專利名稱：Hbv反義抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)并從而治療疾病的反義寡核苷酸，特別是用于治療動物(包括人類)的こ型肝炎病毒(HBV)和こ型肝炎病毒相關(guān)病癥的反義寡聚體。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于治療動物的HBV的具有修飾的核苷的反義寡聚體，更具體地，所述反義寡聚體包含具有2' 0-4' C-亞甲基橋接的糖類的核苷和具有本文另外所述的其它橋接的糖類的核苷，也稱作鎖定的核酸(LNA)，其用于治療動物的HBV，更具體地，用于治療人類的HBV。
背景技術(shù)：
こ型肝炎是腸胃外地(通過污染物，諸如血液和血液制品、污染的針頭)、性地傳播 的病毒病，并從受感染的或攜帯者母體垂直傳播給她們的后代。在世界上該疾病通常是垂直傳播的那些地區(qū)中，在低年齡時(shí)產(chǎn)生高比例的受感染個(gè)體，變成こ型肝炎的慢性攜帯者。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，世界上超過20億人已經(jīng)被感染，毎年有約400萬急性病例，毎年有100萬人死亡，有3. 5-4億慢性攜帯者。大約25%的攜帯者死于慢性肝炎、肝硬化或肝癌，幾乎75%的慢性攜帯者是亞洲人。こ型肝炎病毒是僅次于煙草的第二最重要的致癌物，造成所有原發(fā)性肝癌中的60%-80%。HBV的傳染性是HIV的100倍。こ型肝炎病毒感染是ー個(gè)持續(xù)的醫(yī)學(xué)問題，這是因?yàn)?，象任何快速?fù)制的傳染物一祥，存在持續(xù)的突變，所述突變幫助HBV的一些亞群變成耐受現(xiàn)有的治療方案。在目前，沒有用于治療受到HBV感染的人的有效治療劑，它們在體內(nèi)產(chǎn)生對病毒的血清轉(zhuǎn)換，或它們在遭受こ型肝炎病毒感染的人中實(shí)現(xiàn)抗原的90%減少(與治療之前的基線數(shù)目相比)。目前，美國肝臟病研究協(xié)會(AASLD)和歐洲肝臟研究協(xié)會(EASL)推薦的慢性HBV感染的治療劑包括干擾素a (INF α )、聚こニ醇化的干擾素a _2a (Peg_IFN2a)、恩替卡韋和替諾福韋。但是，典型的干擾素療法是48周，并產(chǎn)生嚴(yán)重的且使人厭惡的副作用，且在已經(jīng)停止治療以后24周，HBeAg血清轉(zhuǎn)換范圍是僅27_36%。HBsAg的血清轉(zhuǎn)換甚至更低——在治療停止以后立即觀察到僅3%，在5年后向上增加至12%。核苷和核苷酸治療劑恩替卡韋和替諾福韋可成功地減少病毒載量，但是HBeAg血清轉(zhuǎn)換率和HBsAg損失率甚至低于使用IFNa治療劑得到的相應(yīng)值。也使用其它類似的治療劑，包括拉米夫定(3TC)、替比夫定(LdT)和阿德福韋，但是對于核苷/核苷酸治療劑，一般而言，抗藥性的出現(xiàn)會限制治療效果。因而，本領(lǐng)域需要發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的抗病毒治療劑。更具體地，需要新的抗-HBV治療劑，其能夠增加HBeAg和HBsAg血清轉(zhuǎn)換率。這些血清標(biāo)志物會指示HBV感染的免疫學(xué)控制，并導(dǎo)致提高的預(yù)后，即肝病的預(yù)防和向肝硬化的進(jìn)展、肝衰竭的預(yù)防、肝細(xì)胞癌(HCC)的預(yù)防、肝病有關(guān)的移植的預(yù)防和死亡的預(yù)防。最近的臨床研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)換與HBeAg的降低(Fried等人(2008)Hepatology 47:428)和 HBsAg 的降低(Moucari 等人(2009) Hepatology 49:1151)之間的關(guān)聯(lián)。抗原水平的降低可能已經(jīng)允許HBV感染的免疫學(xué)控制，因?yàn)檎J(rèn)為高水平的抗原會誘發(fā)免疫耐受性。目前用于HBV的核苷療法能夠急劇降低HBV的血清水平，但是對HBeAg和HBsAg水平幾乎沒有影響。反義療法與核苷療法的差別在于，它可以直接地靶向抗原的轉(zhuǎn)錄物，從而降低血清HBeAg和HBsAg水平。因?yàn)樵贖BV感染后產(chǎn)生多個(gè)重疊的轉(zhuǎn)錄物，也存在單個(gè)反義寡聚體減少HBV DNA (除了 HBeAg和HBsAg 二者以外)的機(jī)會。反義療法是遺傳障礙或感染的一種治療形式。當(dāng)已知特定基因的遺傳序列是特別疾病的原因時(shí)，無論所述基因是原始哺乳動物基因、癌基因，還是來自傳染性生物體的基因(諸如來自細(xì)菌物種的基因、來自真菌的基因、來自寄生物的基因或來自病毒的基因)，可能合成核酸(DNA、RNA或化學(xué)類似物)的鏈，所述鏈會結(jié)合由所述基因產(chǎn)生的信使RNA (mRNA)并滅活它，從而有效地將該基因“關(guān)閉”。這是因?yàn)?，mRNA必須單鏈化才能被翻譯?；蛘撸鲦溈赡馨邢蚪Y(jié)合前-mRNA上的剪接位點(diǎn)，并修飾mRNA的外顯子內(nèi)容物[I]。如果具有相同序列(例外是，RNA中的U對應(yīng)DNA中的T)的RNA形式被翻譯成或可翻譯成蛋白，DNA單鏈序列經(jīng)常被稱作有義鏈(或正(+ )義鏈)，互補(bǔ)鏈被稱作反義鏈(或負(fù)(_)義鏈)。 在DNA雙鏈內(nèi)的有些區(qū)域編碼基因(它們經(jīng)常是指定表達(dá)的或翻譯的蛋白中的氨基酸次序的指令)以及調(diào)節(jié)序列、剪接位點(diǎn)、非編碼內(nèi)含子和其它區(qū)域。對于要表達(dá)由DNA編碼的蛋白的細(xì)胞，DNA的一條鏈充當(dāng)用于合成RNA的互補(bǔ)鏈的模板。模板DNA鏈被稱作轉(zhuǎn)錄鏈，它的序列與mRNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)或成反義，其具有與原始雙鏈DNA的有義序列相同的序列。因?yàn)镈NA是雙鏈的，與反義序列互補(bǔ)的鏈被稱作非轉(zhuǎn)錄鏈或有義鏈，且具有與mRNA轉(zhuǎn)錄物相同的序列(例外是，DNA序列中的T核苷堿基被RNA序列中的U核苷堿基替代)。與從DNA轉(zhuǎn)錄的RNA互補(bǔ)的核酸被稱作“反義”寡核苷酸，因?yàn)樗膲A基序列與基因的信使RNA (mRNA，S卩“有義”序列)互補(bǔ)。因而，具有5’-AAGGTC-3’的有義序列的DNA編碼區(qū)會被轉(zhuǎn)錄生成具有5’ -AAGGUC-3’的有義序列的mRNA，所以所述有義序列的反義寡聚體會具有序列3’ -UUCCAG-5’(如果它包含RNA核苷堿基)或3’_TTCCAG_5’(如果所述反義寡聚體包含DNA核苷堿基)。目前，反義療法的主要焦點(diǎn)涉及長度為大約20個(gè)核苷酸/核苷的寡聚體或寡核苷酸的應(yīng)用，所述寡聚體或寡核苷酸合成為與負(fù)責(zé)靶蛋白的表達(dá)或翻譯的特定“有義”(5’至3’方向)DNA或mRNA序列互補(bǔ)。在導(dǎo)入細(xì)胞中以后，所述反義寡核苷酸會通過Watson-Crick結(jié)合與它的對應(yīng)mRNA序列雜交，形成異源雙鏈體。形成雙鏈體以后，由結(jié)合的mRNA的序列編碼的蛋白的翻譯受到抑制。存在寡核苷酸/mRNA雙鏈體阻礙后續(xù)翻譯的幾種機(jī)理。幾種不同的反義劑的被最廣泛地接受的解釋涉及涉及遍在酶RNA酶H對異源雙鏈體中的mRNA的降解。RNA酶H被吸引至異源雙鏈體，并切割結(jié)合的mRNA，同時(shí)保持寡核苷酸序列完整，這允許所述寡核苷酸繼續(xù)尋找和結(jié)合對應(yīng)的mRNA序列。通過反義療法(其可以單獨(dú)地發(fā)生，或與RNA酶H活性結(jié)合地發(fā)生)實(shí)現(xiàn)的翻譯抑制的一些其它被接受的解釋包括、但不限于阻斷適當(dāng)?shù)暮颂求w裝配(這使得核糖體復(fù)合物失去翻譯能力)、阻斷RNA剪接和/或阻礙mRNA的適當(dāng)輸出。被生物體用于控制基因表達(dá)(通過限制翻譯)的表面上単獨(dú)的方式稱作基因干擾，其涉及“沉默”祀基因的短RNA序列的采用。這些短RNA序列稱作小干擾RNA或siRNA。RNA干擾是ー個(gè)古老的遺傳過程，其中可以關(guān)閉靶向的基因，即生產(chǎn)某些蛋白的“藍(lán)圖”。已知稱作Dicer的酶在RNA干擾中起關(guān)鍵作用。Dicer是ー種核糖核酸酶,其識別雙鏈RNA分子，并將它們切割成約20-25個(gè)核苷酸長的短dsRNA，所述短dsRNA通常具有在3’末端上的雙堿基突出端。由Dicer產(chǎn)生的小dsRNA片段然后同化成大多蛋白復(fù)合物，它們引導(dǎo)dsRNA分子到達(dá)細(xì)胞中的目標(biāo)地，在這里它們結(jié)合它們的靶mRNA序列并關(guān)閉基因。該復(fù)合物稱作RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。RISC具有ー種催化組分argonaute，它是在mRNA的序列與siRNA引導(dǎo)鏈的序列互補(bǔ)的情況下能夠降解信使RNA (mRNA)的內(nèi)切核酸酶。因此，Dicer、RISC和siRNA基因沉默系統(tǒng)是許多基礎(chǔ)性的生物學(xué)事件的必需步驟，所述事件包括基因組重排、干細(xì)胞分化、腦發(fā)育和病毒防御。令人感興趣地，已經(jīng)確定，小dsRNA (siRNA)的大小是它們的功能的決定因素。如果dsRNA太大或太小，它們使它不能進(jìn)入RISC復(fù)合物中，所以不會發(fā)生基因沉默。反義寡聚體與siRNA的差別在于幾個(gè)方面，最重要的是，反義寡聚體是單鏈的。它們也是合成的，通常沿著磷酸酯主鏈被修飾，且經(jīng)常在選定的核苷堿基位置中。在反義療法領(lǐng)域，化學(xué)修飾的核苷向核酸分子中、特別是向核糖核酸分子(RNA)中 的導(dǎo)入，會提供克服外源地遞送的天然RNA或DNA分子固有的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用度的潛在限制的有力工具。例如，化學(xué)修飾的核酸分子的應(yīng)用，可以使更低劑量的特定核酸分子實(shí)現(xiàn)給定的治療效果，因?yàn)榛瘜W(xué)修飾的核酸分子傾向于具有更長的血清半衰期。此外，某些化學(xué)修飾可以提高核酸分子的生物利用度，這通過靶向特定細(xì)胞或組織和/或提高核酸分子的細(xì)胞攝取來實(shí)現(xiàn)。因此，即使化學(xué)修飾的核酸分子的活性比天然核酸分子降低(例如當(dāng)與所有RNA核酸分子相比較時(shí))，由于提高的分子穩(wěn)定性和/或遞送，修飾的核酸分子的總活性可以大于天然分子。ー種有用的化學(xué)修飾稱作鎖定的核酸(LNA)，其會在ー個(gè)或多個(gè)RNA或DNA核苷部分處導(dǎo)入2' 0-4' C-亞烷基橋，其中所述亞烷基橋是C^6亞烷基橋，更具體地是2' 0-4; C-亞甲基橋。在被宿主細(xì)胞攝取以后，當(dāng)LNA摻入反義RNA或DNA寡聚體中吋，已經(jīng)證實(shí)，它們會極大地增加反義RNA或DNA分子的穩(wěn)定性，并從而極大地增加反義RNA或DNA的生物利用度?？梢詫?dǎo)入反義RNA或DNA寡聚體中來增加反義寡聚體的穩(wěn)定性和生物利用度的其它有用的化學(xué)修飾包括硫代磷酸酯鍵或磷酸三酯鍵，它們?nèi)〈鷨蝹€(gè)RNA或DNA核苷酸之間的天然存在的磷酸ニ酯鍵。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的RNA或DNA寡聚體或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或酯以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑，所述RNA或DNA寡聚體與通過引用并入本文中的下述DNA序列的對應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物基本上互補(bǔ)CCTGC了GGTGGCTCCAGTTC (SEQ ID NO: 1};
AGAGTCTAGACTCGTGGTGGAOTCTCTCAATTTTCTAGGGG (SEQ ID N0:2);TCGATGTGTCTGCGGCGmTATCA了 (SEQ ID NO: 3|
CATCCTGC了GCTATGCCTCA了CTTCTT {SEQ ID NO: 4): CAAGGTATGTTGCCCGT {SEQ
ID NO: 5}: TGTATTCCCATCCCATC (SEQ ID NO; 6); CCTATGGGAGTGGGCCTCAG (SEQID NO: 7): TGGCICAGTTTACTAGTGC (SEQ ID NO: 8) GGGCTTTCCCCCACTGT {SEQID NO: 9} TCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT (SEQ ID NO: 10)；CGCACCTCTCTTTACGCGG (SEQ ID NO: 11); GGAGTGTGGATTCGCAC iSEQ ID NO
12}: if GAAGAAGAACTCCCTCGCCT (SEQ 丨D NO: 13};其中所述反義 RNA 或 DNA 分子包含多個(gè)修飾的核苷和/或核苷酸。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了ー種藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的RNA或DNA寡聚體或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或酯以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑，所述RNA或DNA寡聚體與通過引用并入本文中的下述DNA序列的對應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物基本上互補(bǔ)
GAGAGAAGTCCACCAC (SEQ ID NO: 14) TGAGAGAAGTCCACCA (SEQ tD NO:15)GAGGCATAGCAGCAGG (SEQ ID NO: 16): TGAGGCATAGCAGCAG (SEQ ID NO: 17);GATGAGGCATAGCAGC {SEQ ID NO: 18) GATGGGATGGGAATAC (SEQ ID NO: 19};GGCCCACTCXCATAGG <SEQ ID NO 20)； AGGCCCACTCCCATAG {SEQ ID NO 21);或
CTGAGGCCCACTCCCA (SEQ ID NO; 22);其中所述反義RNA或DNA分子包含多個(gè)修飾的核苷和/或核苷酸。一個(gè)實(shí)施方案提供了一種反義寡聚體或其鹽、溶劑化物、水合物或酷，其用于減少哺乳動物細(xì)胞或生物體中的こ型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反義寡聚體是長度為10-26個(gè)核苷的連續(xù)序列，且具有如式I所示的序列
5’ -LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-N1-P-LNAr-P-LNArS,(式 I)
其中LNA是鎖定的核酸；P是選自下述的核苷間連接磷酸ニ酷、磷酸三酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、H-膦酸酯或烷基膦酸酯連接，所述連接是在LNA和鄰近的N之間，或在N和鄰近的N之間，或在N和鄰近的LNA之間，或在LNA和鄰近的LNA之間，從式(I)序列的5’至3’方向；且其中N選自G、C、A、T、U或Z核苷單元；n和r和p和q各自獨(dú)立地是選自1、2或3的整數(shù)；1和m各自獨(dú)立地是1-22的整數(shù)；且
其中Z選自肌苷、N7-甲基肌苷、N7-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黃苷、ニ氫尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脫氮鳥苷、7-乙基-7-脫氮鳥苷、N4-甲基胞苷、N4-こ基胞苷。特定實(shí)施方案提供了如本文所述的反義寡聚體，其中所述寡聚體的至少4個(gè)核苷單元可以是LNA單元。在有些實(shí)施方案中，所述LNA是具有2' -O-烷基-4' C連接的鎖定的核酸単元，其中所述烷基可以是取代的或未取代的C^6烷基。在其它實(shí)施方案中，至少2個(gè)在連續(xù)核苷序列的核苷單元之間存在的核苷間連接是硫代磷酸酯核苷間連接。在ー些有關(guān)的實(shí)施方案中，在反義寡聚體的連續(xù)核苷序列的核苷單元之間存在的所有核苷間連接都可以是硫代磷酸酯核苷間連接。
在ー些具體的實(shí)施方案中，η、P、r和q各自獨(dú)立地是1或2，且I和m各自獨(dú)立地是2、3、4、5或6，且在ー些具體的實(shí)施方案中，n、p、r和q各自獨(dú)立地是1，且I和m各自獨(dú)立地是6。在其它具體的實(shí)施方案中，提供了一種反義寡核苷酸，其中所述序列可以是SEQ ID NO 14、16、16 或 20 中的任ー個(gè)。在具體實(shí)施方案中，上述的反義寡聚體可以與SEQ ID NO. 1_13中的任ー個(gè)基本上互補(bǔ)，且所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒，且所述細(xì)胞或生物體可以是人。在有關(guān)的具體實(shí)施方案中，所述こ型肝炎病毒可以是人地理學(xué)基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D (地中海地區(qū)、中東、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。在具體實(shí)施方案中，上述的反義寡聚體可以具有與SEQ ID NO. 14_22中的任ー個(gè)基本上互補(bǔ)的序列，且所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒且所述細(xì)胞或生物體可以是人。在有關(guān)的具體實(shí)施方案中，所述こ型肝炎病毒可以是人地理學(xué)基因型中的任ー種A(歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D (地中海地區(qū)、中東、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。ー個(gè)具體的實(shí)施方案提供了ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染的藥物制劑，其包含有效量的如上所述的任意核酸反義寡聚體或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑。這樣的藥物制劑的反義寡聚體可以與SEQ ID NO:1-13中的任ー個(gè)基本上互補(bǔ)，或可以具有與SEQ ID NO 14-22中的任ー個(gè)基本上互補(bǔ)的序列，且可以另外包含藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案提供了ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關(guān)病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的任意藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而治療所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關(guān)病癥。在有關(guān)的實(shí)施方案中，所述哺乳動物是人，所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關(guān)病癥是來自人こ型肝炎病毒的こ型肝炎病毒感染。更具體地，所述人こ型肝炎病毒可以是人地理學(xué)基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南);D (地中海地區(qū)、中東、印度);E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。
有關(guān)的實(shí)施方案提供了ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關(guān)病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的任意藥物組合物施用給如上所述的有此需要的哺乳動物，其中所述人こ型肝炎病毒相關(guān)病癥可以是黃疸、肝癌、肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭、彌散性肝細(xì)胞炎性疾病、噬血細(xì)胞綜合征或血清性肝炎。在有關(guān)的實(shí)施方案中，所述方法可以另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進(jìn)行。在其它有關(guān)的實(shí)施方案中，所述額外治療劑可以是HBV劑、HCV劑、化學(xué)治療劑、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑或免疫抑制劑。
在特別有關(guān)的實(shí)施方案中，所述額外HBV劑可以是干擾素a-2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-Ι (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復(fù)制抑制劑；第二種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預(yù)防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋(ETV);富馬酸替諾福韋雙索酯(TDF);替比夫定(LdT);阿德福韋；或HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。在其它特別有關(guān)的實(shí)施方案中，所述額外HCV劑可以是干擾素a _2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的);利巴韋林；HCV RNA復(fù)制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列)；HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；或HCV單克隆或多克隆抗體治療劑。另ー個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBVDNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的藥物組合物施 用給有此需要的哺乳動物，從而與治療之前哺乳動物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原。在有些實(shí)施方案中，所述哺乳動物可以是人，所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒。更具體地，所述人こ型肝炎病毒可以是人地理學(xué)基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C(東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南);D (地中海地區(qū)、中東、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亞);G (美國、法國)；或H (中美洲)。在具體實(shí)施方案中，提供了一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBV DNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而與治療之前哺乳動物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原，其中與施用反義寡聚體之前的量相比，DNA的量減少了 90%。在有關(guān)的方法中，所述HBV抗原可以是HBsAg，或可以是HBeAg，更具體地，可以充分地減少HBV抗原的量以導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)換，所述血清轉(zhuǎn)換定義為血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在(如果監(jiān)測HBeAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子)，或者定義為血清HBsAg不存在(如果監(jiān)測HBsAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子)，所述存在和不存在由商業(yè)ELISA系統(tǒng)的目前可得到的檢測限確定。在更具體的實(shí)施方案中，如上所述的方法可以另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進(jìn)行。在特別有關(guān)的實(shí)施方案中，所述額外治療劑可以是HBV劑、HCV劑、化學(xué)治療劑、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑和免疫抑制齊U。在更特別有關(guān)的實(shí)施方案中，所述額外HBV劑可以是干擾素a-2b、干擾素a_2a和干擾素alphacon-Ι (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復(fù)制抑制劑；第ニ種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預(yù)防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋；或HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)，且所述額外HCV劑可以是干擾素a-2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復(fù)制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列);HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；或HCV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。另ー個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于促進(jìn)受HBV感染的哺乳動物的こ型肝炎病毒的血清轉(zhuǎn)換的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的藥物組合物施用給受こ型肝炎感染的哺乳動物；監(jiān)測HBeAg + HBeAb在哺乳動物血清樣品中的存在，或監(jiān)測HBsAg在哺乳動物血清樣品中的存在，以致于血清樣品中HBeAg的不存在+ HbeAb的存在(如果監(jiān)測HBeAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子)或血清樣品中HBsAg的不存在(如果監(jiān)測HBsAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子)(所述存在和不存在由商業(yè)ELISA系統(tǒng)的目前檢測限確定)，指示哺乳動物的血清轉(zhuǎn)換。對于本文所述的任意實(shí)施方案，所述實(shí)施方案提供了一種治療こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關(guān)病癥的方法、一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBVDNA的量和HBV抗原的量的方法或一種用于促進(jìn)受HBV感染的哺乳動物的こ型肝炎病毒的血清轉(zhuǎn)換的方法，其中所述方法包括施用本文所述的反義寡聚體、施用反義寡聚體，無論是單獨(dú)地還是組合地，也無論存在于藥物制劑中還是簡單地存在于稀釋劑中，所述施用可以是ロ服的、□腔的、直腸的、腸胃外的、腹膜內(nèi)的、真皮內(nèi)的、透皮的或氣管內(nèi)的給藥。


通過參照下面的詳細(xì)描述，并參照附圖，可以更容易地理解本發(fā)明的前述特征，在附圖中
圖I是HBV感染的自然史的簡圖。圖2是被視作HBeAg陽性的具有代償疾病的HBV患者的簡圖。圖3是被視作HBeAg陰性的具有代償疾病的HBV患者的簡圖。圖4是HBV轉(zhuǎn)錄的示意圖，它顯示了由HBV基因組編碼的主要轉(zhuǎn)錄物(包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依賴性的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶活性)、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴)、轉(zhuǎn)錄物的相對長度以及大、中和小S蛋白轉(zhuǎn)錄物的重疊區(qū)。也指示了 HBV DNA的+和-鏈。圖5顯示了對比來自HBV的多個(gè)基因型的基因組DNA的序列之間的同一性百分比的計(jì)算生物學(xué)分析，其按照HBV基因組區(qū)域進(jìn)行繪制。圖6是已經(jīng)鑒別出的不同HBV地理學(xué)基因型的表。具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述
定義.如在本說明書和附隨的權(quán)利要求書中所使用的，下述術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有指出的含義，除非上下文另有要求
本文使用的術(shù)語“有效量”是指，包括核酸寡聚體的藥物或藥品或藥劑的量，其會引起組織、系統(tǒng)、動物或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答，所述應(yīng)答是例如研究人員或臨床醫(yī)師所追求的。此外，術(shù)語“治療有效量”是指，與尚未接受這樣的量的對應(yīng)受試者相比，導(dǎo)致下述效果的任意量改善的治療，愈合，預(yù)防或改善疾病、障礙或副作用，或疾病或障礙的進(jìn)展速率降低。該術(shù)語在它的范圍內(nèi)也包括有效地增強(qiáng)正常生理功能的量。本文使用的術(shù)語“基本上互補(bǔ)”是指，使用標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基對A_T、A_U和G-C，所述反義寡聚體序列具有與它的靶有義序列完全互補(bǔ)的序列。另外，術(shù)語基本上互補(bǔ)包括使用非標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基對，反義寡聚體序列與它的靶有義序列完全互補(bǔ)，所述非標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基對包括、但不限于G:U、I:U、I:A、I:C、X:A、X:C、R:C、R:T、R:U、m7I:U、m7I-A、m7I:C、m7G:U、m7G:C、m5U:A、5-FU:A、5-FT:A、m5C:G、D:A、Ψ:Α 和 Ψ :C0本文使用的G是鳥苷，I是肌苷，A是腺苷，C是胞苷，U是尿苷，T是胸苷，X是黃苷，R是利巴韋林，m7G是N7-甲基鳥苷，m7I是N7-甲基肌苷，5FU是5-氟尿苷，5FT是5-氟胸苷，D是ニ氫尿苷，m5U是5-甲基尿苷，m5C是5-甲基胞苷，和Ψ是假尿苷。術(shù)語“基本上互補(bǔ)”也包括這樣的反義寡聚體其在序列中具有ー個(gè)或多個(gè)合成的核苷堿基，所述核苷堿基表現(xiàn)出與DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷堿基的假互補(bǔ)性。導(dǎo)致與天然核酸序列的假互補(bǔ)性的核苷堿基的實(shí)例包括2_氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷(nA)、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷(sT)、7-烷基-7-脫氮鳥嘌呤或7-烷基-7脫氮鳥苷(7al-7daG)和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷(N4_alC ;其中烷基=甲基或こ基)。非Watson-Crick堿基對nA:T和A: sT是穩(wěn)定的堿基對，7-烷基-7-脫氮鳥嘌呤與C配對(7al-7daG:C)以及N4-烷基胞嘧啶與G配對(N4_alC:G)也是穩(wěn)定的。當(dāng)所有4個(gè)合成的核苷堿基nA、sT、7al-7daG和N4_alC都摻入給定的ASO中時(shí)，得到的ASO序列在很大程度上沒有ニ級結(jié)構(gòu)，且會結(jié)合具有假互補(bǔ)性的靶核酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，ー個(gè)或 多個(gè)合成的核苷堿基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之間產(chǎn)生ー個(gè)或多個(gè)非Watson-Crick “假互補(bǔ)的”堿基對。應(yīng)當(dāng)理解，具有ー個(gè)或多個(gè)假互補(bǔ)的堿基從而與靶核酸序列上的核苷堿基形成一個(gè)或多個(gè)假堿基對的AS0，被視作與靶核酸序列基本上互補(bǔ)。術(shù)語“基本上”，諸如當(dāng)用于短語“基本上具有SEQ ID NO X的序列的寡核苷”中吋，在本文中用于表示，可以與書寫的SEQ ID NO X的互補(bǔ)序列堿基配對的任意序列，但是其可以在序列中含有ー個(gè)或多個(gè)合成的核苷堿基，所述核苷堿基表現(xiàn)出與DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷堿基的假互補(bǔ)性。導(dǎo)致與天然核酸序列的假互補(bǔ)性的核苷堿基的實(shí)例包括2_氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷(nA)、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷(sT)、7_烷基-7-脫氮鳥嘌呤或7-烷基-7脫氮鳥苷(7al-7daG)和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷(N4-alC ;其中烷基=甲基或こ基)。非Watson-Crick堿基對nA:T和A: sT是穩(wěn)定的堿基對，7-烷基-7-脫氮鳥嘌呤與C配對(7al-7daG:C)以及N4-烷基胞嘧啶與G配對(N4_alC:G)也是穩(wěn)定的。當(dāng)所有4個(gè)合成的核苷堿基nA、sT、7al-7daG和N4_alC都摻入給定的ASO中時(shí)，得到的ASO序列在很大程度上沒有ニ級結(jié)構(gòu)，且會結(jié)合具有假互補(bǔ)性的靶核酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，ー個(gè)或多個(gè)合成的核苷堿基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之間產(chǎn)生ー個(gè)或多個(gè)非Watson-Crick “假互補(bǔ)的”堿基對。應(yīng)當(dāng)理解，具有ー個(gè)或多個(gè)假互補(bǔ)的堿基從而與靶核酸序列上的核苷堿基形成一個(gè)或多個(gè)假堿基對的AS0，被視作基本上具有書寫的SEQ ID NO X的序列，其針對給定的靶核酸序列。本文使用的術(shù)語“核酸寡聚體”是指，包含至少2個(gè)且不超過100個(gè)連貫地連接的共價(jià)結(jié)合的核苷或核苷酸單元的核酸分子。每個(gè)單獨(dú)的核苷或核苷酸單元可以包含核糖或脫氧核糖，因而所述寡聚體可以包含核糖和脫氧核糖的組合?？梢赃B接核酸寡聚體中的核苷酸或核苷，使得所述寡聚體包含傳統(tǒng)的磷酸ニ酯連接，或者所述寡聚體可以包含ー個(gè)或多個(gè)磷酸三酯連接、膦酸酯連接、烷基膦酸酯連接、硫代磷酸酯連接或ニ硫代磷酸酯連接。另外，所述核酸寡聚體可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷，包括2’ 0-4’ C連接的核苷，且額外地或替代地，所述核酸寡聚體可以包含ー個(gè)或多個(gè)具有在2’ -位的其它修飾的核苷，所述其它修飾包括2’ -O-烷基修飾諸如2’ -O-甲基修飾、2’ -O-こ基修飾或其它2’ -修飾。本文使用的術(shù)語LNA (鎖定的核酸)包括具有在核苷糖單元的2’ -位和4’ -位之間的化學(xué)連接的核酸単體(即如果根據(jù)普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法進(jìn)行描述，核酸單體的呋喃糖具有2’ 0-4’ C連接或4’ C-2’ 0連接)，包括但不限于如下描繪的(A) a -L-亞甲基氧基(4，-CH2-0-2，) LNA、(B) ^ -D-亞甲基氧基(4，-CH2-0_2，) LNA、(C)亞乙基氧基(4’ -(CH2)2-0-2J ) LNA、⑶氨基氧基(4’ -CH2-O-N(R)-2’ ) LNA 和(E)氧基氣基(4’ _CH2_N (R) _0_2 ’ ) LNA。

本文使用的LNA化合物包括、但不限于在糖的4’和2’位之間具有至少一個(gè)橋的化合物，其中每個(gè)橋獨(dú)立地包含I個(gè)或2-4個(gè)連接的基團(tuán)，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自^[C(R1)(R2) ] n_、_C (R1) =C (R2) -、-C (R1) =N-> -C (=NR1) -、-C (=0) -、-C (=S) -、-O-、-Si (R1) 2_、-S (=0)x-和-N(R1)-;其中x是0、1或2 ;n是1、2、3或4 ;每個(gè)RjPR2獨(dú)立地是H、保護(hù)基、羥基、C「C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C2tl芳基、雜環(huán)基團(tuán)、取代的雜環(huán)基團(tuán)、雜芳基、取代的雜芳基、C5-C7·脂環(huán)基團(tuán)、取代的C5-C7脂環(huán)基團(tuán)、鹵素、OJp NJ1J2'SJp NyCOOJ1、?；?C(=0)-H)、取代的?；?、CN、磺酰基(S(^)2-J1)或 sulfoxyl (SbO)-J1);且每個(gè) J1 和 J2 獨(dú)立地是H、C1-C12 烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-Cm芳基、取代的C5-C2tl芳基、?；?C(=0)-H)、取代的?；?、雜環(huán)基團(tuán)、取代的雜環(huán)基團(tuán)、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保護(hù)基。在LNA的定義內(nèi)包括的具體4’ C- 2’ 0橋的實(shí)例包括HC(R1) (R2)Jn-, -[C(R1)(R2) L-O^-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-橋。在 LNA 的定義內(nèi)包括的其它橋是4，_CH2_2，、4，_ (CH2) 2_2，、4，_ (CH2) 3_2，、4，_CH2_0_2，、4，_ (CH2)2U,、4，_CH2_0_N (R1) _2，和4’ -CH2-N(R1)-O^'-橋，其中每個(gè)R1獨(dú)立地是H、保護(hù)基或C1-C12烷基。根據(jù)本發(fā)明，在LNA的定義內(nèi)還包括這樣的LNA :其中，核糖基糖環(huán)的2’ -羥基連接至所述糖環(huán)的4’碳原子上，從而形成亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)連接，以形成二環(huán)糖部分。所述連接可以是橋接2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(-CH2-)基團(tuán)，術(shù)語亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)LNA用于二環(huán)部分上；在亞乙基在該位置的情況下，使用術(shù)語亞乙基氧基(4’-CH2CH2-0-2’)LNA。在本文使用的LNA的含義內(nèi)，也包括a-L-亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)，即亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’ ) LNA的一種異構(gòu)體。本文使用的術(shù)語“2' -0-烷基-4' C連接”表示，在鎖定的核酸(LNA)中的2’ -0-4’ -C (或4’ C-2’ 0，如果根據(jù)普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法進(jìn)行描述)化學(xué)連接或橋。所述烷基連接可以是取代的或未取代的烷基，其中本文使用的“烷基”表示-[C(R1) (R2) ]n_，其中n是1、2、3、4、5或6 ;每個(gè)R1和R2獨(dú)立地是H、保護(hù)基、羥基、C1-C12 烷基、取代的 C1-C12 烷基、C2-C12 烯基、取代的 C2-C12 烯基、OJ1'NJ1J2'SJ1'N3AOOJ1、?；?C(=0)-H)，且每個(gè)J1和J2獨(dú)立地是=HX1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保護(hù)基。本文使用的術(shù)語“HBV”是指哺乳動物乙型肝炎病毒，包括人乙型肝炎病毒。該術(shù)語包括乙型肝炎病毒(特別是人乙型肝炎病毒)的地理學(xué)基因型以及乙型肝炎病毒的地理學(xué)基因型的變異株。本文使用的“乙型肝炎相關(guān)病癥”或“HBV相關(guān)病癥”是指，乙型肝炎感染、暴露或疾病會惡化、造成、有關(guān)、伴隨或引起的任意疾病、生物學(xué)狀況、醫(yī)學(xué)狀況或事件。術(shù)語乙型肝炎相關(guān)病癥包括黃疸、肝癌、肝炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭、彌散性肝細(xì)胞炎性疾病、噬血細(xì)胞綜合征、血清性肝炎、HBV病毒血癥和具有癥狀的病癥，所述癥狀可以包括下述的任一項(xiàng)或全部流感樣疾病、虛弱、疼痛、頭痛、發(fā)熱、食欲缺乏、腹瀉、黃疸、惡心和嘔吐、在身體的肝區(qū)的疼痛、泥色或灰色大便、全身瘙癢和深色尿，并伴有乙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒抗原存在的陽性檢測，或?qū)σ倚透窝撞《究乖禺愋缘目贵w的存在的陽性檢測。本發(fā)明的反義寡核苷酸(ASO)可以以非溶劑化物形式和溶劑化物形式存在。術(shù)語‘溶劑化物’在本文中用于描述分子復(fù)合物，其包含本發(fā)明的化合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的溶劑分子(例如乙醇)。當(dāng)所述溶劑是水時(shí)，采用術(shù)語‘水合物’。藥學(xué)上可接受的溶劑化物包括水合物和其它溶劑化物，其中結(jié)晶的溶劑可以同位素地替換，例身D2O, d6-丙酮、d6-DMS0。
在本發(fā)明要求保護(hù)的化合物的范圍內(nèi)，包括式(I)化合物的所有立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和互變異構(gòu)形式，包括表現(xiàn)出超過一類異構(gòu)現(xiàn)象的化合物和它們中的一種或多種的混合物。本發(fā)明的ASO可以作為前藥施用。因而，本文所述的ASO的某些衍生物(它們本身可能幾乎不具有或不具有藥理學(xué)活性)在施用到身體中或上時(shí)，通過例如水解裂解，可以轉(zhuǎn)化成具有希望的活性的、與SEQ ID NO: 1-13基本上互補(bǔ)的AS0。這樣的衍生物稱作‘前藥，。根據(jù)具體反義核酸寡聚體的性質(zhì)，可以使用任意常規(guī)方法將ASO施用給宿主，所述方法能夠?qū)е孪Ｍ陌屑?xì)胞中靶病毒轉(zhuǎn)錄物、病毒基因組量或載量的減少。因而，可以將反義寡聚體摻入到用于治療性施用的多種制劑中。更具體地，本發(fā)明的反義寡聚體可通過與適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合制成藥物組合物，且可制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑及氣霧劑。如此，反義寡聚體的施用可以以多種方式完成，包括口服的、口腔的、直腸的、腸胃外的、腹膜內(nèi)的、真皮內(nèi)的、透皮的或氣管內(nèi)的給藥等。在藥物劑型中，ASO可以單獨(dú)地施用，或與其它藥學(xué)活性劑適當(dāng)結(jié)合地以及聯(lián)合地施用。下述的方法和賦形劑僅僅是示例性的，絕不是限制性的。本文所述的ASO可以與常規(guī)的藥用載體、賦形劑等(例如，甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等)聯(lián)合施用。如果需要的話，所述藥物組合物也可以含有小量無毒的輔料，諸如潤濕劑、乳化劑、增溶劑、PH緩沖劑等(例如，醋酸鈉、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鹽、三乙醇胺油酸鹽等)。對于口服制劑，ASO可單獨(dú)應(yīng)用，或與適當(dāng)添加劑聯(lián)合應(yīng)用，以制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑，例如，與下述添加劑聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；粘合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂；和如果需要的話，稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和矯味劑?？梢匀缦聦SO制成注射用制劑通過將ASO溶解、懸浮或乳化在水性溶劑或非水溶劑(如植物油或其它相似油、合成脂族酸甘油酯、高等脂族酸酯或丙二醇)中，并且如果需要的話，使用常規(guī)添加劑如增溶劑、等滲劑、助懸劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。例如，可以如下制備藥學(xué)上可施用的液體組合物將至少一種ASO和任選的藥學(xué)佐劑溶解、分散或以類似方式分布在載體(例如，水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、二醇類、乙醇等)中，以形成溶液或混懸液?？梢灾苽涑Ｒ?guī)形式的注射劑，作為液體溶液或混懸液，作為乳劑，或呈適合在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式。在這樣的腸胃外組合物中含有的ASO的百分比高度地依賴于其具體性質(zhì)以及ASO活性和受試者的需要。但是，可以采用活性成分占溶液的0. 01%至10%的百分比，如果所述組合物是將在以后稀釋至上述百分比的固體，則可以更高。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含在溶液中的約0. 2-2%的活性劑AS0。ASO劑可以用于通過吸入來施用的氣霧劑制劑中。本發(fā)明的ASO可配制到加壓的可接受的推進(jìn)劑中，所述推進(jìn)劑例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。對于吸入遞送，可以將ASO配制為液體溶液，混懸液，氣霧噴射劑或干粉，并裝載到合適的給藥用分配器中。存在幾種類型的藥物吸入裝置一噴霧器吸入器、計(jì)量劑量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。噴霧器裝置會產(chǎn)生高速空氣流，其造成治療劑(它們配制成液體形式)噴灑為霧，所述霧被遞 送至患者的呼吸道中。MDI通常是包裝了壓縮氣體的制劑。在致動后，所述裝置通過壓縮氣體釋放出量過的量的治療劑，從而提供施用一定量藥劑的可靠方法。在通過DPI裝置呼吸過程中，DPI會分配自由流動的粉末形式的治療劑，所述粉末可以分散在患者的吸氣氣流中。為了實(shí)現(xiàn)自由流動的粉末，用諸如乳糖等賦形劑配制治療劑。量過的量的治療劑以膠囊的形式儲存，并在每次致動時(shí)分配。此外，ASO劑可通過與多種基質(zhì)(如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì))混合而制成栓劑。本發(fā)明的ASO可通過栓劑經(jīng)直腸施用。栓劑可包括在體溫融化、但在室溫固化的賦形劑，如可可脂、碳蠟及聚乙二醇。一般而言，通過用于類似用途的ASO劑的被接受的給藥模式中的任一種，施用治療有效量的提供的ASO劑。反義寡聚體(即，活性成分)的實(shí)際量取決于多種因素，諸如要治療的疾病的嚴(yán)重性、受試者的年齡和相對健康、使用的ASO的功效、給藥途徑和形式、以及其它因素。所述藥物組合物可以每天施用超過I次，諸如每天I次或2次。在具體實(shí)施方案中，所述ASO藥物制劑每周施用I次或2次，根據(jù)需要持續(xù)24、36或48周或更長的療程，以有效地治療HBV感染，包括減少病毒載量、減少病毒抗原、產(chǎn)生血清轉(zhuǎn)換、支持受試者免疫應(yīng)答和/或降低HBV DNA水平和正?；彼徂D(zhuǎn)移酶(ALT)水平。可提供用于口服或直腸給藥的單位劑型，如糖漿劑、酏劑和混懸液，其中每個(gè)劑量單元(例如一茶匙、一湯匙、一個(gè)片劑或一粒栓劑)含有預(yù)定量的組合物，所述組合物含有一種或多種抑制劑。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)給藥的單位劑型可包含在組合物中的抑制劑，所述組合物作為在無菌水、生理鹽水或其它藥學(xué)上可接受的載體中的溶液。本文使用的術(shù)語“單位劑型”是指，適合作為用于人及動物受試者的單元?jiǎng)┝康奈锢砩想x散的單位，每個(gè)單位含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物，其計(jì)算為與藥學(xué)上可接受的稀釋齊U、攜帶者或媒介物聯(lián)合足可產(chǎn)生希望的作用的量。本發(fā)明的新穎單位劑型的規(guī)范取決于應(yīng)用的具體化合物及欲達(dá)到的效果和在宿主中與每種化合物相關(guān)的藥效學(xué)。藥學(xué)上可接受的賦形劑(如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑)是公眾易于獲得的。此夕卜，藥學(xué)上可接受的輔料(如PH調(diào)節(jié)劑及緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑等)是公眾易于獲得的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地理解，劑量水平可隨具體的ASO劑、遞送媒介物的性質(zhì)等而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過多種方法易于確定給定的ASO的優(yōu)選劑量。用于施用本文所述的ASO治療劑的遞送方法的實(shí)例，以及藥物制劑、溶劑化物、水合物、鹽和酯的細(xì)節(jié)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且描述在文獻(xiàn)中。使用將ASO劑導(dǎo)入靶細(xì)胞中的任意方便的方法，可以將有效量的ASO抑制劑導(dǎo)入革巴細(xì)胞中。方法包括根據(jù)本領(lǐng)域可得到的標(biāo)準(zhǔn)方案，使用諸如lipofectamine、聚陽離子胺(諸如精胺、精脒)等試劑，以及包括電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體包囊和更多的方法。在有些情況下，對于ASO向靶細(xì)胞中的攝入而言，沒有外源劑是必需的。將有效量的ASO劑導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中，會導(dǎo)致HBV靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)(即降低)，導(dǎo)致HBV載量的減少、HBV DNA的減少、正?；腁LT活性、血清轉(zhuǎn)換、治愈和提高的免疫應(yīng)答。 最后，制劑和劑量的選擇取決于多種因素，諸如給藥模式和藥品的生物利用度。本發(fā)明的方法可以在任意哺乳動物細(xì)胞中起作用，其中代表性的目標(biāo)哺乳動物細(xì)胞包括，但不限于下述動物的細(xì)胞有蹄類動物(ungulates)或有蹄(hooved)動物,例如，牛、山羊、豬、綿羊等；嚙齒類動物，例如，倉鼠、小鼠、大鼠等；兔形目動物，例如，兔；靈長類動物，例如，猴、狒狒、人等；和類似的動物。所述ASO組合物可以有利地與其它抗病毒劑聯(lián)合地和/或替代地組合和/或使用，所述其它抗病毒劑是治療劑或預(yù)防劑，且不同于主題化合物。所述組合物也可以有利地與藥劑聯(lián)合地組合和/或使用，所述藥劑治療經(jīng)常與病毒感染(其對本發(fā)明的化合物敏感)有關(guān)的病癥，諸如抗-HCV劑或免疫抑制劑。在某些實(shí)施方案中，與主題組合物的聯(lián)合施用會增強(qiáng)這樣的藥劑的效能。因此，當(dāng)與其它抗病毒劑聯(lián)合地組合或施用時(shí)，本發(fā)明的化合物在某些實(shí)施方案中的使用劑量可以小于當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)預(yù)期的量，或小于聯(lián)合治療的計(jì)算量。本發(fā)明的ASO和ASO組合物也可以與增強(qiáng)身體的免疫系統(tǒng)的藥劑一起使用，包括低劑量的環(huán)磷酰胺、胸腺刺激素、維生素和營養(yǎng)補(bǔ)劑(例如，抗氧化劑，包括維生素A、C、E、￠-胡蘿卜素、鋅、硒、谷胱甘肽、輔酶Q-IO和紫錐花屬)和疫苗，例如，免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)，其包括組合了抗原的多聚體呈現(xiàn)和佐劑的疫苗制劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的，劑量取決于要治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和應(yīng)答性，和持續(xù)數(shù)天至數(shù)月的療程，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減少。通過測量患者體內(nèi)的ASO活性劑積累，可以計(jì)算出最佳劑量方案。最佳劑量可以隨單個(gè)寡核苷酸的相對功效而變化。一般而言，可以基于在體外和在體內(nèi)動物模型中發(fā)現(xiàn)有效的EC50來估測它。一般而言，劑量是0.01 yg至I g/kg體重，可以每天給藥I次或多次，每周I次，每月I次，或每年I次，或甚至每2-10年I次，或連續(xù)輸注數(shù)小時(shí)至數(shù)個(gè)月?；跍y量的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度，可以估測給藥的重復(fù)率。在成功的治療以后，可能希望使患者經(jīng)歷維持療法，以預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)。更具體地，療程會持續(xù)大約48周，每周給藥I次，作為皮下注射，劑量為約0. 01 Ii g/kg體重至約I g/kg體重。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及一種藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的反義寡聚體作為活性成分。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包括稀釋劑，并任選地包含藥用載體，且所述藥物組合物任選地包含其它化合物，諸如化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、鎮(zhèn)痛藥、NSAID、麻醉品、抗生素、抗真菌化合物、抗寄生蟲化合物和/或免疫調(diào)節(jié)化合物。本發(fā)明的寡核苷酸可以“原樣”使用，或以多種藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用。本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”表示這樣的鹽所述鹽保留本文鑒別出的寡核苷酸的希望的生物活性，并表現(xiàn)出微小的不希望的毒理學(xué)效應(yīng)。這樣的鹽的非限制性實(shí)例可以用有機(jī)氨基酸和用金屬陽離子(諸如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、鈉、鉀等)或用從氨、N，N- 二芐基亞乙基-二胺、D-葡糖胺、四乙基銨或亞乙基二胺得到的陽離子形成的堿加成鹽形成。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述寡核苷酸可以是前藥形式。寡核苷酸(在它們的天然形式時(shí)，其通常具有通過磷酸二酯主鏈連接的單個(gè)核苷酸)通常與基本上去質(zhì)子化的磷酸根氧一起在PH 7存在，所以是帶負(fù)電荷的分子。因?yàn)榧?xì)胞膜在性質(zhì)上是親脂的，與中性的或親脂的等效物相比，寡核苷酸的細(xì)胞攝取經(jīng)常會減少。一種解決方案是，使用前藥方案(參見例如 Crooke, R. M. (1998), Crooke, S. T. Antisense research andApplication. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131,第 103-140 頁)。藥學(xué)上可接受的粘合劑和佐劑也可以構(gòu)成配制的藥物的一部分。本發(fā)明的藥物組合物包括、但不限于溶液、乳劑和含有脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以從多種組分制備，所述組分包括、但不限于預(yù)形成的液體、自乳化固體和自乳化半固體。通過載體介導(dǎo)的遞送，可以增強(qiáng)ASO組合物向組織的遞送，所述載體包括、但不限于 陽離子型脂質(zhì)體、環(huán)糊精、卟啉衍生物、支鏈樹枝狀聚合物、聚乙烯亞胺聚合物、納米顆粒和微球(Dass, C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27) 根據(jù)制藥工業(yè)眾所周知的常規(guī)技術(shù)，可以制備本發(fā)明的藥物制劑，其可以方便地呈現(xiàn)在單位劑型中。這樣的技術(shù)包括使活性成分與藥用載體或賦形劑相締合的步驟。一般而言，如下制備制劑使活性成分與液體載體或粉碎的固體載體或二者均勻地且密切地締合，然后，如果必要的話，使產(chǎn)物成形。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能的劑型中的任一種，例如，但不限于、片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑和栓劑。本發(fā)明的組合物也可以配制為在水性介質(zhì)、非水性介質(zhì)或混合介質(zhì)中的混懸液。水性混懸液可以另外含有增加混懸液粘度的物質(zhì)，所述物質(zhì)包括，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述混懸液也可以含有穩(wěn)定劑。本發(fā)明的化合物也可以與活性藥品相綴合，所述活性藥品例如阿司匹林、布洛芬、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗細(xì)菌藥或抗生素和抗癌藥。另外，本發(fā)明的ASO序列可以與藥品一起施用，或與藥品聯(lián)合地單獨(dú)地施用，作為聯(lián)合治療，所述藥品可用于治療癌癥、炎癥、疼痛、細(xì)菌、真菌感染和/或寄生物感染、酒精中毒、物質(zhì)濫用、糖尿病，或者所述藥品可用于治療其它病毒感染諸如HIV、HCV等。乙型肝炎病毒感染存在兩種一般類型急性的和慢性的。已經(jīng)經(jīng)歷HBV感染的受試者也可以恢復(fù)，并變成無癥狀的攜帶者。當(dāng)暴露于乙型肝炎病毒的人開始出現(xiàn)病毒性肝炎的征象和癥狀時(shí)，發(fā)生急性乙型肝炎。稱作潛伏期的該時(shí)段平均是90天，但是可以短至45天，或長至6個(gè)月。對于大多數(shù)人而言，該感染會造成輕度至中度的不適，但是會自行消失，因?yàn)樯眢w的免疫應(yīng)答會成功地戰(zhàn)勝病毒。但是，有些人，特別是免疫系統(tǒng)受損的人，諸如遭受AIDS、接受化學(xué)療法、服用免疫抑制藥物或服用類固醇的人，具有非常嚴(yán)重的問題(作為急性HBV感染的結(jié)果)，并發(fā)展成更嚴(yán)重的病癥，諸如暴發(fā)性肝衰竭。當(dāng)人最初遭受急性感染、但是隨后不能戰(zhàn)勝感染時(shí)，發(fā)生慢性乙型肝炎。該疾病變成慢性還是完全消退，主要取決于受感染的人的年齡。約90%的在出生時(shí)受到感染的嬰兒會發(fā)展成慢性疾病。但是，隨著人老化，慢性感染的風(fēng)險(xiǎn)降低，所以20%-50%的兒童和小于10%的少年或成年人會從急性感染發(fā)展成慢性感染。慢性HBV感染是本發(fā)明的實(shí)施方案的主要治療目標(biāo)，盡管本發(fā)明的ASO組合物也能夠治療HBV相關(guān)病癥，諸如炎癥、纖維化、肝硬化、肝癌、血清性肝炎和其它。如圖I所示，總結(jié)了 HBV感染的自然史，如果患者在幼童時(shí)期接觸HBV，該兒童在將來形成免疫耐受性的機(jī)會是95%，且所述病癥會發(fā)展成慢性肝炎；然而，如果成年患者接觸HBV,所述病癥將來變成慢性的機(jī)會僅是5%。慢性HBV感染存在4個(gè)階段。第一階段是免疫耐受期，這時(shí)表現(xiàn)出微小的肝臟纖維化和炎癥，伴有高HBV DNA和正常的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。第二階段是免疫清除期，這時(shí)肝臟的活動性炎癥可通過組織學(xué)檢查觀察到，其還可以包括波動的ALT活性水平和波動的HBV DNA水平。隨后可能是第三個(gè)不活動的帶病原狀態(tài)階段，這時(shí)受感染的受試者可能在組織學(xué)檢查中表現(xiàn)出輕度肝炎和微小纖維化。也報(bào)道了第四個(gè)階段，稱作HBV的復(fù)活。該最后一個(gè)階段的特征在于，肝臟的活動性炎癥，這通過活組織檢查觀察到，盡管乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性和抗-HBeAg陽性。慢性HBV疾病具有幾種類型。第一種類型稱作HBeAg陽性的或“野生型”HBV感染，其被表征為抗-HBeAg陰性的，且表現(xiàn)出〉20,000 IU/mL O IO5拷貝/mL)的HBV DNA的量。第二種類型稱作HBeAg陰性的或“突變型核心"HBV感染，其被表征為抗-HBeAg陽性的，且表現(xiàn)出>2，000 IU/mL O IO4拷貝/mL)的HBV DNA的量。在圖2和3中，顯示了這兩類慢性HBV感染和歷史上推薦的治療方案。圖2顯示了表現(xiàn)出HBeAg陽性的或“野生型’MBV感染的患者的分類和歷史上推薦的治療。在左邊，是具有小于20，000 IU/mL (<105拷貝/mL)的HBV病毒DNA水平的患者，其中沒有推薦治療，但是進(jìn)行監(jiān)測，以確保HBV DNA水平?jīng)]有增加。在右邊，是具有>20，000IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。對于這些患者，每3_12個(gè)月監(jiān)測具有正常丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性的患者的ALT活性的任何變化，并考慮進(jìn)行活組織檢查(取決于年齡)。治療表現(xiàn)出升高的ALT活性的患者至血清轉(zhuǎn)換，盡管實(shí)際上，現(xiàn)有的HBV治療劑使小于20-30%的患者實(shí)現(xiàn)了血清轉(zhuǎn)換。目前推薦的HBV治療劑包括恩替卡韋(ETV)和富馬酸替諾福韋雙索酯(TDF)和peg-干擾素，作為首選。 圖3顯示了表現(xiàn)出HBeAg陰性的或“突變型核心”HBV感染的患者的分類和歷史上推薦的治療。在左邊，是具有小于2，000 IU/mL (<104拷貝/mL)的HBV病毒DNA水平的患者，其中沒有推薦治療，但是進(jìn)行監(jiān)測，以確保JfflV DNA水平?jīng)]有增加。在右邊，是具有彡2，000 IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。對于這些患者，監(jiān)測具有正常丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性的患者的ALT活性的任何變化，并考慮進(jìn)行活組織檢查。治療表現(xiàn)出升高的ALT活性的患者至HBsAg血清轉(zhuǎn)換，如果可能的話，使用目前推薦的HBV治療劑，包括恩替卡韋(ETV)和富馬酸替諾福韋雙索酯(TDF)和peg-干擾素，作為首選。遭受急性HBV感染的患者會針對病毒抗原產(chǎn)生劇烈的、多克隆的和多特異性的細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而慢性感染的患者具有弱的或不可檢測的CTL應(yīng)答。當(dāng)活化弱的HBV-特異性的免疫應(yīng)答(其強(qiáng)度足以破壞HBV感染的肝細(xì)胞)時(shí)，發(fā)生肝炎。關(guān)于引起T細(xì)胞低應(yīng)答性或耐受性的機(jī)理知之甚少，但是有人認(rèn)為，它可能涉及下述機(jī)理陰性選擇(新生兒);免疫學(xué)忽略；諸如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)等共刺激分子的周邊無反應(yīng)性或缺少；耗盡(PD-1的增量調(diào)節(jié))。所有這些提議的機(jī)理的一個(gè)共同因素是，在患者中持續(xù)的高抗原水平。HBV抗原HBeAg是一種分泌型、非顆粒形式的HBV核心蛋白。HBV抗原HBeAg和HbcAg共有基本氨基酸序列，所以表現(xiàn)出在T細(xì)胞水平的交叉反應(yīng)性。病毒裝配或復(fù)制不需要HBeAg，盡管研究表明，慢性感染的建立可能需要它們。HBeAg-陰性突變體對新生兒的感染經(jīng)常導(dǎo)致暴發(fā)性急性感染，而不是慢性HBV感 染(Terezawa等人(1991) Pediatr. Res. 29:5),而WHeAg-陰性突變體對幼土撥鼠的感染會導(dǎo)致遠(yuǎn)遠(yuǎn)更低的慢性WHV感染率(Cote等人(2000) Hepatology 31:190)。HBeAg可能通過滅活核心特異性的T細(xì)胞(通過刪除或克隆無反應(yīng))而起耐受原的作用(Milich等人(1998) J. Immunol. 160:8102)。在抗病毒療法和HBeAg血清轉(zhuǎn)換以后，在HBV病毒載量和抗原的減少與T細(xì)胞對抑制性受體程序化死亡-I (PD-1 ;也稱作roCDl，是活化的T細(xì)胞的一種負(fù)調(diào)節(jié)劑)的表達(dá)的降低之間存在正相關(guān)(Evans等人(2008) Hepatology 48:759)。HBV表面抗原或HBsAg是傳染性的HBV病毒顆粒的包膜蛋白，但是也作為非傳染性的顆粒分泌，其血清水平是HBV病毒顆粒的1000倍。受感染的人或動物中的HBsAg的血清水平可以高達(dá) 1000 li g/mL(Kann 和 Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiologyand Microbial Infections,第9版.745)。在急性HBV感染中，HBsAg在血清中的半衰期(或血清t,)是8. 3天(Chulanov等人(2003) J. Med. Virol. 69: 313)。骨髓樹突細(xì)胞對HBsAg的內(nèi)化，會抑制共刺激分子(即B7)的增量調(diào)節(jié)，并抑制T細(xì)胞刺激能力(den Brouw等人(2008) Immunology 126:280)，在HBsAg存在下，來自慢性感染的患者的樹突細(xì)胞也表現(xiàn)出共刺激分子的表達(dá)、IL-12的分泌和T細(xì)胞的刺激中的缺陷(Zheng等人(2004) J.Viral Hepatitis 11:217)。來自CHB患者的HBsAg特異性的⑶8細(xì)胞表現(xiàn)出改變的四聚體結(jié)合。這些⑶8細(xì)胞不是無反應(yīng)性的，但是可能具有賦予部分耐受性或忽略的TCR拓?fù)鋵W(xué)(Reignat等人(2002)J. Exp. Med. 195:1089)。此外，在Peg-IFNa 2a治療期間，在第24周時(shí)〉I log的血清HBsAg降低，具有持久的病毒學(xué)應(yīng)答(SVR——定義為在治療后I年時(shí)通過PCR不可檢測的HBV DNA)的高預(yù)測值(92%) (Moucari 等人(2009) Hepatology 49:1151)。由于重疊的傳播途徑，許多人已經(jīng)暴露于乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，更少的人群是兩種病毒的慢性感染者，特別是在諸如亞洲等HBV地方性流行的地區(qū)。據(jù)估測，多達(dá)10%的HCV感染者也可能具有HBV，同時(shí)20%的HBV感染者可能受到HCV的共同感染。但是，尚未較好地研究在HBV-HCV共同感染的個(gè)體中的乙型肝炎或乙型肝炎的治療。HCV和HBV似乎抑制彼此的復(fù)制(盡管并非所有研究都已經(jīng)觀察到該相互作用)的事實(shí)，使得治療復(fù)雜化。因此，完全抑制HBV的治療可能潛在地允許HCV再度出現(xiàn)，或反之亦然。因此，本發(fā)明的ASO化合物可以有利地用于治療被HBV和HCV感染的患者。丙型肝炎(HCV)的示例性的治療選項(xiàng)包括干擾素，例如，干擾素a _2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-1。使用聚乙二醇化的干擾素(連接到聚乙二醇部分上的干擾素，所述部分會顯著改善它的藥代動力學(xué)特性)，可以實(shí)現(xiàn)更低頻率的干擾素給藥。還已經(jīng)證實(shí)，干擾素a _2b(聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)和利巴韋林的聯(lián)合治療對于某些患者群體而言是有效的。目前處于開發(fā)中的其它藥劑包括HCV RNA復(fù)制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列)、HCV反義劑、HCV治療疫苗、HCV蛋白酶抑制劑、HCV解螺旋酶抑制劑和HCV抗體治療齊[J(單克隆的或多克隆的)。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了與SEQ ID NO: 1_13中的任一個(gè)基本上互補(bǔ)的ASO化合物，它們用于治療被HBV和HCV感染的受試者，其中所述ASO化合物與HCV劑聯(lián)合施用。所述HCV劑可以在與ASO化合物相同的藥物制劑中施用，或可以在單獨(dú)的制劑中施用。此外，所述HCV化合物可以與ASO HBV化合物同時(shí)地施用，或可以單獨(dú)地施用，使得HBV ASO化合物和HCV劑各自的劑量在患者體內(nèi)在時(shí)間上重疊。在有關(guān)的實(shí)施方案中，所述HCV劑可以選自干擾素a-2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-1 (聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復(fù)制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列);HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；和HCV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的HBV ASO化合物可以與第二種HBV治療劑聯(lián)合地 施用給被HBV感染的患者，其中所述第二種HBV治療劑可以在與HBV ASO化合物相同的藥物制劑中施用，或可以在單獨(dú)的制劑中施用。所述第二種HBV治療劑可以可以與ASO HBV化合物同時(shí)地施用，或可以單獨(dú)地施用，使得HBV ASO化合物和HBV治療劑各自的劑量在患者體內(nèi)在時(shí)間上重疊。在有關(guān)的實(shí)施方案中，所述HBV治療劑可以選自干擾素a _2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復(fù)制抑制劑；第二種HBV反義化合物；HBV治療疫苗；HBV預(yù)防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋JPHBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。圖4是HBV轉(zhuǎn)錄的示意圖，它顯示了由HBV基因組編碼的主要轉(zhuǎn)錄物(包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依賴性的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶活性)、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴)、轉(zhuǎn)錄物的相對長度以及大、中和小S蛋白轉(zhuǎn)錄物的重疊區(qū)。也指示了 HBV DNA的+和-鏈。圖5顯示了對比來自HBV的多個(gè)基因型的基因組DNA的序列之間的同一性百分比的計(jì)算生物學(xué)分析，其按照HBV基因組區(qū)域進(jìn)行繪制。如圖5所示，鑒別出了在所述序列中具有100%同一性的多個(gè)區(qū)域，特別是聚合酶和大、中和小S蛋白轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。圖6是不同地理學(xué)HBV基因型的表。如該表所示，存在8個(gè)已經(jīng)分類的不同的地理學(xué)HBV基因型，它們的基因組DNA相差大約8%。除了它們的地理學(xué)分布差異之外，HBV基因型也可以在臨床史和它們對干擾素療法的應(yīng)答方面存在差異。使用擴(kuò)展的計(jì)算生物學(xué)分析，與在圖5中所例證的類似，分析了約2300個(gè)序列，并令人驚訝地鑒別出13個(gè)在不同基因型之間具有>95%同一性的序列。該分析已經(jīng)允許設(shè)計(jì)單個(gè)反義寡聚體序列，它們各自靶向在多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和HBV基因組區(qū)域(在基因型之間)中具有>95%同一性的保守序列。因而，發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地且意外地鑒別出單個(gè)ASO序列關(guān)閉多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，且相同的單個(gè)ASO也在所有地理學(xué)HBV基因型之間具有增加的活性。這樣的方案考慮到一種藥物組合物，所述組合物包含單個(gè)ASO序列作為活性化合物，且所述組合物具有比現(xiàn)有HBV療法極大增加的效能，將嚴(yán)重地限制HBV株的形成抗性的能力，并將導(dǎo)致90%或更大的病毒載量減少，這通過HBV DNA和HBV抗原HBeAg和HBsAg的存在予以證實(shí)。本發(fā)明的藥物組合物因而將為遭受慢性HBV感染的患者提供一種改善的治療性處理，所述處理能夠提供完全血清轉(zhuǎn)換，并最終導(dǎo)致慢性HBV感染的完全治愈。這樣的方案也會減輕HBV相關(guān)肝病，諸如肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)和纖維化和炎癥，導(dǎo)致更少的肝移植需求，并幫助預(yù)防死于肝病。另外，除了極大提高的病毒載量減少以外，本發(fā)明的ASO會提供其它益處。認(rèn)為HBeAg具有免疫抑制作用，認(rèn)為HBsAg會促進(jìn)T細(xì)胞耗 竭。因此，使用本發(fā)明的ASO的治療，會通過降低HBeAg和HBsAg水平來支持患者的免疫應(yīng)答，允許免疫系統(tǒng)更好地控制感染。也預(yù)見到，肝中HBV抗原呈遞的減少，將有助于使HBV感染發(fā)作(flare-up)的程度最小化(免疫系統(tǒng)恢復(fù)的結(jié)果)，它們都會增加完全治愈慢性HBV感染的機(jī)會。提供了用于減少靶細(xì)胞中的乙型肝炎病毒基因組量的方法和組合物。在主題方法中，以足以減少靶細(xì)胞中病毒基因組的量的方式，抑制幾種特異性HBV靶蛋白中的任一種的表達(dá)，例如，通過將反義RNA抑制劑導(dǎo)入靶細(xì)胞中。也提供了用于實(shí)踐主題方法的藥物組合物。主題發(fā)明的實(shí)施方案可以用于多種用途，包括治療遭受病毒介導(dǎo)的疾病狀況(例如，HBV介導(dǎo)的疾病狀況)的受試者。這樣的病癥包括、但不限于肝的纖維化和炎癥、肝硬化和肝細(xì)胞癌(肝癌)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種反義寡聚體(AS0)，其用于治療哺乳動物(包括人類)的HBV感染，其中所述ASO與SEQ ID NO: 1_13中的任一個(gè)基本上互補(bǔ)，且可以有效地降低病毒載量或抗原水平至少40%、更優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選80%和最優(yōu)選90%。所述ASO可以包含至少2個(gè)修飾的核苷，包括鎖定的核酸(LNA)單元，其中所述LNA單元具有2’ 0-烷基-4’ C連接，導(dǎo)致在修飾的LNA核苷摻入ASO序列中的ASO位置處的二環(huán)糖。本發(fā)明的反義寡聚體是單鏈寡核苷酸，其包含核苷類似物(諸如LNA)或核苷酸類似物(諸如硫代磷酸酯)，它們形成反義寡核苷酸的連續(xù)核酸序列的一部分。反義寡聚體的序列由連續(xù)的核苷酸或核苷序列組成。本文使用的術(shù)語“反義”是指這樣的核酸寡核苷酸序列當(dāng)從5’ -端至3’ -端看時(shí)，其包含與DNA的有義鏈基本上互補(bǔ)的序列，即，所述反義寡核苷酸具有與DNA的有義鏈(也稱作編碼鏈)相反的序列朝向(從5’至3’ _)，所以所述反義寡聚體與給定的DNA編碼區(qū)或基因的有義鏈基本上互補(bǔ)。在本發(fā)明的上下文中，與術(shù)語“寡聚體”可互換地使用的術(shù)語“寡核苷酸”(或簡稱“寡物”)表示，通過2個(gè)或更多個(gè)核苷酸的共價(jià)連接形成的分子。當(dāng)用于本發(fā)明的寡核苷酸(也稱作單鏈寡核苷酸)的上下文中時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語“寡核苷酸”可能具有例如10-26個(gè)核苷酸，更具體地，本發(fā)明的寡核苷酸可能具有12-20個(gè)核苷酸，或更具體地
14-18個(gè)核苷酸。術(shù)語“核苷酸”表示這樣的分子其具有3種組分，即雜環(huán)含氮堿基(有時(shí)稱作核苷堿基，包括嘧啶和嘌呤堿基)、戊糖(核糖或脫氧核糖)和磷?；?磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯等)，實(shí)例包括但不限于=DNA核苷酸諸如脫氧腺苷_5’_單磷酸(dAMP)、脫氧鳥苷-5’- 二磷酸(dGDP)、脫氧胸苷-5’ -三磷酸(dTTP)和脫氧胞苷-5’ -三磷酸(dCTP)，和RNA核苷酸諸如腺嘌呤-5’ -單磷酸(AMP)、胞苷-5’ - 二磷酸(⑶P)、肌苷-5’ -單磷酸(IMP)、尿苷-5’ -三磷酸(UTP)和鳥苷-5’ -三磷酸(GTP)。本文使用的核苷酸包括磷酸酯類似物諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯類似物。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，在某些方面，術(shù)語核苷堿基也可以用于表示天然存在的或非天然存在的核苷酸一在這方面，術(shù)語核苷堿基和核苷酸可以在本文中可互換地使用。核苷堿基包括、但不限于鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、5，6- 二氫尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胸腺嘧啶、N7-甲基鳥嘌呤、N7-甲基肌苷、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶以及其它。本文提供的寡聚體化合物可以包含一種或多種單體，包括核苷或核苷酸，其具有修飾的糖部分。例如，可以以許多方式修飾核苷的呋喃糖基糖環(huán)，所述方式包括、但不限于添加取代基、橋接2個(gè)未成對的環(huán)原子以形成鎖定的核酸(LNA)。在某些實(shí)施方案中，寡聚體化合物包含一個(gè)或多個(gè)單體，所述單體是LNA。在某些這樣的實(shí)施方案中，LNA包括、但不限于如下描繪的(A) a-L-亞甲基氧基(4’ -CH2_0_2’ )LNA、(B) 3-D-亞甲基氧基(4，-CH2-0_2，) LNA、(C)亞乙基氧基(4，-(CH2)2H ) LNA、(D)氨基氧基(4，-CH2-O-N (R)-2’ ) LNA 和(E)氧基氨基(4，-CH2-N (R)-0-2 ’ ) LNA。
權(quán)利要求
1.一種反義寡聚體或其鹽、溶劑化物、水合物或酷，其用于減少哺乳動物細(xì)胞或生物體中的こ型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反義寡聚體是長度為10-26個(gè)核苷的連續(xù)序列,且包含如式I所示的序列5’ -LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-N1-P-LNAr-P-LNArS,(式 I) 其中 LNA是鎖定的核酸； P是選自下述的核苷間連接磷酸ニ酷、磷酸三酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、H-膦酸酷或烷基膦酸酯連接，所述連接是在LNA和鄰近的N之間，或在N和鄰近的N之間，或在N和鄰近的LNA之間，或在LNA和鄰近的LNA之間，從式(I)序列的5’至3’方向；且其中 N選自G、C、A、T、U或Z核苷單元； η和r和P和q各自獨(dú)立地是選自1、2或3的整數(shù)； I和m各自獨(dú)立地是1-22的整數(shù)；且 其中Z選自肌苷、N7-甲基肌苷、N7-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黃苷、ニ氫尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脫氮鳥苷、7-乙基-7-脫氮鳥苷、N4-甲基胞苷、N4-こ基胞苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的反義寡聚體，其中所述寡聚體的至少4個(gè)核苷單元是LNA単元，且其中存在于連續(xù)核苷序列的核苷單元之間的至少2個(gè)核苷間連接P是硫代磷酸酯核苷間連接，且所述LNA是具有2, -O-烷基-4' C連接的鎖定的核酸単元，其中所述烷基是取代的或未取代的(；_6烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的反義寡聚體，其中存在于連續(xù)核苷酸序列的核苷酸單元之間的所有核苷酸間連接是硫代磷酸酯核苷酸間連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的反義寡聚體，其中所述反義寡聚體包含與SEQIDNO. 1-13中的任ー個(gè)基本上互補(bǔ)的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的反義寡聚體，其中所述反義寡聚體基本上包含SEQ ID NO. 14-22中的任ー個(gè)的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的反義寡聚體，其中所述反義寡聚體包含與SEQIDNO. 1-13中的任ー個(gè)基本上互補(bǔ)的序列，且其中所述こ型肝炎病毒是人こ型肝炎病毒，且所述細(xì)胞或生物體是人。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的反義寡聚體，其中n、p、r和q各自獨(dú)立地是I或2，且I和m各自獨(dú)立地是2、3、4、5或6。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反義寡核苷酸，其中n、p、r和q各自獨(dú)立地是I，且I和m各自獨(dú)立地是6。
9.根據(jù)權(quán)利要求5、7或8中任一項(xiàng)所述的反義寡核苷酸，其中所述序列進(jìn)ー步選自SEQID NO 14、16、16 或 20 中的任ー個(gè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的反義寡聚體，其中所述HBV抗原是HBsAg。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的反義寡聚體，其中所述HBV抗原是HBeAg。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的反義寡聚體，其中所述こ型肝炎病毒選自人地理學(xué)基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲)；B (印度尼西亞、中國、越南)；C(東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南);D (地中海地區(qū)、中東、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亞);G (美國、法國)；或H (中美洲)。
13.ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染的藥物制劑，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的核酸寡聚體或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯和藥學(xué)上可接受的稀釋劑。
14.ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒的藥物制劑，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的核酸寡聚體或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯和藥學(xué)上可接受的稀釋劑。
15.ー種根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染的藥物制劑，其另外包含藥學(xué)上可接受的載體。
16.ー種用于治療具有こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關(guān)病癥的哺乳動物的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的反義寡核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而治療所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關(guān)病癥。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述哺乳動物是人，其中所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關(guān)病癥是來自人こ型肝炎病毒的こ型肝炎病毒感染。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的用于治療具有こ型肝炎病毒感染的哺乳動物的方法，其中所述人こ型肝炎病毒選自人地理學(xué)基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲)；B (印度尼西亞、中國、越南)；C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D(地中海地區(qū)、中東、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亞);G (美國、法國);或H (中美洲)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物是人，且其中所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關(guān)病癥是人こ型肝炎病毒相關(guān)病癥。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述人こ型肝炎病毒相關(guān)病癥選自下述的任ー種黃疸、肝癌、肝炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭、彌散性肝細(xì)胞炎性疾病、噬血細(xì)胞綜合征或血清性肝炎。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進(jìn)行。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述額外治療劑選自HBV劑、HCV劑、化學(xué)治療齊U、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑和免疫抑制劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述額外HBV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復(fù)制抑制劑；第二種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預(yù)防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋；和HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述額外HCV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復(fù)制抑制劑；HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；和HCV單克隆或多克隆抗體治療劑。
25.一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的反義寡核苷酸或有效量的根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而與治療之前哺乳動物中HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述哺乳動物是人，且其中所述こ型肝炎病毒是人こ型肝炎病毒。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述的方法，其中所述人こ型肝炎病毒選自人地理學(xué)基因型中的任一種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D (地中海地區(qū)、中東、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中與施用反義寡聚體之前的量相比，DNA的量減少了 90%。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述HBV抗原是HBsAg。
30.根據(jù)權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述的方法，其中所述HBV抗原是HBeAg。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-27或29-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中HBV抗原的存在被充分地減少以導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)換，所述血清轉(zhuǎn)換定義為如果監(jiān)測HBeAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子，血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在，或者定義為如果監(jiān)測HBsAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子，血清HBsAg不存在，所述存在和不存在由商業(yè)ELISA系統(tǒng)的目前可得到的檢測限確定。
32.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，所述方法另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進(jìn)行。
33.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述額外治療劑選自HBV劑、HCV劑、化學(xué)治療齊U、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑和免疫抑制劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述額外HBV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復(fù)制抑制劑；第二種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預(yù)防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋；和HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。
35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述額外HCV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復(fù)制抑制劑HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；和HCV單克隆或多克隆抗體治療劑。
36.一種用于促進(jìn)受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物的血清轉(zhuǎn)換的方法，所述方法包括 將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的反義寡核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物施用給受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物； 監(jiān)測HBeAg + HBeAb在哺乳動物血清樣品中的存在；或監(jiān)測HBsAg在哺乳動物血清樣品中的存在，以致干，如果監(jiān)測HBeAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子，則血清樣品中HBeAg的不存在+HbeAb的存在，或者，如果監(jiān)測HBsAg作為血清轉(zhuǎn)換的決定因子，則血清樣品中HBsAg的不存在，指示哺乳動物的血清轉(zhuǎn)換，所述存在和不存在由商業(yè)ELISA系統(tǒng)的目前可得到的檢測限確定。
37.根據(jù)權(quán)利要求16、25或36中任一項(xiàng)所述的方法，其中施用選自ロ服、口腔的、直腸的、腸胃外的、腹膜內(nèi)的、真皮內(nèi)的、透皮的或氣管內(nèi)的給藥。
全文摘要
公開了反義寡聚體，其可用于調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒感染，和用于治療動物(包括人類)的乙型肝炎病毒(HBV)和乙型肝炎病毒相關(guān)病癥。更具體地，公開了用于治療動物的HBV的具有修飾的核苷酸的反義寡聚體，更具體地，所述反義寡聚體包含2′O-4′C-亞甲基橋接的糖類和具有其它2’O-4’C橋接的糖類的核苷酸，也稱作鎖定的核酸(LNA)，其用于治療動物的HBV，更具體地，用于治療人類的HBV。
文檔編號A61K31/7115GK102762215SQ201080046632
公開日2012年10月31日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者R.哈馬泰克 申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司