn)行了廣泛 而深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同增強(qiáng)微生物株中基因組DNA和/或質(zhì)粒形式的編碼天冬氨酸 激酶和高絲氨酸脫氫酶(thrA)以及高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metX)的基因，和編碼選自磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的 至少一種酶的基因可以使0-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)量顯著增加。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的微生物株，其經(jīng) 過(guò)設(shè)計(jì)以增強(qiáng)負(fù)責(zé)參與從磷酸烯醇式丙酮酸到0-乙酰高絲氨酸的高絲氨酸生物合成途徑 的酶的一系列基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用所述微生物株以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的 方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬 的菌株，其中在所述菌株中引入以下酶并增強(qiáng)其活性(a)高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸 激酶和高絲氨酸脫氫酶；和(b)選自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和 天冬氨酸半醛脫氫酶組成的組的至少一種酶。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在培養(yǎng)基中產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法 包括在所述培養(yǎng)基中發(fā)酵菌株。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供產(chǎn)生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括(a)發(fā)酵所述菌株從而產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸；(b)分離0-乙酰高絲氨酸；和(C)在選自由胱硫醚 Y合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶組成的組的酶存在 下，將0-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一起轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸和乙酸(acetate)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)發(fā)酵埃希氏菌屬的菌株以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高 絲氨酸，其中所述菌株以染色體DNA和/或質(zhì)粒的形式含有負(fù)責(zé)從磷酸烯醇式丙酮酸 到0-乙酰高絲氨酸的生物合成途徑的天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶(thrA)、高絲氨 酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metX)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)和 天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的所有六種基因。此外，根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人提交的發(fā)明名 禾爾為"Microorganismproducing L-methionine precursor and method of producing L-methionine andorganic acid from the L-methionine precursor，，的 W02008/013432 中的公開(kāi)，由本發(fā)明的菌株產(chǎn)生的ο-乙酰-L-高絲氨酸可以被高產(chǎn)量地轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸。


參考以下詳細(xì)說(shuō)明并結(jié)合附圖，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它目的、特 點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，在附圖中圖1為顯示本發(fā)明菌株的0-乙酰高絲氨酸生物合成途徑的示意圖；圖2為顯示用于染色體整合的pSG-2ppc載體的遺傳圖和構(gòu)建的示意圖；圖3為顯示用于染色體整合的pSG-2aspC載體的遺傳圖和構(gòu)建的示意圖；圖4為顯示用于染色體整合的pSG-2asd載體的遺傳圖和構(gòu)建的示意圖；圖5為顯示表達(dá)載體PCJ-thrA(M)-metX-CL的遺傳圖和構(gòu)建的示意圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的埃希 氏菌屬菌株，在所述菌株中引入以下酶并增強(qiáng)其活性(a)高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸 激酶和高絲氨酸脫氫酶；和(b)選自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和 天冬氨酸半醛脫氫酶組成的組的至少一種酶。本文使用的術(shù)語(yǔ)“L-蛋氨酸前體”旨在表示在蛋氨酸生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)的代謝 物或其衍生物，特別是表示0-乙酰高絲氨酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株”旨在表示可以在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生 0-乙酰高絲氨酸的原核或真核微生物，特別是表示能夠在其中累積0-乙酰高絲氨酸的經(jīng) 遺傳修飾的微生物?？捎糜诒景l(fā)明的所述株的實(shí)例包括埃希氏菌屬、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬(Providencia sp.)、棒桿菌屬、假單 胞菌屬(Pseudomonas sp·)、鉤端螺方寵體屬(Leptospira sp·)、沙門氏菌屬(Salmonellar sp.)、短桿菌屬(Brevibacteria sp. )、Hypomononas sp.、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、諾卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌和酵母，優(yōu)選埃希氏菌屬、棒桿菌屬和鉤端螺旋體屬 以及酵母。更優(yōu)選埃希氏菌屬。更優(yōu)選大腸桿菌。更優(yōu)選能夠產(chǎn)生L-賴氨酸、L-蘇氨酸、 L-異亮氨酸或L-蛋氨酸的大腸桿菌菌株。最優(yōu)選來(lái)自本申請(qǐng)的受讓人(US 12/062835)保 藏的保藏號(hào)為KCCM 10921P或KCCM10925P大腸桿菌菌株的菌株，或來(lái)自FTR2533 (保藏號(hào) 為KCCM 10541)的菌株。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“引入并增強(qiáng)……的活性”旨在表示提高由相應(yīng)基因編碼的酶的 細(xì)胞內(nèi)活性，這通常能夠通過(guò)所述基因的過(guò)表達(dá)實(shí)現(xiàn)。過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因的方法有很多。例 如，可以通過(guò)修飾目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)和/或5’-UTR內(nèi)的堿基；通過(guò)在染色體上引入目標(biāo) 基因的額外拷貝；或者通過(guò)將目標(biāo)基因與自體同源啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子相組合引入到載體 上，然后將所述載體轉(zhuǎn)化到微生物株中實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)。另外，目標(biāo)基因ORF(開(kāi)放閱讀框)內(nèi)的 突變可以引起其過(guò)表達(dá)。用數(shù)字表示，當(dāng)發(fā)生過(guò)表達(dá)時(shí)，與天然狀態(tài)的表達(dá)相比，相應(yīng)蛋白 的活性或濃度提高了 10%,25%,50%,75%,100%,150%,200%、300%、400%或 500%、 1000%或高達(dá)2000%。引入并增強(qiáng)基因活性的方法包括用攜帶相應(yīng)基因的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 增加基因拷貝量，利用針對(duì)所述基因的強(qiáng)啟動(dòng)子，或者對(duì)所述基因的現(xiàn)有啟動(dòng)子進(jìn)行突變。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供能夠以更高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸 的微生物株和利用所述微生物株產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法，其中在所述菌株中引入由 以下6種酶組成的一列酶并增強(qiáng)其活性天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶(thrA)、高絲氨 酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metX)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)和天 冬氨酸半醛脫氫酶(asd)。優(yōu)選地，通過(guò)轉(zhuǎn)化攜帶相應(yīng)基因的表達(dá)載體而向細(xì)胞中引入并 增強(qiáng)天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶(thrA)或高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metX)，同時(shí)編碼選 自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脫氫酶 (asd)的至少一種酶的基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝可以位于所述微生物株的基因組內(nèi)。最優(yōu)選， 所有這三個(gè)基因都以兩個(gè)或更多個(gè)拷貝的形式位于大腸桿菌的基因組內(nèi)。更詳細(xì)地，微生物株經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以提高編碼負(fù)責(zé)蛋氨酸生物合成途徑第一步的高絲 氨酸0-乙酰轉(zhuǎn)移酶的metX基因的水平，從而增強(qiáng)L-蛋氨酸前體0-乙酰高絲氨酸的合成。 在本文中，metX通常指編碼具有高絲氨酸0-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的基因。對(duì)于本發(fā)明 的應(yīng)用，新的外源高絲氨酸0-乙酰轉(zhuǎn)移酶可以源自多種微生物。所述可以由其獲得編碼 高絲氨酸0-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因的微生物的實(shí)例包括棒桿菌屬、鉤端螺旋體屬、奇球菌屬、 假單胞菌屬或分支桿菌屬(Mycobacterium sp.)，但并不限于此。優(yōu)選地，高絲氨酸O-乙 酰轉(zhuǎn)移酶可以由源自選自以下組的菌株的基因編碼谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、邁氏鉤端螺旋體(Leptospira meyeri)、而才福身寸奇球菌(Deinococcus radiodurans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)禾口耳止柜分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)。更優(yōu)選地，高絲氨酸0_乙酰轉(zhuǎn)移酶具有UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)Q9RVZ8 (SEQ ID NO. 18)、NP_249081(SEQ ID NO. 19)或 YP_886028 (SEQ ID NO. 20)的氨基酸序列。已知 源自邁氏鉤端螺旋體的metX基因顯示對(duì)反饋抑制的耐性(J Bacteriol. 1998Jan ； 180 (2) 250-5. Belfaiza J et al.)。在本發(fā)明的發(fā)明人此前的研究中還發(fā)現(xiàn)其他高絲氨酸0_乙 酰轉(zhuǎn)移酶對(duì)反饋抑制的耐性。 例如，可以通過(guò)引入metX或通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因的5’ -UTR和/或啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的堿基 進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)高絲氨酸0-乙酰轉(zhuǎn)移酶的引入和增強(qiáng)。優(yōu)選地，將與自體同源或異源啟動(dòng) 子組合的目標(biāo)基因插入到載體內(nèi)，然后將所述載體轉(zhuǎn)化到微生物株中。metX的引入和增強(qiáng) 引起蛋氨酸前體的合成提高。 此外，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)使所述微生物株的天冬氨酸激酶或高絲氨酸脫氫酶活性提高，從 而提高0-乙酰高絲氨酸前體高絲氨酸的合成。在本文中，thrA通常指編碼具有天冬氨 酸激酶和高絲氨酸脫氫酶活性的肽的基因。優(yōu)選所述天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶由Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AP_000666的基因編碼。優(yōu)選通過(guò)質(zhì)粒引入thrA基因，并且作為質(zhì) 粒DNA保留。也就是說(shuō)，可以將攜帶thrA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到菌株中。更優(yōu)選將metX和 thrA引入到菌株中并使其在菌株中作為質(zhì)粒DNA保留。也就是說(shuō)，可以將同時(shí)攜帶metX和 thrA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到菌株中。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，產(chǎn)生0-乙酰-L-高絲氨酸的微生物株的制備如下所示首先經(jīng)設(shè)計(jì)，通過(guò)提高分別編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶(aspC)和天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的基因的拷貝數(shù)使微生物株累積0_乙酰-L高絲 氨酸。為此，將這些基因分別克隆到用于將基因整合到染色體中的PSG載體中，然后用pSG 載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而將各基因的數(shù)量增加至2個(gè)或更多個(gè)拷貝。結(jié)果，提高了所述基因的表 達(dá)。接著，將編碼天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶(thrA)以及高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(metX) 的基因作為質(zhì)粒DNA引入到所述微生物株中。由此構(gòu)建了由thrA基因(天冬氨酸激酶和 高絲氨酸脫氫酶)、源自奇球菌的metX基因(高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶)和CJl啟動(dòng)子構(gòu)成的 thrA-metX操縱子，并將其克隆至pCL1920 (低拷貝質(zhì)粒)中，隨后將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 各所述基因(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspC)和天冬氨酸半 醛脫氫酶(asd))均具有2個(gè)拷貝的菌株中。由此，所述微生物株在從磷酸烯醇式丙酮酸至 0-乙酰高絲氨酸的生物合成途徑的每個(gè)步驟均得到改進(jìn)。如以下反應(yīng)式所示，從磷酸烯醇式丙酮酸到0-乙酰高絲氨酸的生物合成的催化 步驟由一系列酶負(fù)責(zé)。因此，所述一系列基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致0-乙酰高絲氨酸在細(xì)胞內(nèi)的累 積。磷酸烯醇式丙酮酸+H20+C02<->草酰乙酸+磷酸草酰乙酸+谷氨酸<_>天冬氨酸+a_酮戊二酸天冬氨酸+ATP<_>天冬氨酰-4-磷酸+ADP天冬氨酰-4-磷酸+NADPH<_>天冬氨酸-半醛+磷酸+NADP+天冬氨酸-半醛+NADPH<_>高絲氨酸 高絲氨酸+乙酰-CoA<->0-乙酰-高絲氨酸+CoA。 分別編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、 天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶以及高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因通常表示為PPC、aspC、 asd、thrA和metX?？梢詮囊郧肮_(kāi)的大腸桿菌和耐輻射奇球菌Rl的基因組序列中獲得 這些基因(Mol Syst Biol. 2006 ；2 2006. 0007. Epub 2006 Feb 21.，Science. 1999 Nov 19 ；286 (5444) :1571_7)。另外，也可以從公用數(shù)據(jù)庫(kù)，例如美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 ((the NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI) H^: DNA ^ig(DNA DataBank of Japan,DDBJ)構(gòu)建的公用數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得所述基因序列。例如，ppc的GenBank ID. No. 89110074，aspC 的 GenBank ID. No. 85674274，asd 的 GenBank ID. No. 89110578， thrA 的 GenBank ID. No. 89106886，metX 的 GenBank ID. No. 1799718。由此制備的微生 物株在由天冬氨酸到0-乙酰高絲氨酸的生物合成途徑中涉及的一系列催化步驟上得 到改進(jìn)，從而高產(chǎn)量地產(chǎn)生0-乙酰-L-高絲氨酸。所述產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的菌株 CJM-XPA2 (pCJ-thrA (M)-metX-CL)(命名為大腸桿菌 CA05-0567)于 2009 年 8 月 11 日保藏 在KCCM(Korean Culture of Microorganism,Eulim build,Hongje-l-Dong,Seodaemun-ku, Seoul, 361-221, Korea)，保藏號(hào)為 KCCMl 1025P。
可以以產(chǎn)生L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-異亮氨酸的菌株為基礎(chǔ)，優(yōu)選以產(chǎn)生L-蘇 氨酸的菌株為基礎(chǔ)制備產(chǎn)生L-蛋氨酸的菌株。在這種情況下，這些菌株已經(jīng)適合合成高絲 氨酸，并可以進(jìn)一步通過(guò)工程化的方式提高metX的表達(dá)，從而大量產(chǎn)生蛋氨酸前體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)L-蘇氨酸株”旨在表示能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生L-蘇氨酸的原核 或真核微生物。可用于本發(fā)明的菌株的實(shí)例包括埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、普 羅威登斯菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬或短桿菌屬，優(yōu)選埃希氏菌屬。更優(yōu)選大腸桿菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可以使用在WO 2005/075625中公開(kāi)的產(chǎn)L-蘇氨酸 株FRT2533。FTR2533源自大腸桿菌TFR7624，TFR7624來(lái)源于保藏號(hào)為KCCM10236的大 腸桿菌，而KCCM10236大腸桿菌又基于大腸桿菌TF4076。保藏號(hào)為KCCM10236的大腸桿 菌高水平表達(dá)編碼負(fù)責(zé)由PEP形成草酰乙酸的酶的ppc基因，以及編碼對(duì)從蘇氨酸到天冬 氨酸的生物合成至關(guān)重要的酶的基因(包括thrA(天冬氨酸激酶、L-高絲氨酸脫氫酶)， thrB(高絲氨酸激酶)和thrC(蘇氨酸合酶))，由此使L-蘇氨酸的產(chǎn)量提高。大腸桿菌 TFR7624(KCCM10538)攜帶失活的tyrR基因，該基因抑制生物合成L-蘇氨酸所必需的tyrB 基因的表達(dá)。大腸桿菌FTR2533(KCCM10541)為攜帶失活galR基因的產(chǎn)L-蘇氨酸大腸桿 菌菌株。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可以使用在US 12/062835公開(kāi)的CJM2-X/ pthrA (M) -CL (保藏號(hào) KCCM 10925P)。通過(guò)缺失 metB、thrB、metJ 和 metA 基因并在 metA 基 因座插入源自耐輻射奇球菌的metX基因，然后用攜帶thrA基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，從大腸桿 菌FTR2533獲得該菌株。另外，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，可以使用在US 12/062835公開(kāi)的CJM-X/ pthrA (M) -CL (保藏號(hào) KCCM 10921P)。通過(guò)缺失 metB、thrB、metJ 和 metA 基因并在 metA 基 因座插入源自耐輻射奇球菌的metX基因，然后用攜帶thrA基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，從大腸桿 菌CJM002 (保藏號(hào)KCCM10568)獲得該菌株。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，在大腸桿菌染色體內(nèi)整合了各兩個(gè)拷貝的ppc、 aspC和asd基因。為此，如圖2_4所示，構(gòu)建了用于整合相應(yīng)基因的重組質(zhì)粒，其中 圖2為pSG-2ppc，圖3為pSG-2aspC，圖4為pSG_2asd。另外，還構(gòu)建了重組表達(dá)載體 pCJ-thrA(M)-metX-CL,從而同時(shí)表達(dá)thrA和metX(圖5)。依次將重組載體pSG_2ppc、 pSG-2aspC和pSG_2asd轉(zhuǎn)化到US12/062835中公開(kāi)的thrA和metX基因得到增強(qiáng)的CJM-X/ PthrA(M)-CL菌株(保藏號(hào)KCCM 10921P)中。所述轉(zhuǎn)化菌株具有各兩個(gè)拷貝的整合至其 染色體的ppc、aspC和asd基因，命名為CJM-XPA2。用pCJ-thrA(M)-metX-CL載體轉(zhuǎn)化后， 在培養(yǎng)瓶(flask)中培養(yǎng)該突變菌株，從而定量分析0-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)生。與CJM-X/ pthrA(M)-CL(保藏號(hào)KCCM 10921P)對(duì)照相比，在其染色體中整合了各兩個(gè)拷貝ppc、aSpC、 asd基因(負(fù)責(zé)磷酸烯醇式丙酮酸到天冬氨酸的轉(zhuǎn)化)的菌株中，發(fā)現(xiàn)0-乙酰高絲氨酸的 產(chǎn)率由29. 提高至32.7%，提高了 3.6% ；在以染色體DNA或質(zhì)粒DNA的形式具有所有 ppC、aSpC、aSd、thrA和metX基因(負(fù)責(zé)從磷酸烯醇式丙酮酸至0-乙酰高絲氨酸的生物合 成途徑)的菌株中，0-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)率由29. 提高至46%，提高了 16.9%?？紤]到 僅增強(qiáng)PPc、aspC和asd基因(負(fù)責(zé)磷酸烯醇式丙酮酸到天冬氨酸的轉(zhuǎn)化)時(shí)0-乙酰高絲 氨酸的產(chǎn)率為32. 7%，以及僅增強(qiáng)thrA和metX時(shí)0-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)率為37. 5%的事 實(shí)，當(dāng)同時(shí)增強(qiáng)負(fù)責(zé)從磷酸烯醇式丙酮酸至0-乙酰高絲氨酸的整個(gè)生物合成途徑的所有基因時(shí)，0-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)率進(jìn)一步提高至46% (實(shí)施例2，表2)。因此，根據(jù)本發(fā)明制 備的菌株產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的產(chǎn)率高于野生型的對(duì)應(yīng)菌株。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的方法，所述方法包 括在培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的大腸桿菌菌株，從而在培養(yǎng)基中累積0-乙酰高 絲氨酸。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包 括(a)通過(guò)發(fā)酵本發(fā)明的產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸埃希氏菌株以產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸；(b)分 離0-乙酰高絲氨酸；和(c)在選自胱硫醚Y合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶和0-琥珀 酰高絲氨酸硫化氫解酶的轉(zhuǎn)化酶存在下，將分離的0-乙酰高絲氨酸和甲基硫醇一起轉(zhuǎn)化 為L(zhǎng)-蛋氨酸和乙酸。當(dāng)與本發(fā)明的菌株一起使用時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人的WO 2008/013432中公開(kāi)的基
于使用轉(zhuǎn)化酶(胱硫醚Y合酶、0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶或0-琥珀酰高絲氨酸硫化氫 解酶)的L-蛋氨酸生產(chǎn)方法能夠產(chǎn)生更高產(chǎn)量的L-蛋氨酸。以上制備的產(chǎn)0-乙酰-L-高絲氨酸株可以在本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解，可以根據(jù)所用菌株對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行調(diào)整。發(fā)酵可以以分 批、連續(xù)培養(yǎng)或分批補(bǔ)料的形式進(jìn)行，但并不限于此。以下參考文獻(xiàn)公開(kāi)了多種發(fā)酵方法 "Biochemical Engineering"by James Μ. Lee,Prentice-Hall International Editions, pp 138-176。培養(yǎng)基必須滿足特定菌株的培養(yǎng)條件。以下參考文獻(xiàn)中公開(kāi)了多種微生物培養(yǎng) 基"‘Manual of Methods for General Bacteriology"by the AmericanSociety for Bacteriology, Washington D. C.，USA，1981。通常，培養(yǎng)基包括多種碳源、氮源和微量元 素。碳源的實(shí)例包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；脂 肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇類，例 如甘油和乙醇；和有機(jī)酸，例如乙酸。這些碳源可以單獨(dú)或組合使用。氮源的實(shí)例包括有機(jī) 氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽膏、玉米漿(CSL)和豆粉；無(wú)機(jī)氮源，例如尿素、 硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，這些氮源可以單獨(dú)或組合使用。另外，所述培養(yǎng) 基還可以包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和/或其相應(yīng)的含鈉鹽。另外，所述培養(yǎng)基中還可以 以鹽的形式包含金屬，例如磷酸鎂或硫酸鐵。此外，還可以加入氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那?體?？梢苑峙蜻B續(xù)的方式將所述培養(yǎng)基或前體加入到培養(yǎng)物中。可以利用合適的化合物，例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸和硫酸，調(diào)整培養(yǎng)物 的PH。為了防止在培養(yǎng)物中產(chǎn)生氣泡，可以使用消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯。為了產(chǎn)生 有氧條件，可以向培養(yǎng)基中充入氧或含氧氣體(例如空氣)。培養(yǎng)基保持在20 45°C，優(yōu) 選25 40°C。將菌株培養(yǎng)至L-蛋氨酸前體的期望水平，優(yōu)選培養(yǎng)10 160小時(shí)。通過(guò)以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，但以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明而非限制本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例1 制備產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株<1-1>構(gòu)建用于ppc的染色體整合的pSG載體為了在大腸桿菌的染色體中整合ppc，構(gòu)建了 pSG-2ppc載體。從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得ppc基因的堿基序列(NCBI-gi =89110074)。在該堿基序列的基礎(chǔ)上，合成了用于擴(kuò)增ppc基因的兩對(duì)引物。一對(duì)引物(SEQ ID N0S. 1和2) 從ppc ORF的起始密碼子上游200bp開(kāi)始，并包含EcoRI和SacI的限制性酶切位點(diǎn)；另一 對(duì)引物(SEQ ID N0S. 3和4)從ppcORF的起始密碼子上游200bp開(kāi)始，并包含SacI和KpnI 的限制性酶切位點(diǎn)。當(dāng)以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板時(shí)，在高保真DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)的存在下，利用 SEQ ID N0S. 1 禾口 2 或 SEQ ID N0S. 3 禾口 4 的弓丨物 對(duì)進(jìn)行PCR，條件為96°C變性30秒、50°C退火30秒并在72°C延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)。由此獲得的PCR產(chǎn)物是分別含有EcoRI和SacI位點(diǎn)，以及SacI和KpnI位點(diǎn)的約 3. Ikb兩種ppc基因。分別使用限制性酶EcoRI和SacI，以及SacI和KpnI進(jìn)行消化后，將所擴(kuò)增的 兩種ppc基因彼此連接，并插入到用限制性酶EcoRI和KpnI處理的pSG76_C載體(J Bacteriol. 1997 Jul ；179 (13) :4426_8)中，從而構(gòu)建攜帶兩個(gè)拷貝ppc基因的重組質(zhì)粒 pSG-2ppc。圖2顯示了用于向染色體中整合兩個(gè)拷貝ppc的載體pSG-2ppc的遺傳圖和構(gòu)建。<1-2>構(gòu)建用于aspC的染色體整合的pSG載體為了在大腸桿菌的染色體中整合aspC，構(gòu)建了 pSG-2aspC載體。從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得aspC基因的堿基序列(NCBI-gi =85674274)。在該 堿基序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一對(duì)用于擴(kuò)增aspC基因引物(SEQID N0S. 5和6)，其從aspC ORF 的起始密碼子上游200bp開(kāi)始并包含限制性酶切位點(diǎn)BamHI。當(dāng)以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板時(shí)，在高保真DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)存在下，利用SEQ ID N0S. 5和6引物對(duì)進(jìn)行PCR，條件為96°C變 性30秒、50°C退火30秒并在72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。由此獲得的PCR產(chǎn)物是其中包含BamHI位點(diǎn)的約1. 5kb的aspC基因。用限制性酶BamHI消化后，將所擴(kuò)增的aspC基因連接到用同一限制性酶處理的 PSG76-C載體中，從而構(gòu)建攜帶兩個(gè)拷貝aspC基因的重組質(zhì)粒pSG-2aspC。圖3顯示了用 于向染色體中整合2個(gè)拷貝aspC的載體pSG-2aspC的遺傳圖和構(gòu)建。<1-3>用構(gòu)建于asd的染色體整合的pSG載體為了在大腸桿菌的染色體中整合asd，構(gòu)建了 pSG-2asd載體。從NIH的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得asd基因的堿基序列(NCBI-gi =89110578)。在該堿 基序列的基礎(chǔ)上，合成了用于擴(kuò)增asd基因的兩對(duì)引物一對(duì)引物(SEQ ID N0S. 7和8)從 asdORF的起始密碼子上游200bp開(kāi)始，并包含EcoRI和XbaI的限制性酶切位點(diǎn)；另一對(duì)引 物(SEQ ID N0S. 9和10)從asd ORF的起始密碼子上游200bp開(kāi)始，并包含XbaI和EcoRI 的限制性酶切位點(diǎn)。當(dāng)以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板時(shí)，在高保真DNA聚合酶 PfuUltra (Stratagene)存在下，利用 SEQ ID N0S. 7 禾口 8 或 SEQ ID N0S. 9 禾口 10 引物對(duì)進(jìn) 行PCR，條件為96°C變性30秒、50°C退火30秒并在72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。由此獲得的PCR產(chǎn)物是其中分別含有EcoRI和XbaI位點(diǎn)，以及XbaI和EcoRI位 點(diǎn)的約1.5kb的兩種asd基因。用限制性酶EcoRI和XbaI消化后，將所擴(kuò)增的asd基因彼此連接，并插入到用限制性酶EcoRI處理的PSG76-C載體中，從而構(gòu)建攜帶兩個(gè)拷貝的asd基因的重組質(zhì)粒 pSG-2asd。圖4顯示了用于向染色體中整合2個(gè)拷貝的asd的載體pSG-2asd的遺傳圖和 構(gòu)建。<1-4> 構(gòu)建用于表達(dá) ThrA 和 MetX 的重組 pCJ-thrA (M) -metX-CL為了生物合成0-乙酰高絲氨酸，通過(guò)弓丨入攜帶thrA和metX基因的重組表達(dá)載體 增強(qiáng)所述基因。從NIH GenBank獲得metX基因的核苷酸序列(NCBI gi =1799718) 在該核苷酸 序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)一對(duì)引物(SEQ ID N0S. 11和12)，其包含從ATG至TAAWmetX ORF，并 在其兩端均具有限制性酶切位點(diǎn)Hindlll。在高保真DNA聚合酶存在下，利用引物SEQ ID N0S. 11和12進(jìn)行PCR，條件為96 °C 變性30秒、50°C退火30秒并在72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)，其中，耐輻射奇球菌Rl的染 色體DNA作為模板。由此獲得的PCR產(chǎn)物是含有限制性酶位點(diǎn)HindIII的約Ikb的metX基因。用限制性酶HindIII消化后，將所擴(kuò)增的metX基因連接到US12/062835中公開(kāi)的 thrA表達(dá)載體pCJ-thrA(M)-CL質(zhì)粒(預(yù)先用同一限制性酶進(jìn)行處理)中，從而構(gòu)建攜帶 thrA和metX的重組表達(dá)載體(命名為pCJ-thrA (M)-metX_CL，圖5)。<1-5>制備產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸株將在實(shí)施例<1_1>中構(gòu)建的攜帶兩個(gè)拷貝ppc基因的質(zhì)粒pSG-2ppc轉(zhuǎn)化到 US12/062835 中公開(kāi)的菌株 CJM_X/pthrA(M)-CL(保藏號(hào) KCCM 10921P)中，然后在 LB-Cm平 板(酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯霉素25 μ g/L)上進(jìn)行培養(yǎng)，針對(duì)每 個(gè)轉(zhuǎn)化體選擇10個(gè)氯霉素抗性克隆。所選轉(zhuǎn)化體在其染色體的ppc位點(diǎn)處插入pSG-2ppc 載體。然后，利用攜帶限制性酶I-SceI的表達(dá)載體pASc印轉(zhuǎn)化其中插入兩個(gè)拷貝ppc基 因的菌株，以便切割PSG載體中存在的I-SceI位點(diǎn)，然后在LB-Ap (酵母提取物10g/L、NaCl 58/1、胰蛋白胨1(^/1、氨芐青霉素10(^8/1)上進(jìn)行篩選。結(jié)果，選出的是其染色體上插入 2個(gè)拷貝ppc基因并已經(jīng)從其中除去PSG76-C載體的菌株。針對(duì)實(shí)施例<1_2>和<1_3>中 分別構(gòu)建的pSG76C-2aspC和pSG76C_2asd，重復(fù)與pSG_2ppc質(zhì)粒相同的步驟。最后，將源 自CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏號(hào)10921P)的具有插入到其染色體的ppc、asd和aspC各兩個(gè) 拷貝的菌株命名為CJM-XPA2。此外，用在實(shí)施例<1_4>中構(gòu)建的pCJ-thrA(M)-metX-CL載體轉(zhuǎn)化CJM-XPA2菌 株，然后在LB-Sp (酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、胰蛋白胨10g/L、壯觀霉素25 μ g/L) 上培養(yǎng)，選出10個(gè)具有壯觀霉素耐性的克隆。所述CJM-XPA2 (pCJ-thrA (M) -metX-CL) (命名為大腸桿菌CA05-0567)于2009年8月11日保藏在KCCM(Korean Culture of Microorganism, Eulim build, Hongje-l-Dong, Seodaemun-ku, Seoul,361-221, Korea),保 藏號(hào)為KCCM11025P。對(duì)其產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸的能力進(jìn)行相互比較。實(shí)施例2 發(fā)酵產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸為了檢測(cè)實(shí)施例1中制備的菌株產(chǎn)生蛋氨酸前體0-乙酰高絲氨酸的能力，在錐形 瓶中培養(yǎng)這些菌株。對(duì)于該培養(yǎng)，使用表1中所示的0-乙酰高絲氨酸滴定培養(yǎng)基(titermedium)。表 1
用于生產(chǎn)0-乙酰高絲氨酸的培養(yǎng)基成分
權(quán)利要求
1.一種埃希氏菌屬的菌株，其能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生0-乙酰高絲氨酸，其中在所述菌株中 引入以下酶并增強(qiáng)了酶的活性(a)高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶；和(b)選自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸半醛脫氫酶組 成的組中的至少一種酶。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中通過(guò)使用攜帶相應(yīng)基因的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化、通過(guò)提高 相應(yīng)基因的拷貝數(shù)、通過(guò)利用相應(yīng)基因的強(qiáng)啟動(dòng)子或者通過(guò)對(duì)相應(yīng)基因的已有啟動(dòng)子進(jìn)行 突變，來(lái)實(shí)現(xiàn)所述引入和活性的增強(qiáng)。
3.如權(quán)利要求2所述的菌株，其中通過(guò)引入攜帶metX和thrA基因的質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)高絲氨 酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的引入和其活性的增強(qiáng)。
4.如權(quán)利要求3所述的菌株，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移 酶和天冬氨酸半醛脫氫酶各自由相應(yīng)的基因編碼，其中各個(gè)所述相應(yīng)的基因以兩個(gè)或更多 個(gè)拷貝位于所述菌株的基因組中。
5.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶和高絲氨 酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸半醛脫氫酶各個(gè)酶 由來(lái)自大腸桿菌的相應(yīng)基因metX、thrA、ppc、aspC和asd編碼。
6.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶源自于選自棒桿菌屬、鉤 端螺旋體屬、奇球菌屬、假單胞菌屬和分支桿菌屬的微生物。
7.如權(quán)利要求6所述的菌株，其中所述高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶源自于選自谷氨酸棒桿 菌、邁氏鉤端螺旋體、耐輻射奇球菌、銅綠假單胞菌和恥垢分枝桿菌的微生物。
8.如權(quán)利要求7所述的菌株，其中所述高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶具有SEQIDN0. 18、19或 20的氨基酸序列或其部分序列。
9.如權(quán)利要求1所述的菌株，其中所述高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶具有源自耐輻射奇球菌 Q9RVZ8的氨基酸序列或其部分序列。
10.如權(quán)利要求1所述的菌株，其源自能夠產(chǎn)生L-蘇氨酸、L-異亮氨酸或L-賴氨酸的 菌株。
11.如權(quán)利要求1所述的菌株，其屬于大腸桿菌。
12.如權(quán)利要求1所述的菌株，其源自大腸桿菌CJM-X/pthrA(M)-CL(保藏號(hào)KCCM 10921P)。
13.如權(quán)利要求1所述的菌株，其源自大腸桿菌CJM2-X/pthrA(M)-CL(保藏號(hào)KCCM 10925P)。
14.如權(quán)利要求1所述的菌株，其源自大腸桿菌FTR2533(保藏號(hào)KCCM10541)。
15.如權(quán)利要求1所述的菌株，其以保藏號(hào)KCCM11025P被保藏。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的埃希氏菌屬的菌株，在所述菌株中引入以下酶并增強(qiáng)其活性高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶；以及選自由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸半醛脫氫酶組成的組的至少一種酶。此外，本發(fā)明還提供了利用所述菌株產(chǎn)生O-乙酰高絲氨酸的方法。
文檔編號(hào)C12R1/185GK102002473SQ20101014490
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者全成后, 孫晟光, 徐昌一, 李漢珍, 李相穆, 申容旭, 羅光鎬, 許仁庚, 金朱恩, 金素影, 金賢雅 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社