專利名稱：通過(guò)針對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制治療脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因相關(guān)疾病的制作方法
通過(guò)針對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制治療脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因相關(guān)疾病本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2010年5月6日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2010/033908、進(jìn)入國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?01080030706.2、發(fā)明名稱為“通過(guò)針對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制治療脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因相關(guān)疾病”的PCT申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域
本申請(qǐng)要求于2009年5月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/175，930、于2009年5月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/176，267、于2009年5月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/180，646、于2009年10月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/248，212和于2009年8月19日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/235，227的優(yōu)先權(quán)，其整體引入本文作為參考。本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因及相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)于核酸功能的許多方面是重要的，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。雜交對(duì)于檢測(cè)特定核酸或改變其表達(dá)的各種技術(shù)也是關(guān)鍵的。反義核苷酸例如通過(guò)與靶RNA雜交破壞基因表達(dá)，由此干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義DNA具有DNA-RNA雜交物充當(dāng)用于通過(guò)核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，其是在大多數(shù)細(xì)胞類型中存在的活性。反義分子可以遞送到細(xì)胞內(nèi)，如對(duì)于寡聚脫氧核苷酸(ODNs)的情況，或它們可以由內(nèi)源基因表達(dá)為RNA分子。FDA近期批準(zhǔn)了反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，反映反義物具有治療效用。概述 提供這個(gè)概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述，以簡(jiǎn)要指出本發(fā)明的性質(zhì)和主旨。它的提出伴隨將不用于解釋或限制權(quán)利要求范圍或含義的理解。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用的方法，其通過(guò)使用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的一種或多種反義寡核苷酸，導(dǎo)致相應(yīng)有義基因的上調(diào)。本文還考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可以通過(guò)siRNA、核酶和小分子來(lái)達(dá)到，這被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。—個(gè)實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度5 - 30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與多核苷酸的反向互補(bǔ)體具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID NO: 8的核苷酸I至1299、SEQ ID NO: 9的I至918、SEQID NO: 10 的 I 至 1550、SEQ ID NO: 11 的 I 至 329、SEQ ID NO: 12 的 I 至 1826、SEQ IDNO: 13 的 I 至 536、SEQ ID NO: 14 的 I 至 551、SEQ ID NO: 15 的 I 至 672、SEQ ID NO: 16的 I 至 616、SEQ ID NO: 17 的 I 至 471、SEQ ID NO: 18 的 I 至 707、SEQ ID NO: 19 的 I 至74KSEQ ID NO: 20 的 I 至 346、SEQ ID NO: 21 的 I 至 867、SEQ ID NO: 22 的 I 至 563 內(nèi)的5 - 30個(gè)連續(xù)核苷酸(圖3);從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能和/或表達(dá)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的天然反義序列，例如SEQ ID NO:8-22中所示的核苷酸，以及關(guān)于其的任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的例子如SEQ ID NOS:23-263所示(圖4-9)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度5 - 30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的反義的反向互補(bǔ)體具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能和/或表達(dá)。另一個(gè)實(shí)施方案提供了在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能和/或表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度5 - 30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與針對(duì)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能和/或表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包括與有義和/或反義脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸結(jié)合的一種或多種反義寡核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括一個(gè)或多個(gè)修飾的或取代的核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括一個(gè)或多個(gè)修飾的鍵。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -O-甲基、氟或碳、亞甲基或其它鎖核酸(LNA)分子的修飾的堿基。優(yōu)選地，修飾的核苷酸是鎖核酸分子，包括a-L-LNA。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用于患者。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸在藥物組合物中施用。治療方案包括給患者施用至少一次反義化合物，然而，這種治療可以修改為包括經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的多個(gè)劑量。治療可以與一種或多種其他類型的療法組合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體中或與載體分子(例如膽固醇、TAT肽)連接。其他方面在下文描述。附圖簡(jiǎn)述

圖1
圖1A是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的siRNA寡核苷酸處理518Α2細(xì)胞后在ABCAl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ABCAl反義AK311445設(shè)計(jì)的siRNAs中的一個(gè)處理后48 h，518A2細(xì)胞中ABCAl mRNA的水平顯著增加。表示為CUR-0512、CUR-0519的條(Bars)分別對(duì)應(yīng)于用SEQID N0S: 23-25處理的樣品。圖1B是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理518A2細(xì)胞后在ABCAl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ABCAl反義AK311445設(shè)計(jì)的寡聚物中的六個(gè)處理后48 h，518A2細(xì)胞中ABCAl mRNA的水平顯著增加。表示為⑶R-1214至⑶R-1222的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ IDNOS: 26-34處理的樣品。圖1C是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理3T3細(xì)胞后在ABCAl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)小鼠ABCAl反義BF133827設(shè)計(jì)的寡聚物中的三個(gè)處理后48 h，3T3細(xì)胞中 ABCAl mRNA 的水平顯著增加。表示為 CUR-1087 至 CUR-1090、CUR-1092 和 CUR-1091的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S: 35-38、40和39處理的樣品。圖1D是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的siRNA和硫代磷酸酯寡核苷酸處理Hek293細(xì)胞后在LCAT mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的三個(gè)處理后48 h，Hek293 細(xì)胞中 LCAT mRNA 的水平顯著增加。表示為 CUR-0476、CUR-0478、CUR-0822、CUR-0820和CUR-0819的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S: 41、42、58、56和55處理的樣品。圖1E是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的siRNA寡核苷酸處理HepG2細(xì)胞后在LCAT mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的兩個(gè)處理后48 h，HepG2細(xì)胞中LCAT mRNA 的水平顯著增加。表示為 CUR-0476、CUR-0478、CUR-0444、CUR-0446、CUR-0448和CUR-0450的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S: 41,42和44-47處理的樣品。圖1F是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理HepG2細(xì)胞后在LCAT mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的一個(gè)處理后48 h，!fepG2細(xì)胞中LCAT mRNA 的水平顯著增加。表示為 CUR-0819、CUR-0818、CUR-0817、CUR-0816、CUR-0815、CUR-0820、CUR-0821 和 CUR-0822 的條分別對(duì)應(yīng)于用 SEQ ID N0S: 55、54、53、52、51 和 56-58處理的樣品。圖1G是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理Vero細(xì)胞后在LCAT mRNA中的倍 數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的一個(gè)處理后48 h,Vero細(xì)胞中LCAT mRNA 的水平顯著增加。表示為 CUR-0819、CUR-0818、CUR-0817、CUR-0816、CUR-0815、CUR-0820、CUR-0821 和 CUR-0822 的條分別對(duì)應(yīng)于用 SEQ ID N0S: 55、54、53、52、51 和 56-58處理的樣品。圖1H是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后在LRPl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LRPl反義DC401271的寡聚物處理后48 h，HepG2細(xì)胞中LRPl mRNA的水平顯著增加。表示為 CUR-0767 至 CUR-0769、CUR-0771、CUR-0770、CUR-0775、CUR-0773、CUR-0772 和 CUR-0774 的條分別對(duì)應(yīng)于用 SEQ ID N0S: 59-61、63、62、67、65、64 和 66 處理的樣品。圖1I是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理Vero細(xì)胞后在LRPl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LRPl反義DC401271和Hs.711951的寡聚物處理后48 h，Vero細(xì)胞中LRPl mRNA的水平顯著增加。表示為CUR-0768、CUR-0767、CUR_0774和CUR-0772的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S: 60、59、66和64處理的樣品。
圖1J是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理3T3細(xì)胞后在LRPl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LRPl反義DC401271和AW544265的寡聚物處理后48 h，3T3細(xì)胞中LRPlmRNA的水平顯著增加。表示為CUR-1017至CUR-1022的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S: 68-73處理的樣品。圖1K是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后在LDLR mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LDLR反義sherflor.aApr07的反義寡聚物處理后48 h, HepG2細(xì)胞中LDLR mRNA的水平顯著增加。表示為CUR-1054至CUR-1059的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S:74-79處理的樣品。圖1L是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相 比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后在LDLR mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LDLR反義bloflor.aApr07的反義寡聚物處理后，HepG2細(xì)胞中LDLRmRNA的水平。表示為CUR-1059至CUR-1063的條分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S: 79-83處理的樣品。圖1M是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理HepG2細(xì)胞后在ApoE mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ApoE反義Hs.626623設(shè)計(jì)的反義寡聚物中的三個(gè)處理后48 h，HepG2細(xì)胞中 APOE mRNA 的水平顯著增加。表示為 CUR-0978、CUR-0980、CUR-0981、CUR-0979、CUR-0973、CUR-0975、CUR-0974、CUR-0977 和 CUR-0976 的條分別對(duì)應(yīng)于用 SEQ ID N0S: 89、91、92、90、84、86、85、88 和 87 處理的樣品。圖1N至圖1P代表實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照相比使用應(yīng)用Lipofectamine2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后在ApoAl mRNA中的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ApoAl反義DA327409ext的反義寡聚物中的一些處理后48h，！fepG2細(xì)胞中ApoAl mRNA的水平顯著增加。條RH3-RH597分別對(duì)應(yīng)于用SEQ ID N0S:171-248處理的樣品。圖1Q是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示與對(duì)照比較，在用裸LNA或硫代磷酸酯寡核苷酸處理!fepG2細(xì)胞后7天期間，在ApoAl mRNA(上圖)和ApoAl天然反義DA327409ext RNA(下圖)中的倍數(shù)變化。指示為#6LNA、#11LNA、#6PS和#11PS的條分別代表SEQ ID N0:249_252。圖1R是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示在用LNA寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后，在ApoAlmRNA (橙色條)和ApoAl天然反義DA327409ext RNA (藍(lán)色條)中的倍數(shù)變化。指示為6_11的條對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NOS 249、257-260 和 250。圖1S顯示在用寡核苷酸處理IfepG2細(xì)胞后，在ApoAl mRNA (下圖)和蛋白質(zhì)(上圖)中的劑量依賴性增加。指示CUR-4806和CUR-4811的條分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOS 249和250。圖1T是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖，顯示在用針對(duì)天然ApoAl反義DA327409ext的寡核苷酸處理后，在原代非洲綠猴肝細(xì)胞中ApoAl mRNA的上調(diào)。指示⑶R-4816和⑶R-4811的條分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0S: 263和250。圖1U是顯示如分別通過(guò)實(shí)時(shí)PCR和ELISA測(cè)定的，與基線水平比較，在用⑶R-962(針對(duì)ApoAl反義DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸)處理后，在猴肝臟活組織檢查中增加的ApoAl mRNA和蛋白質(zhì)水平的圖(右圖)。在用在體外顯示對(duì)ApoAl水平?jīng)]有作用的寡核苷酸(⑶R-963)給藥的對(duì)照組中相同時(shí)間段后，ApoAl mRNA或蛋白質(zhì)水平不改變(左圖)。指示CUR-962 和 CUR-963 的條分別對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NOS: 260 和 261。圖1V顯示人和恒河猴ApoAl天然反義序列的并排比對(duì)以及用于靶向這些序列的一些寡核苷酸的位置。圖2顯示
SEQ ID NO:1:智人 ATP-結(jié)合盒，亞家族 A (ABCl)，成員 I (ABCAl)，mRNA (NCBI 登記號(hào):NM_005502)
SEQ ID NO: 2:智人卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，mRNA (NCBI登記號(hào):NM_000229.1)
SEQ ID NO: 3:智人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白I (LRP1)，mRNA (NCBI登記號(hào):NM_002332.2)
SEQ ID NO: 4:小家鼠低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白I (Lrpl)，mRNA (NCBI登記號(hào):NM_008512.2)
SEQ ID NO: 5:智人低密度脂蛋白受體(LDLR)，mRNA (NCBI登記號(hào):NM_000527.3) SEQ ID NO: 6:智人載脂蛋白 E (APOE)，mRNA (NCBI 登記號(hào):ΝΜ_000041.2)
SEQ ID NO: 7:智人載脂蛋白 A-1 (APOAl)，mRNA (NCBI 登記號(hào):NM_000039)。圖3顯示
SEQ ID NO: 8:人天然 ABCAl 反義序列(AK311445)
SEQ ID NO: 9:小鼠天然 ABCAl 反義序列(BF133827)
SEQ ID NO: 10:人天然 LCAT 反義序列(Hs.668679)
SEQ ID NO: 11:人天然 LCAT 反義序列(Hs.593769)
SEQ ID NO: 12:人天然 LCAT 反義序列(Hs.387239)
SEQ ID NO: 13:人天然 LRPl 反義序列(Hs.711951)
SEQ ID NO: 14:人天然 LRPl 反義序列(DC401271)
SEQ ID NO: 15:人天然 LRPl 反義序列(BM933147)
SEQ ID NO: 16:小鼠天然 LRPl 反義序列(CK626I73)
SEQ ID NO: 17:小鼠天然 LRPl 反義序列(AW544265)
SEQ ID NO: 18:人天然 ABCAl 反義序列(bloflor.aApr07)
SEQ ID NO: 19:人天然 ABCAl 反義序列(sherflor.aApr07)
SEQ ID NO: 20:天然 APOE 反義序列(Hs.626623)
SEQ ID NO: 21:天然 APOE 反義序列(Hs.714236)
SEQ ID NO: 22:天然APOAl反義序列(延長(zhǎng)的DA327409)。圖4顯示ABCAl反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 23至40?！畆’指示RNA并且*指示硫代磷酸酯(phosphothioate)鍵。圖5顯示LCAT反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 41至58?！畆’指示RNA并且*指示硫代磷酸酯鍵。圖6顯示LRPl反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 59至73。*指示硫代磷酸酯鍵。
圖7顯示LDLR反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 74至83。*指示硫代磷酸酯鍵。圖8顯示ApoE反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 84至92。*指示硫代磷酸酯鍵。圖9顯示ApoAl反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 93至263?！畆’指示RNA并且*指示硫代磷酸酯鍵。圖10顯示ABCAl反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 264至266。反義寡核苷酸SEQ IDNO: 264至266分別是反義寡核苷酸SEQ ID NO: 23至24的反向互補(bǔ)體?！畆’指示RNA。圖11顯示LCAT反義寡核苷酸SEQ ID NOs: 275至282。反義寡核苷酸SEQ IDNO: 267至274分別是反義寡核苷酸SEQ ID NO: 41至48的反向互補(bǔ)體?！畆’指示RNA。圖12顯示
SEQ ID NOs: 275至277:關(guān)于對(duì)ApoAl反義DA327409ext的定制設(shè)計(jì)分析分別對(duì)應(yīng)于探針序列、正向引物序列和反向弓I物序列，
SEQ ID NO: 278:對(duì)應(yīng)于⑶R 962，*指示硫代磷酸酯鍵并且+指示LNA。
SEQ ID NO: 279:對(duì)應(yīng)于⑶R 963，*指示硫代磷酸酯鍵并且+指示LNA。發(fā)明詳述
下文就用于舉例說(shuō)明的示例應(yīng)用而言描述了本發(fā)明的幾個(gè)方面。應(yīng)當(dāng)理解闡述了眾多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法，以提供本發(fā)明的 全面了解。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可以無(wú)需一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)或用其他方法進(jìn)行實(shí)踐。本發(fā)明不受動(dòng)作或事件排序限制，因?yàn)橐恍﹦?dòng)作可以以不同次序和/或與其他動(dòng)作或事件同時(shí)發(fā)生。此外，并非需要所有舉例說(shuō)明的動(dòng)作或事件來(lái)實(shí)現(xiàn)依照本發(fā)明的方法。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物預(yù)期對(duì)應(yīng)于來(lái)自任何物種的同系物，本文公開的組合物和方法可應(yīng)用于所述任何物種。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于來(lái)自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)公開了來(lái)自特定物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，這個(gè)公開內(nèi)容預(yù)期僅是示例性的，并且不解釋為限制，除非它在其中出現(xiàn)的上下文明確指出。因此，例如，對(duì)于本文公開的基因，這在一些實(shí)施方案中涉及哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列，預(yù)期包括來(lái)自其他動(dòng)物的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物，包括但不限于其他哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲類、爬行類和鳥類。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基因或核酸序列是人的。定義
本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并且不預(yù)期限制本發(fā)明。如本文使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”也預(yù)期包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確說(shuō)明。此夕卜，就術(shù)語(yǔ)“包括”、“具有”、“含有”或其變化用于詳述和/或權(quán)利要求來(lái)說(shuō)，此類術(shù)語(yǔ)預(yù)期以類似于術(shù)語(yǔ)“包含”的方式是包括性的。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意指如通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的，在關(guān)于具體值的可接受誤差范圍內(nèi)，這將部分依賴于該值如何進(jìn)行測(cè)量或測(cè)定，即測(cè)量系統(tǒng)的局限性。例如，“約”可以意指根據(jù)本領(lǐng)域的實(shí)踐在I或超過(guò)I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?？商娲兀凹s”可以意指直到給定值20%、優(yōu)選直到10%、更優(yōu)選直到5%且更優(yōu)選直到1%的范圍。可替代地，特別就生物系統(tǒng)或過(guò)程而言，該術(shù)語(yǔ)可以意指在值的一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)，優(yōu)選在5倍內(nèi)，且更優(yōu)選在2倍內(nèi)。當(dāng)具體值在本申請(qǐng)和權(quán)利要求中描述時(shí)，除非另有說(shuō)明，否則應(yīng)假定術(shù)語(yǔ)“約”意指在關(guān)于具體值的可接受誤差范圍內(nèi)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“mRNA”意指目前已知的靶基因的一種或多種mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及可以闡明的任何進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”意指與另一種RNA或DNA (祀RNA、DNA)結(jié)合的RNA或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，那么它借助于RNA-RNA相互作用與另一種RNA靶結(jié)合，并且改變靶RNA的活性(Eguchi等人，(1991) Ann.Rev.Biochem.60，631-652)。反義寡核苷酸可以上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意欲包括從治療、診斷或其他觀點(diǎn)看來(lái)有用的任何外來(lái)RNA或DNA分子。此類分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA (RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療編輯RNA及激動(dòng)劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少部分雜交的其他寡聚化合物。像這樣，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”還包括天然和/或修飾單體或鍵合的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其置換和α-異頭物形式、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過(guò)單體間相互作用的規(guī)律模式與革巴多核苷酸特異性結(jié)合，例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對(duì)、HoSgsteen或反向Hoogsteen型堿基配對(duì)等。寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同區(qū)域組成。在本發(fā)明的背景中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其包含2個(gè)或更多個(gè)化學(xué)區(qū)域，例如一個(gè)或多個(gè)DNA區(qū)域、一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)域、一個(gè)或多個(gè)PNA區(qū)域等。每個(gè)化學(xué)區(qū)域由至少一個(gè)單體單位構(gòu)成，即在寡核苷酸化合物的情況下核苷酸。這些寡核苷酸一般包括其中寡核苷酸進(jìn)行修飾的至少一個(gè)區(qū)域，以便顯示出一種或多種所需性質(zhì)。寡核苷酸的所需性質(zhì)包括但不限于例如對(duì)核酸酶降解的抗性增加、細(xì)胞攝取增加、和/或?qū)τ诎泻怂岬慕Y(jié)合親和力增加。寡核苷酸的不同區(qū)域因此可以具有不同性質(zhì)。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可以作為2種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類 似物的混合結(jié)構(gòu)形成。寡核苷酸可以由可以以“記錄器(regi ster ) ”連接的區(qū)域組成，即當(dāng)單體連續(xù)連接時(shí)，如在天然DNA中，或經(jīng)由間隔物連接。間隔物預(yù)期構(gòu)成區(qū)域之間的共價(jià)“橋”，并且在優(yōu)選情況下具有不超過(guò)約100個(gè)碳原子的長(zhǎng)度。間隔物可以攜帶不同功能性，例如具有正或負(fù)電荷，攜帶特定核酸結(jié)合性質(zhì)(插入劑、槽溝結(jié)合劑、毒素、熒光團(tuán)等)，是親脂的，誘導(dǎo)特定二級(jí)結(jié)構(gòu)如例如誘導(dǎo)α-螺旋的含丙氨酸肽。如本文使用的，“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等在內(nèi)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)ATP-結(jié)合盒1、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白(CERP)、ABCAl、ABC-1、ABC1、CERP, FLJ14958、HDLDTl、TCD 在本申請(qǐng)中可互
換應(yīng)用。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶、LCAT、磷脂酰膽堿-固醇酰基轉(zhuǎn)移酶、磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶在本申請(qǐng)中可互換應(yīng)用。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)A2MR、α-2-巨球蛋白受體、AP0ER、載脂蛋白E受體、APR、CD91、FLJ16451、IGFBP3R、LRP、LRP-1、MGC88725、前低密度脂蛋白受體-相關(guān)蛋白 1、TGFBR5
在本申請(qǐng)中可互換應(yīng)用。
如本文使用的，術(shù)語(yǔ)LDLR、ra、FHC、LDLCQ2、LDL受體、低密度脂蛋白受體在本申請(qǐng)
中可互換應(yīng)用。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)AD2、Apo-E、ApoE、載脂蛋白E、LDLCQ5、LPG、MGC1571在本申
請(qǐng)中可互換應(yīng)用。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)ΑροΑ1、Αρο-Α1、載脂蛋白A1、MGC117399在本申請(qǐng)中可互換應(yīng)用。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)……具有特異性的寡核苷酸”或“靶向……的寡核苷酸”指具有下述序列的寡核苷酸:(i)能夠與靶基因的部分形成穩(wěn)定復(fù)合物，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的部分形成穩(wěn)定雙鏈體。復(fù)合物和雙鏈體的穩(wěn)定性可以通過(guò)理論計(jì)算和/或體外測(cè)定進(jìn)行測(cè)定。用于測(cè)定雜交復(fù)合物和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測(cè)定在下文實(shí)施例中描述。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“靶核酸”包含DNA、由此類DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括mRNA前體和mRNA)、以及衍生自此類RNA的cDNA、編碼、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。通過(guò)與之特異性雜交的化合物的這種靶核酸功能調(diào)節(jié)，一般被稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重大功能例如RNA易位至蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、RNA剪接以獲得一種或多種mRNA種類、和可以與RNA銜接或由RNA促進(jìn)的催化活性。此類靶核酸功能干擾的總體效應(yīng)是調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。RNA干擾“RNAi”通過(guò)雙鏈RNA(dsRNA)分子介導(dǎo)，其與其“靶”核酸序列具有序列特異性同源性(Caplen，N.J.，等人，(2001)/"roc.Natl.Acad.Sc1.USA 98:9742-9747)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是5-25核苷酸“小干擾”RNA雙鏈體(siRNAs)。siRNAs衍生自通過(guò)稱為Dicer的RNA酶的dsRNA加工(Bernstein, E.,等人，(2001)Nature409:363-366)。siRNA雙鏈體產(chǎn)物召募到命名為RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白質(zhì)siRNA復(fù)合體內(nèi)。不希望受任何具體理論束縛，RISC隨后被認(rèn)為導(dǎo)向靶核酸(適當(dāng)?shù)豰RNA)，在該處siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用，以催化形式介導(dǎo)切割(Bernstein, E.，等人，(2001)艙iare 409:363-366 ;Boutla，A.，等人，(2001) Ω/rr.Biol.11:1776-1780)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的操作合成且使用可以依照本發(fā)明使用的小干擾RNAs。用于在本發(fā)明的方法中使用的小干擾RNAs適當(dāng)?shù)匕s1-約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的例子中，siRNAs可以包括約5 -約40 nt、約5 -約30nt、約10 -約30 nt、約15 -約25 nt、或約20-25個(gè)核苷酸。合適寡核苷酸的選擇通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序得到促進(jìn)，所述計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列且指出同一性或同源性區(qū)域。此類程序用于比較獲得的核酸序列，例如通過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物。來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較允許選擇展示物種之間的合適同一性程度的核酸序列。在未測(cè)序的基因的情況下，執(zhí)行DNA印跡以允許測(cè)定靶物種和其他物種中在基因之間的同一性程度。通過(guò)在各種嚴(yán)格程度下執(zhí)行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可以獲得同一性的近似測(cè)量。這些操作允許選擇這樣的寡核苷酸，其顯示出與待控制受試者中的靶核酸序列的高度互補(bǔ)性和與其他物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補(bǔ) 性。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在選擇用于在本發(fā)明中使用的基因的合適區(qū)域中存在相當(dāng)大的活動(dòng)余地。
“ 酶促 RNA”意指具有酶促活性的 RNA 分子(Cech，( 1988 ) J.American.Med.Assoc.260,3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過(guò)首先與靶RNA結(jié)合起作用。此類結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，所述酶促核酸與作用于切割靶RNA的分子的酶促部分保持緊密接近。因此，酶促核酸首先識(shí)別且隨后通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，并且一旦與正確位點(diǎn)結(jié)合，就酶促作用以切割靶RNA?！罢T餌RNA”意指模擬關(guān)于配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。誘餌RNA因此與天然結(jié)合靶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性配體。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR) RNA的超表達(dá)可以充當(dāng)“誘餌”并且有效結(jié)合HIV tat蛋白質(zhì)，從而阻止其與HIV RNA中編碼的TAR序列結(jié)合(Sullenger等人，(1990), Cfe77,63,601-608)。這意欲是特定例子。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這僅是一個(gè)例子，并且其他實(shí)施方案可以使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地生成。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“單體” 一般指示通過(guò)磷酸二酯鍵或其類似物連接的單體，以形成大小范圍從幾個(gè)單體單位例如約3-4個(gè)到約數(shù)百個(gè)單體單位的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更全面描述的。術(shù)語(yǔ)核苷酸“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明確的是先前已視為“非天然存在的”各種核苷酸已隨后在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)分子，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其它類型的核苷酸的舉例說(shuō)明性例子是包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4，N4-乙醇胞嘧啶(ethanocytosin)、N6，N6-乙醇_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5- (C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和Benner等人，美國(guó)專利號(hào)5，432，272中描述的“非天然存在的”核苷酸的分子。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”預(yù)期涵蓋這些例子以及其類似物和互變異構(gòu)體中的每一個(gè)和全部。特別有利的核苷酸是包含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，這被視為與在人中的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2’ -脫氧和2’ -羥基糖，例如如 Kornberg 和 Baker, DNA Replication,第二版(Freeman, San Francisco,1992)中所述，以及它們的類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷酸(參見，例如由下述一般描述的:Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, NewYork, 1980 ;Freier 和 Altmann, (1997)Acid.Res., 25 (22),4429-4443, Toulme,J.J., (2001) Nature Biotechnology 19: 17-18 ；Manoharan M., (1999) Biochemicaet Biophysica Acta 1489:117-139 ;Freier S.M.,Nucleic Acid Research,25:4429-4443, Uhlman, E., (2000)Drug Discovery & Development, 3:203-213, HerdewinP.，(2000) Anti sense ￡ Nucleic Acid Drug Dev.，10:297-310) ;2，-0，3'_C-連接的[3.2.0]雙環(huán)阿糖核苷(參見例如，N.K Christiensen.,等人，(1998)7； Am.Chem.Soc.,120:5458-5463 ；Prakash TP, Bhat B.(2007) Curr Top Med Chem.7(7):641-9 ；Cho EJ等人.(2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264)。此類類似物包括設(shè)計(jì)為增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)的合成核苷，所述結(jié)合性質(zhì)例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。如本文使用的，“雜交”意指寡聚化合物的基本上互補(bǔ)鏈的配對(duì)。一種配對(duì)機(jī)制涉及在寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，這可以是沃森-克里克、HoSgsteen或反向HoSgsteen氫鍵合。例如,腺嘌呤和胸腺卩密卩定是通過(guò)形成氫鍵而配對(duì)的互補(bǔ)核苷酸。雜交可以在各種情況下發(fā)生。當(dāng)化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以引起功能和/或活性調(diào)節(jié)時(shí)，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況下在生理?xiàng)l件下，和其中在體外測(cè)定情況下執(zhí)行測(cè)定的條件下，反義化合物是“可特異性雜交的”。如本文使用的，短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”指在其下本發(fā)明的化合物將與其靶序列雜交但與最低限度數(shù)目的其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同情況中和在本發(fā)明的背景中將是不同的，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及它們待在其中研究的測(cè)定決定。一般而言，嚴(yán)格雜交條件包括具有無(wú)機(jī)陽(yáng)離子例如Na++或K++ (即低離子強(qiáng)度)的低濃度(〈0.15M)的鹽，高于200C - 25°C低于寡聚化合物:靶序列復(fù)合物的Tm的溫度，和變性劑例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在。例如，雜交速率對(duì)于每I %甲酰胺下降1.1%。高嚴(yán)格雜交條件的例子是在60°C下0.1X氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0.1% (w/v) SDS 共 30 分鐘。如本文使用的，“互補(bǔ)性”指關(guān)于在一條或兩條寡聚鏈上的2個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果在反義化合物的特定位置上的核堿基能夠與在靶核酸的特定位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么在寡核苷酸和靶核酸之間氫鍵合的位置被視為互補(bǔ)位置。當(dāng)每種分子中足夠數(shù)目的互補(bǔ)位置由可以彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)時(shí)，寡聚化合物和進(jìn)一步地DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補(bǔ)。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”是用于指出在足夠數(shù)目的核苷酸上足夠程度的精確配對(duì)或互補(bǔ)性的術(shù)語(yǔ)，從而使得穩(wěn)定和特異性結(jié)合在寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生。本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解寡聚化合物的序列無(wú)需與其靶核酸100%互補(bǔ)以是可特異性雜交的。此外，寡核苷酸可以在一個(gè)或多個(gè)區(qū)段上雜交，從而使得插入或鄰近區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包括與在它們靶向其的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，其中反義化合物的20個(gè)核苷酸中的18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)且因此將特異性雜交的反義化合物，將代表90%互補(bǔ)性。在這個(gè)例子中，其余非互補(bǔ)核苷酸可以聚簇或由互補(bǔ)核苷酸間斷，并且與彼此或互補(bǔ)核苷酸無(wú)需是鄰接的。像這樣，具有4 (四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸的長(zhǎng)度18個(gè)核苷酸的反義化合物將與靶核酸具有77.8%總體互補(bǔ)性，并且因此將落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述非互補(bǔ)核苷酸側(cè)面為與靶核酸完全互補(bǔ)性的2個(gè)區(qū)域。使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(堿基局部比對(duì)搜索工具)和PowerBLAST 程序(Altschul 等人，(1990)7； Mol.Biol., 215,403-410 ;Zhang 和 Madden,(1997) Genome Res., 7,649-656),可以照常規(guī)測(cè)定反義化合物與祀核酸區(qū)域的互補(bǔ)性百分比。同源性百分比、序列同一'I"生或互補(bǔ)性可以通過(guò)例如Gap程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package， Version 8 for Unix, Genetics Computer Group， UniversityResearch Park, Madison Wis.)使用缺省設(shè) 置進(jìn)行測(cè)定，所述Gap程序使用Smith和Waterman 的算法C^k.AppI.Math.，(1981) 2，482-489)。
如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“熱解鏈溫度(Tm)”指在限定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下的溫度，在其下與靶序列互補(bǔ)的50%寡核苷酸在平衡狀態(tài)中與靶序列雜交。一般地，嚴(yán)格條件將是對(duì)于短寡核苷酸(例如，10 - 50個(gè)核苷酸)，其中鹽濃度是在pH 7.0 - 8.3下至少約0.01 - 1.0 M Na離子濃度(或其他鹽)并且溫度是至少約30°C的那些。嚴(yán)格條件還可以用添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來(lái)達(dá)到。如本文使用的，“調(diào)節(jié)”意指基因表達(dá)中的增加(刺激)或減少(抑制)。當(dāng)在多核苷酸序列的背景中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“變體”可以包含與野生型基因有關(guān)的多核苷酸序列。這個(gè)定義還可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)性”變體。剪接變體可以與參考分子具有顯著同一性，但由于在mRNA加工過(guò)程中外顯子的可變剪接，一般將具有更多或更少數(shù)目的多核苷酸。相應(yīng)多肽可以具有另外功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域的不存在。物種變體是從一個(gè)物種到另一個(gè)不同的多核苷酸序列。在本發(fā)明中具有特別效用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可以起因于核酸序列中的至少一個(gè)突變，且可能導(dǎo)致改變mRNAs或其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不改變的多肽。任何給定天然或重組基因可以具有無(wú)一、一個(gè)或許多個(gè)等位基因形式。引起變體的常規(guī)突變改變一般歸于核苷酸的天然缺失、添加或置換。這些類型改變各自可以單獨(dú)或與其他組合在給定序列中發(fā)生一次或多次。所得到的多肽一般將具有相對(duì)于彼此顯著的氨基酸同一性。多態(tài)性變體是在給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列中的變異。多態(tài)性變體還可以包含“單核苷酸多態(tài)性”(SNPs)或其中多核苷酸序列通過(guò)一個(gè)堿基改變的單堿基突變。SNPs的存在可以指示例如對(duì)于疾病狀態(tài)具有傾向的特定群體，即易感性與抗性比較。衍生多核苷酸包括實(shí)施化學(xué)修飾的核酸，例如通過(guò)烷基、芳基或氨基基團(tuán)替換氫。衍生物例如衍生寡核苷酸可以包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵合。在這些中示例性的是硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其他含硫種類。衍生核酸還可以包含標(biāo)記，包括核糖核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等?！把苌倍嚯幕螂氖抢缤ㄟ^(guò)糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷基化、酰化、化學(xué)偶聯(lián)或弱福 爾馬林處理修飾的那種。衍生物還可以直接或間接進(jìn)行修飾，以包含可檢測(cè)標(biāo)記，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”意欲包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、犬、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行類、魚類、昆蟲和蛛形類?！安溉閯?dòng)物”涵蓋一般在醫(yī)療護(hù)理下的溫血?jiǎng)游?例如人和馴養(yǎng)動(dòng)物)。例子包括貓、犬、馬、牛和人，以及僅僅人?！爸委煛被颉疤幚怼焙w哺乳動(dòng)物中疾病狀態(tài)的治療，并且包括:(a)預(yù)防哺乳動(dòng)物中的疾病狀態(tài)發(fā)生，特別是當(dāng)此類哺乳動(dòng)物有疾病狀態(tài)傾向但尚未被診斷為具有其時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如阻止其發(fā)展；和/或(C)緩解疾病狀態(tài)，例如促使疾病狀態(tài)消退直到達(dá)到所需終末點(diǎn)。治療還包括疾病癥狀的改善(例如減輕疼痛或不適)，其中此類改善可以直接影響疾病(例如，引起、傳染、表達(dá)等)或可以不如此。如本文使用的，“癌癥”指哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌或瘤或惡性腫瘤，包括但不限于:白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥本身表現(xiàn)為“腫瘤”或包含惡性癌細(xì)胞的組織。腫瘤的例子包括癌和肉瘤，諸如但不限于:纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、腎母細(xì)胞瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？梢酝ㄟ^(guò)根據(jù)本發(fā)明公開的組合物治療的另外的癌癥包括但不限于例如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺癌、原發(fā)性腦腫瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤(insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、惡變前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)細(xì)胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、惡性高血鈣、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和胰腺癌?！吧窠?jīng)疾病或病癥”指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺(jué)系統(tǒng)的任何疾病或病癥?！吧窠?jīng)疾病或病癥”包括牽涉中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)(包括頡神經(jīng))和自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中)的疾病或病癥。神經(jīng)病癥的例子包括但不限于頭痛、木僵和昏迷、癡呆、癲癇、睡眠障礙、外傷、感染、腫瘤、神經(jīng)眼科、運(yùn)動(dòng)障礙、脫髓鞘疾病、脊髓病癥、和周圍神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉接頭病癥。成癮和心理疾病包括但不限于雙相情感障礙和精神分裂癥，并且也包括在神經(jīng)病癥的定義內(nèi)。下列是可以應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法治療的幾個(gè)神經(jīng)病癥、癥狀、體征和綜合征的列舉:獲得性癲癇樣失語(yǔ)癥、急性播散性腦脊髓炎、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、老年性黃斑退化癥、胼胝體發(fā)育不全、失認(rèn)癥、艾卡迪綜合征、亞歷山大病、阿耳珀病、交替性偏癱、血管性癡呆、肌萎縮側(cè)索硬化、無(wú)腦畸形、Angelman綜合征、血管瘤病、缺氧、失語(yǔ)癥、失用癥、蛛網(wǎng)膜囊腫、蛛網(wǎng)膜炎、Anronl-Chiari畸形、動(dòng)靜脈畸形、Asperger綜合征、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、注意力缺陷伴多動(dòng)障礙、孤獨(dú)癥、自主神經(jīng)功能障礙、背痛、巴騰病、白塞氏病、貝爾麻痹、良性自發(fā)性瞼痙攣、良性局灶性、肌萎縮、良性盧頁(yè)內(nèi)高壓、賓斯旺格病、眼瞼疫攣、Bloch Sulzberger綜合征、臂叢神經(jīng)損傷、腦膿腫、腦損傷、腦瘤(包括多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)、脊髓腫瘤、布朗-塞卡爾綜合征、卡納萬(wàn)病、腕管綜合征、灼性神經(jīng)痛、中樞性疼痛綜合征、腦橋中央髓鞘溶解、頭部病癥、腦動(dòng)脈瘤、腦動(dòng)脈硬化癥、腦萎縮、大腦性巨人癥、腦癱、夏-馬-圖三氏病、化學(xué)療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛、希阿里畸形、舞蹈病、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、慢性疼痛、慢性局部疼痛綜合征、科 -勒二氏綜合征、昏迷包括持續(xù)性植物人狀態(tài)、先天性面癱、皮質(zhì)基底退化、顱動(dòng)脈炎、顱縫早閉、克雅氏病、累積性創(chuàng)傷障礙、庫(kù)興綜合征、嗜酸性巨細(xì)胞包涵體病、巨細(xì)胞病毒感染、舞蹈眼-舞蹈足綜合征、丹沃二氏綜合征、道森病、德莫塞爾綜合征、代-克二氏麻痹、癡呆、皮肌炎、糖尿病神經(jīng)病、彌漫性硬化、自主神經(jīng)功能異常、書寫困難、誦讀困難、張力失常、早期幼兒癲癇性腦病、空蝶鞍綜合征、腦炎、腦突出、腦三叉神經(jīng)血管瘤病、癲癇癥、歐勃麻痹、特發(fā)性震顫、法布里病、法爾綜合征、昏厥、家族性痙攣性癱瘓、發(fā)熱性驚厥、菲希爾綜合征、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥、額顳癡呆和其它"tau病變"、高歇病、格斯特曼綜合征、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、巨細(xì)胞性包涵體病、球樣細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、格-巴二氏綜合征、HTLV-1-相關(guān)的脊髓病、哈-斯二氏病、頭部損傷、頭痛、半面痙攣、遺傳性痙攣性截癱、多神經(jīng)炎型遺傳性共濟(jì)失調(diào)、耳部帶狀皰疹、帶狀皰疹、平山綜合征、HIV相關(guān)的癡呆和神經(jīng)病(也稱為AIDS的神經(jīng)學(xué)表現(xiàn))、前腦無(wú)裂畸形、亨廷頓病和其他聚谷氨酰胺重復(fù)病、積水性無(wú)腦畸形、腦積水、皮質(zhì)醇增多癥、缺氧、免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎、包涵體肌炎、色素失調(diào)癥、嬰兒植烷酸貯積病、嬰兒雷弗蘇姆病、嬰兒痙攣、炎癥性肌病、顱內(nèi)囊腫、顱內(nèi)高壓、Joubert綜合征、Keams-Sayre綜合征、肯尼迪病金斯布林納綜合征、克_費(fèi)二氏綜合征、克臘比病、庫(kù)-韋病、庫(kù)魯病、拉福拉病、朗-愛(ài)二氏肌無(wú)力綜合征、Landau-Kleffner綜合征、側(cè)髓(瓦倫伯格)綜合征、學(xué)習(xí)失能、利氏病、Lennox-Gustaut綜合征、累-奈二氏綜合征、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥、路易體癡呆、無(wú)腦回、閉鎖綜合征、路葛雷克氏病(即，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病或肌萎縮側(cè)索硬化)、腰間盤病、萊姆病-神經(jīng)學(xué)后遺癥、馬-約病、巨腦(macrenc印haly)、巨腦(megalencephaly)、邁-羅二氏綜合征、美尼爾癥、髓膜炎、門克斯病、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、小頭畸型、偏頭痛、Miller Fisher綜合征、小中風(fēng)、線粒體肌病、默比厄斯綜合征、單肢肌萎縮、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、腦底異常血管網(wǎng)、粘多糖病、多發(fā)性硬化性癡呆、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、多發(fā)性硬化和其他脫髓鞘病癥、多系統(tǒng)萎縮伴體位性低血壓、P肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、重癥肌無(wú)力、脫髓鞘彌漫性硬化、嬰兒肌陣攣性腦病、肌陣攣、肌病、先天肌強(qiáng)直、睡眠發(fā)作、神經(jīng)纖維瘤病、神經(jīng)阻滯劑惡性綜合征、AIDS的神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)、狼瘡的神經(jīng)學(xué)后遺癥、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥、神經(jīng)元移行病癥、尼曼-皮克二氏病、O’ Sullivan-McLeod綜合征、枕部神經(jīng)痛、隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征、大田原綜合征、橄欖體腦橋小腦萎縮、斜視性眼陣攣、視神經(jīng)炎、直立性低血壓、過(guò)度使用綜合征、感覺(jué)異常、神經(jīng)變性疾病或病癥(帕金森病、亨延頓病、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化和與神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)的其他疾病及病癥)、先天副肌強(qiáng)直、瘤外病、陣發(fā)性發(fā)作、帕-羅二氏綜合征、佩-梅二氏病、周期性癱瘓、周圍神經(jīng)病、疼痛神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛、持續(xù)性植物人狀態(tài)、綜合性精神發(fā)育障礙、光噴嚏反射、植烷酸貯積病、匹克病、神經(jīng)挾捏、垂體瘤、多肌炎、孔洞腦、小兒麻痹癥后期綜合征、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、感染后腦脊髓炎、體位性低血壓、帕-魏二氏綜合征、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、朊病毒病、進(jìn)行性一側(cè)面萎縮、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病、進(jìn)行性硬化性灰質(zhì)萎縮、進(jìn)行性核上麻痹、假腦瘤、拉姆齊-亨特綜合征(I型和II型)>Rasmussen腦炎、反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征、雷夫敘姆病、重復(fù)性運(yùn)動(dòng)病、重復(fù)性應(yīng)激損傷、不寧腿綜合征、反轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)脊髓病 、雷特綜合征、瑞氏綜合征、舞蹈病、山德霍夫病、謝耳德病、腦裂、透明隔-視神經(jīng)發(fā)育不良、驚嚇?gòu)雰壕C合征、帶狀皰疹、希-德二氏綜合征、干燥綜合征、睡眠呼吸暫停、索托斯綜合征、痙攣狀態(tài)、脊柱裂、脊髓損傷、脊髓腫瘤、脊髓性肌萎縮、僵人綜合征、中風(fēng)、斯特奇-韋伯二氏綜合征、亞急性硬化性全腦炎、皮層下動(dòng)脈硬化性腦病、西德納姆舞蹈病、暈厥、脊髓空洞癥、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、泰-薩克斯病、顳動(dòng)脈炎、脊髓栓系綜合征、湯姆森病、胸廓出口綜合征、三叉神經(jīng)痛、托德麻痹、圖雷特綜合征、短暫性腦缺血發(fā)作、傳播性海綿狀腦病、橫貫性脊髓炎、外傷性腦損傷、震顫、三叉神經(jīng)痛、熱帶痙攣性輕截癱、結(jié)節(jié)性硬化癥、血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)、脈管炎包括顳動(dòng)脈炎、希-林二氏病、瓦倫伯格綜合征、韋-霍二氏病、韋斯特綜合征、急性頸部扭傷、威廉斯綜合征、威爾森氏病和澤耳韋格綜合征。“炎癥”指全身炎癥狀況以及與單核細(xì)胞、白細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞的遷移和吸引局部相關(guān)的狀況。炎癥的例子包括但不限于起因于下列的炎癥:病原生物(包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、病毒、真菌和寄生蟲如原生動(dòng)物和蠕蟲)感染、移植排斥(包括實(shí)體器官如腎、肝、心、肺或角膜的排斥，以及骨髓移植物排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))、或局部慢性或急性自身免疫或變態(tài)反應(yīng)。自身免疫病包括:急性腎小球腎炎，類風(fēng)濕或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，慢性腎小球腎炎，炎性腸病如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎，粒細(xì)胞輸入相關(guān)綜合征，炎性皮膚病如接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、牛皮癬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，自身免疫性甲狀腺炎，多發(fā)性硬化癥，和某些形式的糖尿病，或其中受試者的自身免疫系統(tǒng)引起的攻擊導(dǎo)致病理性組織破壞的任何其他自身免疫狀態(tài)。變態(tài)反應(yīng)包括過(guò)敏性哮喘、慢性支氣管炎、急性和遲發(fā)超敏性。全身炎性疾病狀態(tài)包括與下列有關(guān)的炎癥:外傷、燒傷、缺血事件后再灌注(例如，心、腦、腸或外周血管中的血栓形成事件，包括心肌梗塞和中風(fēng))、膿毒癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征。炎性細(xì)胞募集也發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中。炎癥包括但不限于非何杰金氏淋巴瘤、韋格納肉芽腫、橋本氏甲狀腺炎、肝細(xì)胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性淋巴樣增生、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、乳頭狀癌、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、硬化(cirrhosis)、慢性唾液腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宮內(nèi)膜異位、子宮內(nèi)膜組織異位、急性宮頸炎、慢性宮頸炎、淋巴樣增生、多發(fā)性硬化、繼發(fā)于特發(fā)性血小板減少性紫癜的肥大、原發(fā)性IgA腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、肺氣腫、慢性腎盂腎炎和慢性膀胱炎。心血管疾病或病癥包括可以弓I起缺血或由心臟再灌注引起的那些病癥。實(shí)例包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、冠脈疾病、肉芽腫心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽腫)、原發(fā)性肥大性心肌病、周圍動(dòng)脈疾病(PAD)、中風(fēng)、心絞痛、心肌梗塞、由心臟停搏引起的心血管組織損傷、由心臟旁路引起的心血管組織損傷、心源性休克、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道或牽涉心臟或脈管系統(tǒng)的功能障礙或組織損傷的相關(guān)狀況，尤其是但不限于與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因活化有關(guān)的組織損傷。CVS疾病包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、肉芽腫心肌炎、心肌梗塞、繼發(fā)于瓣膜性心臟病的心肌纖維化、無(wú)梗塞的心肌纖維化、原發(fā)性肥大性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽腫)?！按x疾病或病癥”寬范圍的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病和病癥，包括例如胰島素抵抗、糖尿病、肥胖、匍萄糖耐量受:損、聞血膽固醇、聞血糖、聞膜島素血癥、血脂異常和聞脂血癥。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子 革E 在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的核酸序列，其無(wú)限制地包括與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因關(guān)聯(lián)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括ABCAl的核酸序列，其無(wú)限制地包括與ABCAl基因關(guān)聯(lián)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括LCAT的核酸序列，其無(wú)限制地包括與LCAT基因關(guān)聯(lián)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括LRPl的核酸序列，其無(wú)限制地包括與LRPl基因關(guān)聯(lián)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括低密度脂蛋白受體(LDLR)的核酸序列，其無(wú)限制地包括與LDLR關(guān)聯(lián)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶包括載脂蛋白(ApoAl)的核酸序列，其無(wú)限制地包括與ApoA關(guān)聯(lián)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。人載脂蛋白A-1 (ApoA-1)是高密度脂蛋白(HDL和淋巴乳糜微粒的主要蛋白質(zhì)組分。在人血漿中，已命名了 4種主要的循環(huán)脂蛋白:乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。HDL牽涉膽固醇從周圍組織的去除，這通過(guò)將其運(yùn)輸?shù)礁位蚱渌鞍走M(jìn)行。ATP-結(jié)合盒亞家族-A (ABCAI)成員I ABCAI在細(xì)胞脂質(zhì)去除途徑中起膽固醇流出泵的作用。ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)是下列蛋白質(zhì)超家族的成員，其為在從原核生物到人的所有現(xiàn)存門中具有代表性的最大和最古老的家族之一。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是這樣的跨膜蛋白質(zhì)，其利用三磷酸腺苷(ATP)水解的能量以執(zhí)行某些生物過(guò)程，包括各種底物跨膜異位，以及非轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)過(guò)程，如RNA翻譯和DNA修復(fù)。它們轉(zhuǎn)運(yùn)各種底物跨過(guò)細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜，包括代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)和固醇、以及藥物。蛋白質(zhì)根據(jù)序列和它們的一個(gè)或多個(gè)ATP-結(jié)合盒(ABC)結(jié)構(gòu)域的組織分類為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白牽涉腫瘤抵抗、囊性纖維化、細(xì)菌多藥耐性、和一系列其它遺傳性人疾病。ABCl基因編碼的膜相關(guān)蛋白質(zhì)是ATP-結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員。ABC蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)各種分子跨過(guò)細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜。ABC基因分為7種不同亞家族(ABCA、MDRITAP、MRP、ALD、OABP、GCN20、White)。該蛋白質(zhì)是ABCA亞家族的成員。ABCA亞家族的成員包括獨(dú)特地發(fā)現(xiàn)于多細(xì)胞真核細(xì)胞中的唯一的主要ABC亞家族。以膽固醇為其底物，該蛋白質(zhì)起在細(xì)胞脂質(zhì)去除途徑中起膽固醇流出泵的作用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸用于預(yù)防或治療與ATP-結(jié)合盒分子有關(guān)的疾病或病癥。ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCl (人轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族ABCA的成員I)也稱為膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白(CERP)，其為在人中由ABCl基因編碼的蛋白質(zhì)。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是細(xì)胞膽固醇和磷脂穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)物。ABCl存在于高密度脂蛋白(HDL)中，其允許從人細(xì)胞膜去除過(guò)量膽固醇和磷脂。由于該蛋白質(zhì)在整個(gè)機(jī)體中需 要，其作為220-kDa蛋白質(zhì)遍在地合成。其以較高量存在于穿梭或牽涉于脂質(zhì)周轉(zhuǎn)中的組織如肝、小腸和脂肪組織中。作用于ABCl轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)或其翻譯后修飾的因子也是牽涉其隨后功能的分子，如脂肪酸、膽固醇、也為細(xì)胞因子和環(huán)腺苷一磷酸。低密度脂蛋白受體-相關(guān)蛋白I (LPRl)是約4544個(gè)氨基酸；504575 Da。它是85-kDa膜結(jié)合羧基亞單位和非共價(jià)連接的515-kDa氨基末端亞單位的異二聚體。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與MAFB相互作用。LPRl見于與PID1IPCLIULRP1和CUBNI的復(fù)合物中。與SNX17、PIDlIPCLI1、PDGF、LRPAP1和CUBN相互作用。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與SHC1、⑶LPl和DABl相互作用。LRPl是胞吞受體，其牽涉胞吞作用和牽涉凋亡細(xì)胞的吞噬作用、早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、乳糜微粒殘余和活化的LRPAPl ( α 2_巨球蛋白)的血漿清除、纖溶酶原激活物及其內(nèi)源性抑制劑之間的復(fù)合物的局部代謝。不希望束縛于理論，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞事件，如APP代謝、激酶依賴性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)元鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)、以及神經(jīng)傳遞。高密度脂蛋白(HDL)挑選出血液中的額外膽固醇且使其返回到肝臟。低密度脂蛋白(或LDL)是體內(nèi)膽固醇的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但經(jīng)過(guò)多年太多的LDL可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(動(dòng)脈變窄和硬化)，且導(dǎo)致心臟病或心臟病發(fā)作。比值通過(guò)LDL膽固醇除HDL膽固醇決定。例如，如果個(gè)人具有50 mg/dL的HDL膽固醇和150 mg/dL的LDL膽固醇，那么HDL/LDL比值將是0.33。目的是使HDL/LDL比值維持超過(guò)0.3，其中理想HDL/LDL比值是超過(guò)0.4。HDL在肝臟和小腸中作為富含蛋白質(zhì)的盤形顆粒從頭合成。HDL的主要脫輔基蛋白是apoA-1、apoA-11、apoC-1、apoC-1I和apoE。新近形成的HDL包含極少膽固醇和膽固醇酯。通過(guò)膽固醇酯在脂蛋白顆粒中性核心中的累積，HDL由其最初盤狀形狀轉(zhuǎn)變成球狀脂蛋白顆粒。膽固醇通過(guò)HDL由乳糜顆粒殘留部分VLDL殘留部分(也稱為中間密度脂蛋白或IDL)和直接由細(xì)胞表面膜累積。膽固醇通過(guò)HDL相關(guān)酶卵磷脂:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶("LCAT")的作用得到酯化。對(duì)于將脂肪酸從卵磷脂(磷脂酰膽堿)轉(zhuǎn)移到膽固醇的C-3-0H基團(tuán)的LCAT，需要與在HDL表面上發(fā)現(xiàn)的ApoA-1的相互作用。核心膽固醇酯的累積將新生HDL轉(zhuǎn)變?yōu)镠DL2和HDL3。參見R.1.Levy等人，〃The structure,function and metabolismof high-density lipoproteins:A status report, 〃 Circulation,第 62 卷，第 IV4-8 頁(yè)(1980);和0.1.Silverman 等人，〃High_density lipoprotein subfractions, ^ Am.J.Med.，第 94 卷，第 636-45 頁(yè)(1993)。HDL通常通過(guò)超速離心從血漿中分離。正常HDL密度范圍是1.063 g/mL - 1.21g/mL，這大致分成 2 個(gè)范圍 HDL2 (1.063 g/mL - 1.125 g/mL)和 HDL3 (1.125 g/mL -1.21 g/mL)。最近,通過(guò)雙向電泳隨后為免疫印跡和酶聯(lián)差異抗體免疫吸附測(cè)定，已鑒定了 HDL中的2個(gè)主要顆粒群體。這些群體之一包含具有單獨(dú)的apoA-1的顆粒，并且另一種包含具有apoA-1和apoA-1I的顆粒。apoA_I顆粒的相對(duì)比例在HDL2部分中最高，而HDL3 更多是 apoA-1 和 apoA-1I 的組合。參見 J.C.Fruchart 等人，〃ApolipoproteinA—containing lipoprotein particles:physiological role, quantification, andclinical significance, ^ Clin.Chem.，第38卷，第 793-7頁(yè)(1992);和B.F.Asztalos等人，"Normolipidemic subjects with low HDL cholesterol levels have alteredHDL subpopulations，〃 Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.，第 17 卷,第 1885-1893 頁(yè)(1997)。人載脂蛋白A-1(ApoA-1)是HDL和淋巴乳糜微粒的主要蛋白質(zhì)組成成分。ApoA-1主要在肝臟和小腸中作為前體蛋白(前原apo A-1)合成。前原apo A-1在細(xì)胞內(nèi)切割，以形成前apo A-1，分泌到血 漿和淋巴內(nèi)的形式。在血漿中，6個(gè)氨基酸從前apo A-1中切割，以形成成熟ApoA-1。成熟ApoA-1是由已知序列的243個(gè)氨基酸組成的單個(gè)非糖基化多肽。ApoA-1充當(dāng)血漿酶(卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT))的輔因子，負(fù)責(zé)形成血漿中的大多數(shù)膽固醇酯。減少水平的ApoA-1可以導(dǎo)致血漿脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的病癥和冠心病的發(fā)展。低水平的ApoA-1和HDL已顯示為心臟病發(fā)作和其他動(dòng)脈粥樣硬化血管疾病的強(qiáng)烈危險(xiǎn)因素。參見美國(guó)專利號(hào) 5，059，528 和 6，258，596。載脂蛋白E (ApoE)是見于乳糜微粒以及與肝細(xì)胞和周圍細(xì)胞上特異性受體結(jié)合的中間密度脂蛋白(IDLs)的脫輔基蛋白。中間密度脂蛋白屬于脂蛋白顆粒家族并且由極低密度脂蛋白的降解形成。IDL是5種主要脂蛋白集合(乳糜微粒、VLDL、IDL、LDL、HDL)之一，其能夠使脂肪和膽固醇在血流的水基溶液中移動(dòng)。載脂蛋白E (ApoE)對(duì)于富含甘油三酯的脂蛋白組分的正常分解代謝是重要的。APOE基因ApoE對(duì)映于與載脂蛋白Cl和載脂蛋白C2叢集的染色體19。ApoE由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，共3597個(gè)堿基對(duì)。在黑素細(xì)胞中，APOE基因表達(dá)可通過(guò)小眼-相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(MITF)調(diào)節(jié)。該基因是多態(tài)的，具有3個(gè)主要等位基因ApoE2、ApoE3、ApoE4，其翻譯成蛋白質(zhì)的3個(gè)同種型:正常-ApoE-E3 ;功能障礙-ApoE_E2和ApoE_E4。這些同種型僅通過(guò)在位置112和158的一個(gè)氨基酸取代彼此不同。卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)是由肝產(chǎn)生的血漿酶，并且催化脂蛋白上膽固醇向膽固醇基酯的轉(zhuǎn)化，其通過(guò)從磷脂酰膽堿sn-2位到膽固醇A-環(huán)上3-羥基的脂肪酸轉(zhuǎn)酰基化。大部分LCAT活性見于高密度脂蛋白(HDL)上，但約30%也在含載脂蛋白(Apo)B的脂蛋白上。載脂蛋白E基因是多態(tài)的，具有3個(gè)主要等位基因ApoE2、ApoE3、ApoE4。E2與遺傳病癥III型高脂蛋白血癥、并且與動(dòng)脈硬化的增加和降低的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。E3見于約64%的群體中?？紤]“中性”Apo E基因型。E4也有助于動(dòng)脈硬化癥和阿爾茨海默茲病、認(rèn)知功能受損和軸突生長(zhǎng)減弱。LCAT促進(jìn)反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，通過(guò)該途徑，過(guò)量的細(xì)胞膽固醇返回肝臟進(jìn)行排泄。不希望束縛于理論，機(jī)制包括例如:LCAT增加HDL水平，HDL本身可通過(guò)增加膽固醇細(xì)胞外受體的量增加膽固醇從細(xì)胞的流動(dòng)。同時(shí)，膽固醇通過(guò)HDL上LCAT的酯化可限制膽固醇從HDL向細(xì)胞的自發(fā)向后交換并且促進(jìn)HDL上膽固醇向肝臟的凈輸送。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸用于預(yù)防或治療與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因家族成員相關(guān)的疾病或病癥?？捎脧睦梅戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因介導(dǎo)疾病和病癥包括:心血管疾病或病癥，代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖、血脂異常、高血脂、高胰島素血癥、高膽固醇血癥等)，與脂質(zhì)代謝受損有關(guān)的疾病或病癥，冠狀動(dòng)脈疾病，動(dòng)脈硬化癥，HDL代謝疾病或病癥(例如，家族性HDL缺乏(FHD)、海藍(lán)組織細(xì)胞增生癥、丹吉爾病、魚眼病、LCAT缺乏、低HDL膽固醇血癥等)，與細(xì)胞膽固醇和/或磷脂穩(wěn)態(tài)有關(guān)的疾病或病癥，家族性淀粉樣腎病，與膽固醇調(diào)節(jié)受損有關(guān)的疾病或病癥，與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺乏有關(guān)的疾病或病癥，載脂蛋白A-1缺乏，與異?？旎虍惓Ｂ俚募?xì)胞中膽固醇流出有關(guān)的疾病或病癥，與胰腺β細(xì)胞功能有關(guān)的疾病或病癥，糖尿病，代謝疾病或病癥，關(guān)節(jié)炎，炎癥，自身免疫疾病或病癥，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，炎癥，神經(jīng)疾病 或病癥，神經(jīng)變性疾病或病癥，癌癥，血脂異常，代謝綜合征，老年斑，腦淀粉樣血管病，淀粉樣變，惡性膠質(zhì)瘤，與淀粉樣沉積有關(guān)的疾病或病癥，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，絨毛膜癌，星形細(xì)胞瘤，淀粉樣變，高脂血癥，瘤轉(zhuǎn)化，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，阻塞，轉(zhuǎn)移，肺纖維化，壞死，休克，黑素瘤，遺傳易感性，牛皮癬，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，神經(jīng)病理，血管病，細(xì)胞損傷，非小細(xì)胞肺癌(NSCLCs)，脂肪肉瘤，免疫缺陷疾病或病癥，器官移植排斥，變態(tài)反應(yīng)，腎小球腎炎，靜脈血栓，病理過(guò)程或白血病，骨骼疾病或病癥，肌肉疾病或病癥，與感染生物有關(guān)的疾病或病癥，免疫相關(guān)疾病或病癥，神經(jīng)損害和麻痹，神經(jīng)內(nèi)分泌分化，系統(tǒng)性非神經(jīng)病淀粉樣變，淀粉樣蛋白病，依賴于血管發(fā)生的腫瘤生長(zhǎng)，非癌性疾病伴包括血管發(fā)生增加的癥狀，例如牛皮癬，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，脈絡(luò)膜病，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病，物質(zhì)濫用，認(rèn)知功能受損，和軸突生長(zhǎng)減少，與正常對(duì)照相比ApoE異常表達(dá)、功能、活性，牛皮癬，外源生物如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、真菌引起的疾病或病癥，等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因反義寡核苷酸在治療上用于器官移植(例如，肝移植、腎移植、骨髓移植、心臟移植等)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸對(duì)于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的多核苷酸特異，其包括但不限于非編碼區(qū)。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因靶包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的變體；脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的突變體，包括SNPs ;脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義RNA分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不限于單獨(dú)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸，還延伸至脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的同種型、受體、同系物、非編碼區(qū)等中的任何。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因靶的天然反義序列(對(duì)于編碼和非編碼區(qū)天然反義)，包括但不限于關(guān)于其的變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括其中不同堿基存在于化合物中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺嘌呤，那么可以產(chǎn)生在這個(gè)位置上包含胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可以在反義化合物的任何位置上完成。這些化合物隨后使用本文描述的方法進(jìn)行測(cè)試，以測(cè)定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，在反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約50%到約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約60%到約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約70%到約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約80%到約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。當(dāng)化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以引起活性喪失時(shí)，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，反義化合物是可特異性雜交的。此類條件包括即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況下的生理?xiàng)l件，和其中在體外測(cè)定情況下執(zhí)行測(cè)定的條件。當(dāng)化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能以引起效用喪失時(shí)，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié) 合，即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況下在生理?xiàng)l件下，和在體外測(cè)定情況下在其中執(zhí)行測(cè)定的條件下，反義化合物無(wú)論是DNA、RNA、嵌合、置換的等是可特異性雜交的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的靶向包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定且擴(kuò)增的反義序列，如SEQ ID N0:8 - 22所示序列的一個(gè)或多個(gè)等，調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照比較，表達(dá)或功能是上調(diào)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與對(duì)照比較，表達(dá)或功能是下調(diào)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NOS:23 - 263所示的核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑒定且擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。在本發(fā)明的修飾寡核苷酸中可以與糖或糖類似物部分附著的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸鏈烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，及其摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸內(nèi)本身也是已知的，并且無(wú)需在本文中描述。反義的特異性和敏感性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員用于治療用途。反義寡核苷酸已在動(dòng)物和人中的疾病狀態(tài)治療中用作治療部分。反義寡核苷酸已安全有效地施用于人，并且眾多臨床試驗(yàn)?zāi)壳霸谶M(jìn)行中。因此確定寡核苷酸可以是有用的治療模式，其可以配置為在用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物特別是人的治療方案中有用。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡聚反義化合物特別是寡核苷酸與靶核酸分子結(jié)合，并且調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有重大功能例如RNA易位至蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、RNA剪接以獲得一種或多種mRNA種類、和可以與RNA銜接或由RNA促進(jìn)的催化活性。依賴于所需功能，此類功能可以是上調(diào)或抑制的。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少部分雜交的其他寡聚化合物。像這樣，這些化合物可以以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的背景中，使反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步過(guò)程。該過(guò)程通常以其功能待調(diào)節(jié)的靶核酸的鑒定開始。這種靶核酸可以是例如細(xì)胞基因(或由基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)，或來(lái)自感染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因。靶向過(guò)程通常還包括測(cè)定在靶 核酸內(nèi)用于反義相互作用發(fā)生的至少一個(gè)靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)，從而使得將產(chǎn)生所需效應(yīng)，例如表達(dá)的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的背景內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“區(qū)域”被定義為具有至少一個(gè)可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的區(qū)域內(nèi)是區(qū)段?！皡^(qū)段”被定義為在靶核酸內(nèi)的較小或亞部分區(qū)域。如在本發(fā)明中使用的，“位點(diǎn)”被定義為在靶核酸內(nèi)的位置。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義序列結(jié)合，并且調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因(SEQ ID NO:1)的表達(dá)和/或功能。反義序列的例子包括 SEQ ID NOS:8-263。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段結(jié)合，并且調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因有義或反義多核苷酸的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義序列具有特異性，其中寡核苷酸與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NOS:23 - 263所示序列，使用例如PCR、雜交等鑒定且擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。修飾的鍵或核苷酸間鍵合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。在本發(fā)明的修飾寡核苷酸中可以與糖或糖類似物部分附著的磷衍生物(或修飾的磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸鏈烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，及其摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸內(nèi)本身也是已知的，并且無(wú)需在本文中描述。因?yàn)槿绫绢I(lǐng)域已知的，翻譯起始密碼子一般是5’ -AUG (在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應(yīng)DNA分子中為5’ -ATG)，所以翻譯起始密碼子也被稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有含RNA序列5’ -GUG、5’ -UUG或5’ -CUG的翻譯起始密碼子；并且5’ -AUA、5’ -ACG和5’ -⑶G已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可以包含許多密碼子序列，即使每種情況下的起始子氨基酸一般是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核生物和原核生物基因可以具有2個(gè)或更多個(gè)可變起始密碼子，其中任何一個(gè)都可以優(yōu)先用于在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定條件組下的翻譯起始。在本發(fā)明的背景中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”指這樣的一個(gè)或多個(gè)密碼子，其在體內(nèi)用于起始由編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯，與此類密碼子的一種或多種序列無(wú)關(guān)?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可以具有三種序列即5’ -UAA、5’ -UAG和5’ -UGA (相應(yīng)DNA序列分別是5’ _TAA、5’ -TAG和5’ -TGA)之一 O術(shù)語(yǔ)“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”指此類mRNA或基因的部分，其包含從翻譯起始密碼子開始在任一方向中(即，5’或3’)的約25到約50個(gè)鄰接核苷酸。類似地，術(shù)語(yǔ)“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”指此類mRNA或基因的部分，其包含從翻譯終止密碼子開始在任一方向中(即，5’或3’)的約25到約50個(gè)鄰接核苷酸。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”)是可以用本發(fā)明的反義化合物有效靶向的所有區(qū)域。本領(lǐng)域已知的、指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域的可讀框(0RF)或“編碼區(qū)”也是可以有效靶向的區(qū)域。在本發(fā)明的背景內(nèi)，靶向區(qū)域是包含基因可讀框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)域。另一種靶區(qū)域包括本領(lǐng)域已知的5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)，指從翻譯起始密碼子開始在5’方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的5’加帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的相應(yīng)核苷酸)。另外一種靶區(qū)域包括本領(lǐng)域已知的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，指從翻譯終止密碼子開始在3’方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上的相應(yīng)核苷酸)。mRNA的5’加帽位點(diǎn)包括經(jīng)由5’-5’三磷酸鍵與mRNA的5’最末端殘基鄰接的N7-甲基化鳥苷殘基。mRNA的5’加帽區(qū)被視為包括5’加帽結(jié)構(gòu)自身以及與加帽位點(diǎn)相鄰的前50個(gè)核苷酸。關(guān)于本發(fā)明的另一種靶區(qū)域是5’加帽區(qū)。盡管一些真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄物是直接翻譯的，但許多包含稱為“內(nèi)含子”的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，這在其翻譯前從轉(zhuǎn)錄物中切除。其余(和因此翻譯的)區(qū)域稱為“外顯子”，并且一起剪接以形成連續(xù)mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向剪接位點(diǎn)即內(nèi)含子-外顯子連接或外顯子-內(nèi)含子連接在下述情況下是特別有用的，當(dāng)異常剪接牽涉疾病時(shí)，或當(dāng)特定剪接產(chǎn)物的生產(chǎn)過(guò)剩牽涉疾病時(shí)。由于重排或缺失的異常融合連接是靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案。經(jīng)由來(lái)自不同基因來(lái)源的2種(或更多種)mRNAs的剪接過(guò)程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。內(nèi)含子可以使用靶向例如DNA或mRNA前體的反義化合物有效靶向。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)結(jié)合，并且調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與天然反義多核苷酸結(jié)合，并且調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與有義多核苷酸結(jié)合，并且調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。

可變RNA轉(zhuǎn)錄物可以由DNA的相同基因組區(qū)域產(chǎn)生。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱為“變體”。更具體而言，“mRNA前體變體”是由相同基因組DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物，其在其起始或終止位置中不同于由相同基因組DNA產(chǎn)生的其他轉(zhuǎn)錄物，并且包含內(nèi)含子和外顯子序列。在剪接過(guò)程中一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)域或其部分切除后，mRNA前體變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體是經(jīng)加工的mRNA前體變體，并且由于剪接，每種獨(dú)特mRNA前體變體必須一直產(chǎn)生獨(dú)特mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。如果不發(fā)生mRNA前體變體的剪接，那么mRNA前體變體等同于mRNA變體。變體可以通過(guò)使用可變信號(hào)產(chǎn)生以起始或終止轉(zhuǎn)錄。mRNAs前體和mRNAs可以具有多于一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。源于使用可變起始密碼子的mRNA前體或mRNA的變體稱為那種mRNA前體或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的這些轉(zhuǎn)錄物稱為那種mRNA前體或mRNA的“可變終止變體”。一個(gè)具體類型的可變終止變體是“多聚腺苷酸變體”，其中所產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物起因于通過(guò)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的“多聚腺苷酸終止信號(hào)”之一的可變選擇，從而產(chǎn)生在獨(dú)特多聚腺苷酸位點(diǎn)上終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的背景內(nèi)，本文描述的變體類型也是靶核酸的實(shí)施方案。反義化合物與之雜交的靶核酸上的定位被定義為活性反義化合物靶向其的靶區(qū)域的至少5-核苷酸長(zhǎng)部分。盡管在本文中闡述了特定示例性靶區(qū)段的具體序列，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些用來(lái)舉例說(shuō)明且描述在本發(fā)明范圍內(nèi)的特定實(shí)施方案。另外靶區(qū)段可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到本公開內(nèi)容容易地鑒定。包括選自舉例說(shuō)明性優(yōu)選的靶區(qū)段內(nèi)的至少五(5)個(gè)連續(xù)核苷酸段的長(zhǎng)度5-100個(gè)核苷酸的靶區(qū)段被視為也適合于靶向。靶區(qū)段可以包括DNA或RNA序列，其包括從舉例說(shuō)明性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的5’末端開始的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(其余核苷酸是緊在靶區(qū)段的5’末端上游開始且繼續(xù)直至DNA或RNA包含約5到約100個(gè)核苷酸的相同DNA或RNA連續(xù)段)。類似優(yōu)選的靶區(qū)段由DNA或RNA序列表示，其包括從舉例說(shuō)明性優(yōu)選的靶區(qū)段之一的3’末端開始的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸(其余核苷酸是緊在靶區(qū)段的3’末端下游開始且繼續(xù)直至DNA或RNA包含約5到約100個(gè)核苷酸的相同DNA或RNA連續(xù)段)。無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)，用本文舉例說(shuō)明的靶區(qū)段準(zhǔn)備的本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定進(jìn)一步優(yōu)選的靶區(qū)段。一旦已鑒定一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域、區(qū)段或位點(diǎn)，就選擇與靶充分互補(bǔ)的反義化合物，即充分良好且具有足夠特異性雜交，以給出所需效應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與特定靶的反義鏈結(jié)合。寡核苷酸長(zhǎng)度是至少5個(gè)核苷酸，并且可以如此合成每個(gè)寡核苷酸靶重疊序列，從而使得合成覆蓋靶多核苷酸的完整長(zhǎng)度的寡核苷酸。靶還包括編碼以及非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)反義寡核苷酸靶向特異性核酸。使反義化合物靶向特定核酸是多步過(guò)程。該過(guò)程通常以其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列的鑒定開始。這可以是例如表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或由基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸例如非編碼RNA (ncRNA)。RNAs可以分類成(I)翻譯成蛋白質(zhì)的信使RNAs (mRNAs),和(2)非蛋白質(zhì)編碼RNAs(ncRNAs)。ncRNAs包括微小RNAs、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度終止密碼子且缺乏任何廣泛“可讀框”的 其他轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNAs看起來(lái)從蛋白質(zhì)編碼基因座的3’非翻譯區(qū)(3’ UTRs)中的起始位點(diǎn)開始。ncRNAs通常是罕見的，并且已通過(guò)FANTOM協(xié)會(huì)測(cè)序的至少一半ncRNAs看起來(lái)不是多聚腺苷酸化的。由于顯而易見的原因，大多數(shù)研究者集中于被加工且輸出到細(xì)胞質(zhì)的多聚腺苷酸化mRNAs。近來(lái)，已顯示非多聚腺苷酸化的核RNAs組可以是極大的，并且許多此類轉(zhuǎn)錄物起于所謂的基因間區(qū)域(Cheng，J.等人(2005).Science308(5725), 1149-1154 ；Kapranov,P.等J\S2m5\Genome Res 15 (J)，987-997) 0ncRNAs通過(guò)其可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制是通過(guò)與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。通過(guò)堿基配對(duì)起作用的RNAs可以分組成(I)順式編碼RNAs，其在相同基因定位上編碼，但在針對(duì)RNAs的相反鏈上，它們作用于且因此展示出與其靶的完美互補(bǔ)性，和(2)反式編碼的RNAs，其在與它們作用于其的RNAs不同的染色體定位上編碼，并且一般不顯示出與其靶的完美堿基配對(duì)潛力。不希望受理論束縛，通過(guò)本文描述的反義寡核苷酸干擾反義多核苷酸，可以改變相應(yīng)有義信使RNAs的表達(dá)。然而，這種調(diào)節(jié)可以是不協(xié)調(diào)(反義擊倒導(dǎo)致信使RNA升高)或協(xié)調(diào)的(反義擊倒導(dǎo)致伴隨的信使RNA減少)。在這些情況下，反義寡核苷酸可以靶向反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，導(dǎo)致其擊倒或隔離(sequestration)。編碼以及非編碼反義可以以等同方式靶向，并且任一范疇都能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)有義轉(zhuǎn)錄物-以協(xié)調(diào)或不協(xié)調(diào)方式。在鑒定用于針對(duì)靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可以基于反義RNA轉(zhuǎn)錄物的擊倒，其通過(guò)反義寡核苷酸或調(diào)節(jié)所需靶的任何其他方式。策略1:在不協(xié)同調(diào)節(jié)的情況下，擊倒反義轉(zhuǎn)錄物升高常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。后面一種基因應(yīng)編碼已知或假定藥物靶，然后其反義配對(duì)物的擊倒可以想得到地模擬受體激動(dòng)劑或酶刺激物的作用。胃J :在協(xié)同調(diào)節(jié)的情況下，可以伴隨地?fù)舻狗戳x和有義轉(zhuǎn)錄物且從而達(dá)到常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同降低。如果例如反義寡核苷酸用于達(dá)到擊倒，那么這種策略可以用于應(yīng)用靶向針對(duì)有義轉(zhuǎn)錄物的一種反義寡核苷酸，和對(duì)于相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時(shí)靶向重疊有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有力地對(duì)稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義 化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單或雙鏈RNA干擾(RNAi )化合物例如siRNA化合物、和與靶核酸的至少部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。像這樣，它們可以是DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并且可以包含結(jié)構(gòu)元件例如內(nèi)部或末端凸起、錯(cuò)配或環(huán)。反義化合物照常規(guī)線性制備，但可以連接或以其他方式制備，以是環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可以包括構(gòu)建體例如雜交的2條鏈，以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自我互補(bǔ)性的單鏈，以允許雜交和形成全部或部分雙鏈的化合物。2條鏈可以內(nèi)部連接，留下游離3’或5’末端，或可以連接以形成連續(xù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以包含在5’或3’末端上的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延長(zhǎng)部分。雙鏈化合物任選可以包括在末端上的突出端。進(jìn)一步的修飾可以包括與末端之一、選擇的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一附著的綴合物基團(tuán)?？商娲?，2條鏈可以經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)由僅I條鏈形成時(shí)，dsRNA可以采取自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上折回以形成雙鏈體。因此，dsRNAs可以是全部或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可以通過(guò)dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)來(lái)達(dá)到，然而，在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能是上調(diào)的。當(dāng)由2條鏈或單鏈形成時(shí)，所述單鏈采取在其自身上折回以形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，2條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)是以沃森-克里克形式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。
一旦引入系統(tǒng)中，本發(fā)明的化合物就可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的作用，以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可以經(jīng)由基于占據(jù)機(jī)制工作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為“DNA樣的”(B卩，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’ -脫氧糖，并且一般是T而不是U堿基)或“RNA樣的”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’ -羥基或2’ -修飾的糖，并且一般是U而不是T堿基)。核酸螺旋可以采用超過(guò)一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常A和B形。一般而言，認(rèn)為具有B形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“DNA樣的”，并且具有A形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“RNA樣的”。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可以包含A和B形區(qū)域。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所需寡核苷酸或反義化合物包括下述至少一種:反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包括修飾的鍵合的反義寡核苷酸、干擾RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA);微小、干擾 RNA (miRNA);小、瞬時(shí) RNA (stRNA);或短、發(fā)夾 RNA (shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa);小激活RNAs (saRNAs)或其組合。dsRNA還可以激活基因表達(dá)，這是已命名為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機(jī)制。靶向基因啟動(dòng)子的dsRNAs誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。RNAa使用合成dsRNAs在人細(xì)胞中進(jìn)行證實(shí)，命名為“小激活RNAs”(saRNAs)。目前未知RNAa在其他生物中是否是保守的。小雙鏈RNA (dsRNA)例如小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)已發(fā)現(xiàn)是稱為RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi總是導(dǎo)致經(jīng)由重塑染色質(zhì)的基因沉默，以從而阻遏轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mRNA、或阻斷蛋白質(zhì)翻譯。然而，在下文實(shí)施例節(jié)段中詳細(xì)描述的情況下，寡核苷酸顯示增加脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNAs還可以充當(dāng)小激活RNAs (saRNA)。不希望受理論束縛，通過(guò)靶向基因啟動(dòng)子中的序列，saRNAs將在被稱為dsRNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本文鑒定的“優(yōu)選靶區(qū)段”可以用于篩選調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸表達(dá)的另外化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”是這樣的化合物，其減少或增加編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的核酸分子表達(dá)，并且包括與優(yōu)選靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5-核苷酸部分。篩選方法包括步驟:使編 碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，且選擇減少或增加編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的核酸分子表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑，所述核酸分子例如SEQ ID NO:23-263。一旦顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如減少或增加)編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的核酸分子表達(dá)，調(diào)節(jié)劑隨后就可以用于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸功能的進(jìn)一步調(diào)查研究，或用于用作依照本發(fā)明的研究、診斷或治療劑。靶向天然反義序列優(yōu)選調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因基因(例如登記號(hào) NM_005502、NM_000229、NM_002332、NM_008512、NM_000527.3、NM_00004UNM_000039,圖2)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的反義多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸祀向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸(例如，登記號(hào)NM_005502、NM_000229、NM_002332、NM_008512、NM_000527、NM_000041、NM_000039，圖 2)的有義和/或天然反義序列，關(guān)于其的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子，并且靶包括反義和/或有義脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的優(yōu)選靶區(qū)段還可以與其分別的本發(fā)明的互補(bǔ)反義化合物組合，以形成穩(wěn)定雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。此類雙鏈寡核苷酸部分在本領(lǐng)域中已顯示調(diào)節(jié)靶表達(dá)，且經(jīng)由反義機(jī)制調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，可以對(duì)雙鏈部分實(shí)施化學(xué)修飾(Fire等人，(1998)艙ture,391,806-811 ；Timmons 和 Fire，(1998)tore, 395,854 ；Timmons 等人，(2001) 263，103-112 ；Tabara 等人，(1998) 5bi<9/ c<9, 282,430-431 !Montgomery 等人(1998),
Natl.Acad.Sci.USA，95，15502-15507 ;Tuschl 等人，(1999Xfefles ifer.，13，3191-3197 ;Elbashir 等人，(2001)Λ^ τ<9,411,494-498 ;Elbashir 等人，(2001)Dev., 15,
188-200)。例如，此類雙鏈部分已顯示通過(guò)雙鏈體的反義鏈與靶的典型雜交抑制靶，從而觸發(fā)革巴的酶促降解(Ti jsterman 等人，(2002) Science, 295,694-697) 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸(例如，登記號(hào) NM_005502、NM_000229、NM_002332、NM_008512、NM_000527、NM_000041、NM_000039)、關(guān)于其的變體、等位基因、同種型、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。依照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不限于單獨(dú)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因，還延伸至脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因分子的同種型、受體、同系物等中的任何。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的天然反義序列，例如如SEQ ID NO:8-22所示的多核苷酸，以及關(guān)于其的任何變體、等位基因、同系物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的例子如SEQ ID N0:23 - 263所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因反義的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，包括但不限于與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸相關(guān)的非編碼有義和/或反義序列，且調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因分子的表達(dá)和/或功能。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸與如SEQ ID NO:8_22所示的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因天然反義的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，且調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因分子的表達(dá)和/或功倉(cāng)泛。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NOS:23 - 263的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，且調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因，包括其家族成員、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的變體；脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的突變體，包括SNPs ;脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的非編碼序列；脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的等位基因；物種變體、片段等。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的寡核苷酸包括:反義RNA、干擾RNA (RNAi)、短干擾RNA (siRNA);微小干擾RNA (miRNA);小、瞬時(shí)RNA(stRNA);或短、發(fā)夾RNA (shRNA);小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa);或小激活RNA (saRNA)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸例如SEQ ID NO:8 - 22的靶向調(diào)節(jié)這些靶的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照比較，表達(dá)或功能是上調(diào)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與對(duì)照比較，表達(dá)或功能是下調(diào)的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義化合物包括如SEQ ID NOS:23 - 263所示序列。這些寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸、較短或較長(zhǎng)片段、修飾的鍵等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NOS:23 - 263包括一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以以本領(lǐng)域已知的數(shù)種方式執(zhí)行。例如，反義寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)是能夠催化各種反應(yīng)中的一種或多種的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)切割其他分開核酸分子的能力。此類酶促核酸分子可以例如用于靶向事實(shí)上任何RNA轉(zhuǎn)錄物(Zaug等人，324，艙tore 429 1986 ;Cech，260 JAMA3030,1988 ;和 Jefferies 等人，17 Nucleic Acids Research 1371,1989)。因?yàn)槠湫蛄刑禺愋?，所以反式切割的酶促核酸分子顯示作為用于人疾病的治療劑的希望(Usman和McSwiggen, (1995) J/ / .Rep.Med.Chem.30,285-294 ；Christoffersen和Marr，( 1995) J Med.Chem.38，2023-2037)。酶促核酸分子可以設(shè)計(jì)為切割在細(xì)胞RNA背景內(nèi)的特異性RNA靶。此類切割事件致使mRNA無(wú)功能且取消來(lái)自那種RNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。以這種方式，可以選擇性抑制與疾病狀態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成。一般而言，具有RNA切割活性的酶促核酸通過(guò)首先與靶RNA結(jié)合起作用。此類結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，所述酶促核酸與分子的酶促部分保持緊密接近，所述分子作用于切割靶RNA。因此，酶促核酸首先識(shí)別且隨后通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，并且一旦與正確位點(diǎn)結(jié)合，就酶促作用以切割靶RNA。此類靶RNA的策略性切割將破壞其指導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)合成的能力。在酶促核酸已結(jié)合且切割其RNA靶后，它從那種RNA中釋放以搜索另一個(gè)靶，并且可以重復(fù)結(jié)合且切割新靶。幾種方法例如體外選擇(進(jìn)化)策略(Orgel, (1979)/ ^.R.Soc.London, B205,435)已用于進(jìn)化能夠催化各種反應(yīng)的新核酸催化劑，例如磷酸二酯鍵和酰胺鍵的切割和連接(Joyce，(1989) 82,83-87 ；Beaudry 等人，(.1992) Science 257,635-641 ；Joyce, (1992) Scientific American 267，90-97 ;Breaker 等人，(1994)12,268 ；Bartel 等人，(1993) 261:1411-1418 ；Szostak, (1993) TIBS 17，89-93 ;Kumar 等人，(1995)/7；，9 ，1183 ;Breaker，(1996)0/rr.0p.Biotech.， 對(duì)于催化活性最佳的核酶的開發(fā)將顯著促成采用RNA切割核酶用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)目的的任何策略。錘頭核酶例如在飽和(10 mM)濃度的Mg2+輔因子的存在下以約I分鐘―1的催化速率(kMt)起作用。人工“RNA連接酶”核酶已顯示以約100分鐘―1的速率催化相應(yīng)自我修飾反應(yīng)。此外，已知具有由DNA制成的底物結(jié)合臂的特定修飾的錘頭核酶催化RNA切割，具有達(dá)到100分鐘―1的多重周轉(zhuǎn)率。最后，用特定核苷酸類似物替換在錘頭的催化核心內(nèi)的特定殘基給出在催化速率中顯示多達(dá)10倍改善的修飾核酶。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)核酶可以促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化，其催化速率明顯大于由大多數(shù)天然自我切割性核酶在體外展示出的那些。隨后可能可以最佳化特定自我切割性核酶的結(jié)構(gòu)，以給出最大限度催化活性，或可以制備完全新的RNA基序，其展示出對(duì)于RNA磷酸二酯切割明顯更快的速率。RNA底物通過(guò)擬合“錘頭”模型的RNA催化劑的分子間切割首先在1987年顯示(Uhlenbeck, 0.C.(1987)艙iare，328:596_600)。RNA 催化劑恢復(fù)且與多種 RNA 分子反應(yīng)，證實(shí)它是真正催化性的?；凇板N頭”基序設(shè)計(jì)的催化RNAs已用于切割特異性靶序列，這通過(guò)在催化RNA中進(jìn)行合適的堿基改變，以維持與靶序列的必需堿基配對(duì)(Haseloff和Gerlach，( 1988)Nature, 334, 585 ；ffalbot 和 Bruening, (19SS)Nature, 334,196 ；Uhlenbeck, 0.C.(1987)Nature:596-600 ；Koizumi, M.，等人(1988)/Lett.，228:228_230)。這已允許使用催化RNA以切割特異性靶序列，且指出根據(jù)“錘頭”模型設(shè)計(jì)的催化RNA可以在體內(nèi)可能地切割特異性底物 RNAs0 (參見 Haseloff 和 Gerlach, (1988)艙iare，334，585 ；ffalbot 和Bruening, (I9d>d>)Nature, 334,196 ；Uhlenbeck, 0.C.(1987)Tfeiare, 328:596_600)。RNA干擾(RNAi)已成為用于調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)的有力工具。這種方法要求作為RNA自身或作為DNA的小干擾RNA (siRNA)遞送，其使用表達(dá)質(zhì)粒或病毒和用于加工為siRNAs的小發(fā)夾RNAs的編碼序列。這個(gè)系統(tǒng)使得siRNAs前體能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)至它們?cè)谄渲谢钴S的細(xì)胞質(zhì)，且允許使用調(diào)節(jié)和組織特異性啟動(dòng)子用于基因表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)，或其模擬物、嵌合體、類似物或同系物的寡聚物或聚合物。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括由天然存在的核苷酸、糖和共價(jià)核苷間(主鏈)鍵合組成的寡核苷酸，以及類似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。通常需要此類修飾的或取代的寡核苷酸超過(guò)天然形式，由于所需性質(zhì)例如細(xì)胞攝取增強(qiáng)、對(duì)于靶核酸的親和力增強(qiáng)和在核酸酶的存在下的穩(wěn)定性增加。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如，RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同系物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA、和與靶核酸的至少部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。像這樣，它們可以是DNA、RNA、DNA樣、RNA樣或其混合物，或可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物，并且可以包含結(jié)構(gòu)元件例如內(nèi)部或末端凸起、錯(cuò)配或環(huán)。反義化合物照常規(guī)線性制備，但可以連接或以其他方式制備，以是環(huán)狀和/或分支的。反義化合物可以包括構(gòu)建體例如雜交的2條鏈，以形成完全或部分雙鏈的化合物，或具有足夠自我互補(bǔ)性的單鏈，以允許雜交和形成全部或部分雙鏈的化合物。2條鏈可以內(nèi)部連接，留下游離3’或5’末端，或可以連接以形成連續(xù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以包含在5’或3’末端上的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延長(zhǎng)部分。雙鏈化合物任選可以包括在末端上的突出端。進(jìn)一步的修飾可以包括與末端之一、選擇的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵合之一附著的綴合物基團(tuán)。可替代地，2條鏈可以經(jīng)由非核酸部分或接頭基團(tuán)連接。當(dāng)由僅I條鏈形成時(shí)，dsRNA可以采取自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，其在其自 身上折回以形成雙鏈體。因此，dsRNAs可以是全部或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可以通過(guò)dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的穩(wěn)定表達(dá)來(lái)達(dá)到(Hammond 等人，(1991)艙(Rev.Genet., 2,110-119 ;Matzke 等人，(2001) Curr.0pin.Genet.Dev., 11,221-227 ；Sharp, (2001) Genes Dev., 15,485-490)o 當(dāng)由 2 條鏈或單鏈形成時(shí)，所述單鏈采取在其自身上折回以形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式，2條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū)域)是以沃森-克里克形式堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。一旦引入系統(tǒng)中，本發(fā)明的化合物就可以引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的作用，以實(shí)現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可以經(jīng)由基于占據(jù)機(jī)制工作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可以描述為“DNA樣的”(B卩，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’ -脫氧糖，并且一般是T而不是U堿基)或“RNA樣的”(即，一般具有一個(gè)或多個(gè)2’ -羥基或2’ -修飾的糖，并且一般是U而不是T堿基)。核酸螺旋可以采用超過(guò)一種類型的結(jié)構(gòu)，最通常A和B形。一般而言，認(rèn)為具有B形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“DNA樣的”，并且具有A形樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸是“RNA樣的”。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可以包含A和B形區(qū)域。依照本發(fā)明的反義化合物可以包括長(zhǎng)度約5 -約80個(gè)核苷酸(即約5 -約80個(gè)連接核苷)的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長(zhǎng)度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包括5 -約80個(gè)核苷酸，并且本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包括長(zhǎng)度5 -約80個(gè)核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這包含長(zhǎng)度 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或 80個(gè)核苷酸，或其內(nèi)的任何范圍的反義部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長(zhǎng)度10 - 50個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這體現(xiàn)了具有長(zhǎng)度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49或50個(gè)核苷酸,或其內(nèi)的任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度是15個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有長(zhǎng)度12或13 - 30個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解這體現(xiàn)了具有長(zhǎng)度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸，或其內(nèi)的任何范圍的反義部分的反義化合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括其中不同堿基存在于化合物中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺苷，那么可以產(chǎn)生在這個(gè)位置上包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可以在反義或dsRNA化合物的任何位置上完成。這些化合物隨后使用本文描述的 方法進(jìn)行測(cè)試，以測(cè)定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，在反義化合物和靶之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約40%到約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約60%到約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約70%到約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約80%到約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性是約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸例如SEQ ID NO: 8 - 263中所不的核酸分子包括一種或多種置換或修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸由鎖核酸(LNA)置換。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因和如SEQ ID NO:1-7和8-22所示序列相關(guān)的編碼和/或非編碼序列的核酸分子有義和/或反義的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。寡核苷酸還靶向SEQ ID NO:1-7和8_22的重疊區(qū)域。本發(fā)明的特定優(yōu)選寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本發(fā)明背景中的“嵌合寡核苷酸”或“嵌合體”是包含2個(gè)或更多個(gè)化學(xué)上不同區(qū)域的寡核苷酸，各自由至少一個(gè)核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸一般包含賦予一種或多種有利性質(zhì)(例如，核酸酶抗性增加、進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的攝取增加、對(duì)于靶的結(jié)合親和力增加)的修飾的核苷酸的至少一個(gè)區(qū)域，和其為關(guān)于能夠切割RNA = DNA或RNA = RNA雜交物的酶的底物的區(qū)域。例如，RNA酶H是細(xì)胞核酸內(nèi)切酶，其切割RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈。RNA酶H的激活因此導(dǎo)致RNA靶的切割，從而極大增強(qiáng)基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)效率。因此，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時(shí)，與和相同靶區(qū)域雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸比較，用較短寡核苷酸通?？梢垣@得與之相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。RNA靶的切割可以照常規(guī)通過(guò)凝膠電泳和需要時(shí)本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸包括修飾為增加靶結(jié)合親和力的至少一個(gè)區(qū)域，和通常充當(dāng)關(guān)于RNA酶H的底物的區(qū)域。寡核苷酸對(duì)于其靶(在這種情況下，編碼ras的核酸)的親和力通過(guò)測(cè)量寡核苷酸/靶對(duì)的Tm照常規(guī)進(jìn)行測(cè)定，Tffl是在其下寡核苷酸和靶解離的溫度；分光光度法測(cè)量地檢測(cè)解離。Tm越高，寡核苷酸對(duì)于靶的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可以作為如上所述的2種或更多種寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的復(fù)合結(jié)構(gòu)形成。此類化合物在本領(lǐng)域中已被稱為雜交物或gapmer。教導(dǎo)此類雜交物結(jié)構(gòu)制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于，美國(guó)專利號(hào) 5，013，830 ;5，149，797 ;5，220，007 ;5，256，775 ;5，366，878 ;5，403，711 ;5，491，133 ；5，565，350 ;5，623，065 ;5，652，355 ;5，652，356 和 5，700，922 ;其各自引入本文作為參考。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的寡核苷酸區(qū)域包括在糖的2’位置上修飾的至少一個(gè)核苷酸，最優(yōu)選2’ -O-烷基、2’ -O-烷基-O-烷基或2’ -氟-修飾的核苷酸。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA修飾包括在RNA的3’末端上在嘧啶、脫堿基殘基或倒轉(zhuǎn)堿基的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’ O-甲基修飾。此類修飾照常規(guī)摻入寡核苷酸內(nèi)，并且這些寡核苷酸已顯示具有高于2’-脫氧寡核苷酸針對(duì)給定靶的Tm (即，更高的靶結(jié)合親和力)。此類增加的親和力的效應(yīng)是為了極大增強(qiáng)基因表達(dá)的RNAi寡核苷酸抑制。RNA酶H是切割RNAiDNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞核酸內(nèi)切酶；這種酶的激活因此導(dǎo)致RNA靶的切割，并且因此可以極大增強(qiáng)RNAi抑制的 效率。RNA靶的切割可以照常規(guī)通過(guò)凝膠電泳加以證實(shí)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸也進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)核酸酶抗性。細(xì)胞包含可以降解核酸的各種核酸外切和內(nèi)切酶。許多核苷酸和核苷修飾已顯示使得它們引入其中的寡核苷酸比天然寡聚脫氧核苷酸對(duì)核酸酶降解更有抵抗力。核酸酶抗性照常規(guī)進(jìn)行測(cè)量:通過(guò)使寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離核酸酶溶液一起孵育，且通常通過(guò)凝膠電泳測(cè)量隨著時(shí)間過(guò)去剩下的完整寡核苷酸程度。已進(jìn)行修飾以增強(qiáng)其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾寡核苷酸保持完整更長(zhǎng)時(shí)間。各種寡核苷酸修飾已證實(shí)增強(qiáng)或賦予核酸酶抗性。包含至少一種硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸目前是更優(yōu)選的。在某些情況下，增強(qiáng)靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾也獨(dú)立地能夠增強(qiáng)核酸酶抗性。一些希望修飾可以在De Mesmaeker等人(1995)Jcc.Chem.Res.，28:366-374 中找到。設(shè)想用于本發(fā)明的一些優(yōu)選寡核苷酸的具體例子包括包含修飾主鏈的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵合或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵合。最優(yōu)選的是具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的那些，特別是CH2 —NH—O—CH2、CH,—N (CH3) 一O—CH2 [稱為亞甲基(甲基亞氛基)或 MMI 王鏈]、CH2—O—N (CH3)-CH2、CH2 —N (CH3) —N (CH3)-CH2 和 0—N (CH3) -CH2 -CH2 主鏈，其中天然憐酸二酯主鏈表不為 O—P—O—CH,)。由 De Mesmaeker 等人(1995)Jcc.Chem.Res.,28:366-374公開的酰胺主鏈也是優(yōu)選的。還優(yōu)選的是具有嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和Weller，美國(guó)專利號(hào)5，034，506)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，例如肽核酸(PNA)主鏈，寡核苷酸的磷酸二酯主鏈由聚酰胺主鏈替換，核苷酸與聚酰胺主鏈的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合(Nielsen等人(1991 )5bie/7ce ,254,1497)。寡核苷酸還可以包括一個(gè)或多個(gè)取代糖部分。優(yōu)選寡核苷酸在2’位置上包括下述之一:0H、SH、SCH3、F、0CN、0CH3 OCH3>OCH3 O (CH2)n CH3>O (CH2)n NH2 或 O (CH2)n CH3,其中 η 是 1-約 10 K1 - C1。低級(jí)烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基或芳烷基；C1 ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ;0—、S—或N-烷基；0—、S—或N-烯基；SOCH3 ；S02 CH3 ；ono2 ；no2 ；n3 ；nh2 ;雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基團(tuán)；報(bào)道基團(tuán)；插入劑；用于改善寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)；或用于改善寡核苷酸的藥效性質(zhì)的基團(tuán)和具有相似性質(zhì)的其他取代物。優(yōu)選修飾包括2’ -甲氧基乙氧基[2’ -O-CH2 CH2 OCH3,也稱為2’ -0-(2-甲氧基乙基)](Martin等人，(1995)汝7k Chim.Jcia，78，486)。其他優(yōu)選修飾包括2’-甲氧基(2’ -0—CH3)、2’ -丙氧基(2’ -OCH2 CH2CH3)和2’ -氟(2’ -F)。相似修飾還可以在寡核苷酸上的其他位置上進(jìn)行，特別是在3’末端核苷酸上的糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基代替戊呋喃糖基。寡核苷酸還可以另外或可替代地包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常被簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或取代。如本文使用的，“未修飾”或“天然”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括僅在天然核酸中罕見地或暫時(shí)地發(fā)現(xiàn)的核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶特別是5-甲基胞嘧啶(也被稱為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶，且在本領(lǐng)域中通常被稱為5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基HMC，以及合成核苷酸，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤、和 2，6-二氨基嘌呤。Kornberg, A., DNA Replication, W.H.Freeman & C0., SanFrancisco, 1980,第 75-77 頁(yè)；Gebeyehu, G.,等人(1987) Nucl.Acids Res.,15:4513)?？梢园ū绢I(lǐng)域已知的“通用”堿基例如肌苷。5-Me-C置換已顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加 0.6-1.2. 。(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.Τ.和 Lebleu, B.,編輯，Antisense Researchand Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993,第 276-278 頁(yè)),并且是目前優(yōu)選的喊基置換。 本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，所述部分或綴合物增強(qiáng)寡核苷酸的活性或細(xì)胞攝取。此類部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽固醇基部分(Letsinger等人，(1989)/^-6^.Natl.AcadSc1.USA，86，6553)、膽酸(Manoharan 等人(1994)Bioorg.Med.Chem.Let.，4，1053)、硫釀例如己基-S_ 三苯甲硫醇(Manoharan 等人(1992) Ann.N.Y.Acad.Sc1.，660，306;Manoharan 等人(1993)Bioorg.Med.Chem.Ze1., 3, 2765)、疏基膽固醇(Oberhauser等人，(1992)M/d Acids /fes.，20，533)、脂肪族鏈例如十二烷二醇或i^一烷基殘基(Saison-Behmoaras 等人(1991 /.1991,10, 111 ；Kabanov 等人(1990)/Zei .，259, 327 ；Svinarchuk 等人(1993)Biochimie, 75,49)、憐脂例如二 -十六燒基-消旋-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨(Manoharan等人(1995)Tetrahedron Lett.,36,3651 ；Shea 等人(1990)M/c7.Acids Tfes., 18, 3777)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等Nucleosides &14,969)、或金剛燒乙酸(Manoharan等人(1995) TfeiraAet/ro/ Lett., 36, 3651 ) 包括親脂部分的寡核苷酸和用于制備此類寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，例如美國(guó)專利號(hào)5，138,045,5,218, 105和5，459，255。給定寡核苷酸中的所有位置不一定一致地修飾，并且事實(shí)上超過(guò)一個(gè)上述修飾可以摻入單個(gè)寡核苷酸中，并且甚至在寡核苷酸內(nèi)的單個(gè)核苷上。本發(fā)明還包括了其為如上文定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子與另一種部分綴合，所述另一種部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些分子可以在糖、堿基或磷酸基上的幾個(gè)位置上與構(gòu)成核酸分子的任何核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)連接。依照本發(fā)明使用的寡核苷酸可以方便地且照常規(guī)通過(guò)眾所周知的固相合成技術(shù)進(jìn)行制備。用于此類合成的設(shè)備由幾個(gè)廠商包括Applied Biosystems銷售。還可以采用用于此類合成的任何其他方法；寡核苷酸的實(shí)際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能內(nèi)。還眾所周知的是使用相似技術(shù)以制備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。還眾所周知的是使用相似技術(shù)和商購(gòu)可得的修飾的亞酰胺(amidites)和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)物,例如生物素、突光素、吖啶或補(bǔ)骨脂素修飾的亞酰胺(amidites)和/或CPG(可從Glen Research, Sterling VA獲得)，以合成突光標(biāo)記的、生物素化的或其他修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。依照本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體以增強(qiáng)寡核苷酸的效力、特異性和作用持續(xù)時(shí)間且拓寬施用途徑包括目前化學(xué)，例如Μ0Ε、AM、FANA, PS等(Uhlman，等人(2000)Current Opinions in Drug Discovery & Development,第 3 卷 No 2)。這可以通過(guò)經(jīng)由LNA單體置換目前寡核苷酸中的一些單體來(lái)達(dá)到。LNA修飾的寡核苷酸可以具有類似于母體化合物的大小或可以更大或優(yōu)選更小。優(yōu)選此類LNA修飾的寡核苷酸包含小于約70%、更優(yōu)選小于約60%、最優(yōu)選小于約50%的LNA單體，并且其大小為約5 - 25個(gè)核苷酸、更優(yōu)選約12-20個(gè)核苷酸。優(yōu)選修飾的寡核苷酸主鏈包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3’ -5’鍵合的硼磷酸酯(boranophosphates),這些的 2’ _5’連接類似物,和具有倒轉(zhuǎn)極性的那些,其中核苷單位的相鄰對(duì)3’-5’與5’-3’或2’-5’與5’-2’連接。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導(dǎo)上述含磷鍵合制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)3，687，808 ；4，469，863 ;4，476，301 ;5，023，243 ;5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ;5，276，019 ；5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ;5，399，676 ;5，405, 939 ;5，453，496 ;5，455，233 ；5，466，677 ;5，476，925 ;5，519，126 ;5，536，821 ;5，541，306 ;5，550, 111 ;5，563，253 ；5，571,799 ;5，587，361 ;和5，625，050，其各自引入本文作為參考。其中不包括磷原子的優(yōu)選修飾寡核苷酸主鏈具有這樣的主鏈，其通過(guò)短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成。這些包括具有嗎啉代鍵合的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧燒主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；formacetyl和硫代formacetyl主鏈；亞甲基formacetyl和硫代formacetyl主鏈；含鏈烴主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；和具有混合的N、O、S和CH2組分部分的其他。教導(dǎo)上述寡核苷制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)5，034，506;5，166，315 ;5，185，444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235，033 ;5，264，562 ;5，264，564 ；5，405，938 ；5, 434，257 ；5, 466，677 ；5, 470，967 ；5, 489，677 ；5, 541，307 ；5, 561，225 ；5，596，086 ；5, 602, 240 ；5, 610, 289 ；5, 602, 240 ；5, 608, 046 ；5, 610, 289 ；5, 618，704 ；5，623，070 ；5, 663，312 ；5, 633，360 ；5, 677，437 ;和 5，677，439，其各自引入本文作為參考。在其他優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間鍵合即主鏈由新型基團(tuán)替換。維持這些堿基單位用于與合適的核酸靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，已顯示具有極佳雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物，被稱為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主鏈由含酰胺主鏈替換，特別是氨乙基甘氨酸主鏈。核堿基被保留且與主鏈的酰胺部分的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合。教導(dǎo)PNA化合物制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)5，539，082 ;5，714，331 ;和5，719，262，其各自引入本文作為參考。PNA化合物的進(jìn)一步教導(dǎo)可以在 Nielsen 等人，(1991)254，1497-1500 中找到。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷，且特別是稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI主鏈的-CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-'-CH2-O-N (CH3)-CH2-,-CH2N (CH3)-N (CH3)CH2-和-0-N (CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯主鏈表示為上文提及的美國(guó)專利號(hào)5，489，677的O-P-O-CH2-,和上文提及的美國(guó)專利號(hào)5，602，240的酰胺主鏈。還優(yōu)選的是具有上文提及的美國(guó)專利號(hào)5，034，506的嗎啉代主鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾寡核苷酸還可以包括一個(gè)或多個(gè)取代糖部分。優(yōu)選寡核苷酸在2’位置上包括下述之一:0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或0烷基_0_烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C2至CO烯基和炔基。特別優(yōu)選的是 O (CH2)n O111CHyO (CH2)n, OCH3 > O (CH2)nNH2, O (CH2) nCH3、O (CH2)nONHjPO(CH2nON (CH2)nCH3) 2，其中η和m可以是1-約10。其他優(yōu)選寡核苷酸在2’位置上包括下述之一:C至CO、(低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3> 0CN、Cl、Br、CN、CF3> OCF3> SOCH3> S02CH3> ONO2, NO2, N3> NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、插入劑、用于改善寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或用于改善寡核苷酸的藥效性質(zhì)的基團(tuán)、和具有相似性質(zhì)的其他取代物。優(yōu)選修飾包括2’ -甲氧基乙氧基(2’ -O-CH2CH2OCH3,也稱為2’ -O- (2-甲氧基乙基)或 2’_M0E) (Martin 等人，(1995Chim.Jcia, 78,486-504),即燒氧基燒氧基基團(tuán)。進(jìn)一步優(yōu)選的修飾包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O (CH2)2ON (CH3)2基團(tuán)，也稱為2’-DMA0E，如本文下文實(shí)施例中所述，和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為 2’ _0_ _■甲基氣基乙氧基乙基或 2’ -DMAEOE ),即 2’ _0_CH2_0_CH2_N (CH2) 2。其他優(yōu)選修飾包括2’ -甲氧基(2’ -O CH3 )、2’ -氨基丙氧基(2’ -O CH2CH2CH2NH2^P2’-氟(2’-F)。相似修飾還可以在寡核苷酸上的其他位置上進(jìn)行，特別是在3’末端核苷酸上糖的3’位置或在2’-5’連接寡核苷酸中和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸還可以具有糖模擬物例如環(huán)丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教導(dǎo)此類修飾糖結(jié)構(gòu)物制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào) 4，981，957 ;5，118，800 ;5，319，080 ;5，359，044 ;5，393，878 ；5，446，137 ;5，466，786 ;5，514，785 ;5，519，134 ;5，567，811 ;5，576，427 ;5，591，722 ；5，597，909 ;5，610，300 ;5，627，053 ;5，639，873 ;5，646，265 ;5，658，873 ;5，670，633 ；和5，700, 920，其 各自引入本文作為參考。寡核苷酸還可以包括核堿基(在本領(lǐng)域中通常被簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或取代。如本文使用的，“未修飾”或“天然”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如
5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、
6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵素、8-氨基、8-硫醇、8-硫燒基、8-輕基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-齒素特別是5-溴、5- 二氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤(methylquanine)和7_甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤、以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。進(jìn)一步地，核苷酸包括公開于美國(guó)專利號(hào)3，687,808中的那些，公開于’TheConcise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering’ , 第 858-859 頁(yè)，Kroschwitz, J.1., ed.John Wiley 和 Sons, 1990 中的那些，由 Englisch 等人，’ AngewandleChemie, International Edition’，1991, 30,第 613 頁(yè)公開的那些，和由 Sanghvi, Y.S.,第15 章，’Antisense Research and Applications’，第 289-302 頁(yè)，Crooke, S.Τ.和 Lebleu,B.ea.，CRC Press，1993公開的那些。這些核苷酸中的一些特別用于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.和 Lebleu, B.,編輯，'Antisense Research and Applications' , CRC Press, Boca Raton,1993,第 276-278頁(yè))，并且是目前優(yōu)選的堿基置換，更加特別當(dāng)與2’ -O-甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)。教導(dǎo)上述修飾核苷酸以及其他修飾核苷酸制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào) 3，687，808 以及 4，845，205 ;5，130， 302 ;5，134，066 ;5，175，273 ;5，367，066 ；5，432，272 ;5，457，187 ;5，459，255 ;5，484，908 ;5，502，177 ;5，525，711 ;5，552，540 ；5，587，469 ;5，596，091 ;5，614，617 ;5，750，692 和 5，681，941，其各自引入本文作為參考。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，所述部分或綴合物增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。此類部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分(Letsinger等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86,6553-6556)、膽酸(Manoharan 等尺，Bioorg.MecLChem.Let.，4，1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan 攀yL (1992) Ann.N.Y.Acad.Sc1.，660，306-309 ;Manoharan 等人，(1993) Bioorg.Med.Chem.Let., 3,2765-2770)、巰基膽固醇(Oberhauser 等人，(1992)M/c7.Acids Res.，20，533-538)、脂肪族鏈例如十二烷二醇或i^一烷基殘基(Kabanov等人，(1990)/Lett.，259，327-330 ；Svinarchuk等人，(1993)i iocAi ie, 75,49-54)、磷脂例如二 -十六燒基-消旋-甘油或1，2- 二 -O-十六燒基-消旋-甘油-3-H-勝酸三乙銨(Manoharan等人,(V^DTetrahedronLett.，36，3651-3654 ；Shea 等人，(1990)M/c7.Acids Res.，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等人(1995)Nucleosides & Nucleotides，14，969-973)、或金剛燒乙酸(Manoharan 攀yL (1995) Tetrahedron Lett., 36,3651-3654)、棕櫚酸基部分(Mishra 等yL (1995)Biochim.Biophys.Jcia, 1264, 229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基 _t 輕膽固醇部分(Crooke 等人，(1996)7； Pharmacol.Exp. er., 277,923-937)。教導(dǎo)此類寡核苷酸綴合物制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)4，828，979 ;4，948，882 ;5，218，105 ;5，525，465 ;5，541，313 ;5，545，730 ;5，552,538 ；5，578，717，5，580, 731 ;5，580, 731 ;5，591，584 ;5，109, 124 ;5，118，802 ;5，138，045 ；5，414，077 ;5，486,603 ;5，512，439 ;5，578，718 ;5，608，046 ;4，587，044 ;4，605，735 ；4，667，025 ;4，762，779 ;4，789，737 ;4，824，941 ;4，835，263 ;4，876，335 ;4，904，582 ；4，958，013 ;5，082,830 ;5，112，963 ;5，214，136 ;5，082，830 ;5，112，963 ;5，214，136 ；5，245，022 ;5，254，469 ;5，258，506 ;5，262，536 ;5，272，250 ;5，292，873 ;5，317，098 ；5，371，241，5，391，723 ;5，416，203，5，451，463 ;5，510，475 ;5，512，667 ;5，514，785 ；5，565，552 ;5，567，810 ;5，574，142 ;5，585，481 ;5，587，371 ;5，595，726 ;5，597，696 ；5，599，923 ;5，599，928和5，688，941，其各自引入本文作為參考。身'激及發(fā):本發(fā)明的化合物還可以應(yīng)用于藥物開發(fā)和靶確認(rèn)領(lǐng)域。本發(fā)明包含在藥物開發(fā)努力中使用本文鑒定的化合物和優(yōu)選靶區(qū)段，以闡明在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或病狀之間存 在的關(guān)系。這些方法包括檢測(cè)或調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸，其包括使樣品、組織、細(xì)胞或生物與本發(fā)明的化合物接觸，在治療后某時(shí)測(cè)量脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的核酸或蛋白質(zhì)水平和/或相關(guān)表型或化學(xué)終末點(diǎn)，和任選地使測(cè)量值與非處理樣品或用本發(fā)明的進(jìn)一步化合物處理的樣品比較。這些方法還可以與其他實(shí)驗(yàn)平行或組合執(zhí)行，以測(cè)定未知基因的功能用于靶確認(rèn)過(guò)程，或測(cè)定特定基因產(chǎn)物作為用于治療或預(yù)防特定疾病、病狀或表型的靶的有效性。評(píng)估基因表達(dá)的上調(diào)或抑制:
外源核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞或生物內(nèi)可以通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)胞或生物中核酸的存在進(jìn)行評(píng)估。此類檢測(cè)可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的幾種方法來(lái)達(dá)到。例如，外源核酸的存在可以通過(guò)DNA印跡或通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)使用特異性擴(kuò)增與核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物進(jìn)行檢測(cè)。外源核酸的表達(dá)還可以使用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)量，包括基因表達(dá)分析。例如，由外源核酸產(chǎn)生的mRNA可以使用RNA印跡和逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)且定量。來(lái)自外源核酸的RNA表達(dá)也可以通過(guò)測(cè)量酶促活性或報(bào)道蛋白質(zhì)活性進(jìn)行檢測(cè)。例如，反義調(diào)節(jié)活性可以作為靶核酸表達(dá)中的減少或增加間接地進(jìn)行測(cè)量，作為外源核酸產(chǎn)生效應(yīng)子RNA的指示?；谛蛄斜Ｊ匦裕梢栽O(shè)計(jì)引物且用于擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)。最初，來(lái)自每種基因最高度表達(dá)的編碼區(qū)可以用于構(gòu)建模型對(duì)照基因，盡管可以使用任何編碼或非編碼區(qū)。每種對(duì)照基因通過(guò)將每個(gè)編碼區(qū)插入報(bào)道編碼區(qū)及其多聚腺苷酸信號(hào)之間進(jìn)行裝配。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生具有在基因上游部分中的報(bào)道基因和在3’非編碼區(qū)中的潛在RNAi靶的mRNA。個(gè)別反義寡核苷酸的有效性將通過(guò)報(bào)道基因的調(diào)節(jié)進(jìn)行評(píng)估。在本發(fā)明的方法中有用的報(bào)道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(ΑΡ)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(⑶S)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、藍(lán)色熒光蛋白(CFP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)及其衍生物。多重可選標(biāo)記是可獲得的，其賦予對(duì)于氨芐青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、草胺膦、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。測(cè)定報(bào)道基因調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括但不限于熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、熒光顯微鏡檢查)、抗生素抗性測(cè)定。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文其它處描述的方法分析。例如，免疫分析如ELISA可用于測(cè)量蛋白質(zhì)水平。用于ELISAs的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因抗體可從例如 R&D Systems (Minneapolis, MN), Abeam, Cambridge,MA購(gòu)得。在各實(shí)施方案中，用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品(例如體內(nèi)或體外細(xì)胞或組織)中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因表達(dá)(例如mRNA或蛋白質(zhì))通過(guò)與對(duì)照樣品中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因表達(dá)比較進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，蛋白質(zhì)或核酸的表達(dá)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法與模擬處理或未處理樣品比較?？蛇x地，與用對(duì)照反義寡核苷酸處理的樣品(例如，具有改變或不同序列)的比較可以取決于所需信息進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，處理相對(duì)于未處理樣品中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因蛋白質(zhì)或核酸表達(dá)中的差異可以用處理樣品相對(duì)于未處理樣品中不同核酸(包括研究者認(rèn)為合適的任何標(biāo)準(zhǔn)，例如管家基因)表達(dá)中的差異進(jìn)行比較。觀察的差異可以按希望表示，例如，以比或分?jǐn)?shù)的形式，用于與對(duì)照比較。在各實(shí)施方案中，相對(duì)于未處理樣品或用對(duì)照核酸處理的樣品，用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因mRNA或蛋白質(zhì)的水平增加或降低約1.25-倍至約10-倍或更多。在各實(shí)施方案中，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因mRNA或蛋白質(zhì)的水平增加或降低至少約1.25-倍、至少約1.3-倍、至少約1.4-倍、至少約1.5-倍、至少約1.6-倍、至少約1.7-倍、至少約1.8-倍、至少約2-倍、至少約2.5-倍、至少約3-倍、至少約3.5-倍、至少約4-倍、至少約
4.5-倍、至少約5-倍、至少約5.5-倍、至少約6-倍、至少約6.5-倍、至少約7-倍、至少約7.5-倍、至少約8-倍、至少約8.5-倍、至少約9-倍、至少約9.5-倍、至少約10_倍或更多。試劑盒、研究試劑、診斷和治療
本發(fā)明的化合物可以用于診斷、治療和預(yù)防，并且用作研究試劑和試劑盒組分。此外，能夠以強(qiáng)烈特異性抑制 基因表達(dá)的反義寡核苷酸通常由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于闡明特定基因的功能，或區(qū)分生物途徑的各種成員的功能。對(duì)于在試劑盒和診斷中以及在各種生物系統(tǒng)中的使用，本發(fā)明的化合物單獨(dú)或與其他化合物或治療劑組合用作區(qū)分和/或組合分析中的工具，以闡明在細(xì)胞和組織內(nèi)表達(dá)的基因的部分或完整互補(bǔ)體的表達(dá)模式。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為任何生物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，其表達(dá)或使得能夠表達(dá)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的產(chǎn)物。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個(gè)非限制性例子，在用一種或多種反義化合物處理的細(xì)胞或組織內(nèi)的表達(dá)模式與未用反義化合物處理的對(duì)照細(xì)胞或組織比較，并且產(chǎn)生的模式就基因表達(dá)的差異水平進(jìn)行分析，因?yàn)樗鼈兝缟婕氨粰z查基因的疾病相關(guān)、信號(hào)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可以對(duì)刺激或未刺激細(xì)胞并且在影響表達(dá)模式的其他化合物的存在或不存在下執(zhí)行。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析的方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo, FEBS Lett.，480，17-24 ；Celis,等人，(.2QQQ)FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE(基因表達(dá)的系列分析(Madden,等尺，(2QQQ)Drug Discov.Tbt/ajs 5,415-425)、READS(消化 cDNAs 的限制性酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman, (1999)Methods Enzymol., 303，258-72)、TOGA (總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe,等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，97，1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis,等人，(.2QQQ)FEBS Lett.,480,2-16 ； Jungblut,等人，(1999)Α7<9 ζ η9/7Α(αΓ(95.Υ5., 20, 2100-10)、已表達(dá)序列標(biāo)記(EST)測(cè)序(Celis,等人，(2000)/Lett.,480,2-16 ；Larsson,等人，(2000)7； Biotechnol.,80，143-57)、消減 RNA 指紋法(SuRF) (Fuchs,等人，(2QQQ) AnaL Biochem.,286,91-98 ；Larson,等人，(2000) Cytometry, 41, 203-208)、消減克隆、差異顯不(DD) (Jurecic 和Belmont, (2000) β/rr.0pin.#icro/ io7., 3, 316-21 )、比較基因組雜交(Carulli,等人，(1998)7； Cell Biochem.Suppl.，31，286-96)、FISH (熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和Gusterson, (1999)Bur.J.Caflcer, 35,1895-904)和質(zhì)譜法(To,(2000^Chem.HighThroughput Screen, 3,235-41) 本發(fā)明的化合物對(duì)于研究和診斷有用，因?yàn)檫@些化合物與編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的核酸雜交。例如，以此類效率且在如本文公開的此類條件下雜交以成為有效脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，在有利于基因擴(kuò)增或檢測(cè)的條件下分別是有效引物或探針。這些引物和探針用于要求編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的核酸分子的特異性檢測(cè)的方法，和用于所述核酸分子的擴(kuò)增用于檢測(cè)或用于在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的進(jìn)一步研究中使用。本發(fā)明的反義寡核苷酸特別是引物和探針與編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的核酸的雜交可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行檢測(cè)。此類方法可以包括酶與寡核苷酸的綴合、寡核苷酸的放射性標(biāo)記、或任何其他合適的檢測(cè)方法。還可以制備使用此類檢測(cè)方法用于檢測(cè)樣品中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因水平的試劑盒。反義的特異性和敏感性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員用于治療用途。反義化合物已在動(dòng)物包括人中的疾病狀態(tài) 治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全有效地施用于人，并且眾多臨床試驗(yàn)?zāi)壳霸谶M(jìn)行中。因此確定反義化合物可以是有用的治療模式，其可以配置為在用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物特別是人的治療方案中有用。對(duì)于治療，懷疑具有可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病癥的動(dòng)物優(yōu)選人通過(guò)施用依照本發(fā)明的反義化合物進(jìn)行治療。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，該方法包括給需要治療的動(dòng)物施用治療有效量的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因調(diào)節(jié)劑有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性，或調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照比較，在動(dòng)物中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性或表達(dá)被抑制約10%。優(yōu)選地，在動(dòng)物中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性或表達(dá)被抑制約30%。更優(yōu)選地，在動(dòng)物中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性或表達(dá)被抑制50%或更多。因此，與對(duì)照比較，寡聚化合物使脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照比較,在動(dòng)物中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性或表達(dá)增加約10%。優(yōu)選地，在動(dòng)物中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性或表達(dá)增加約30%。更優(yōu)選地，在動(dòng)物中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的活性或表達(dá)增加50%或更多。因此，與對(duì)照比較，寡聚化合物使脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因mRNA的表達(dá)調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%、至少 99%或 100%。
例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的表達(dá)減少可以在動(dòng)物血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其他體液、組織或器官中進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)選地，在分析的所述液體、組織或器官中包含的細(xì)胞包含編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因肽的核酸分子和/或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因蛋白質(zhì)自身。通過(guò)將有效量的化合物加入合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中，本發(fā)明的化合物可以用于藥物組合物中。本發(fā)明的化合物和方法的使用也可以是預(yù)防上有用的。綴合物
本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學(xué)連接，所述部分或綴合物增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取。這些部分或綴合物可以包括與官能團(tuán)例如伯或仲醇羥基共價(jià)結(jié)合的綴合物基團(tuán)。本發(fā)明的綴合物基團(tuán)包括插入劑、報(bào)道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚物的藥效性質(zhì)的基團(tuán)、和增強(qiáng)寡聚物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。一般的綴合物基團(tuán)包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明的背景中，增強(qiáng)藥效性質(zhì)的基團(tuán)包括改善攝取、增強(qiáng)對(duì)降解的抗性、和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。在本發(fā)明的背景中，增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善本發(fā)明的化合物的攝取、分布、代謝或排出的基團(tuán)。代表性綴合物基團(tuán)公開于1992年10月23日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US92/09196和美國(guó)專利號(hào)6，287，860中，其引入本文作為參考。綴合物部分包括但不限于脂質(zhì)部分例如膽固醇部分、膽酸、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇、巰基膽固醇、脂肪族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-消旋-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚?；糠只蚴税坊蚣夯被?羰基-羥膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸還可以與活性藥物材料綴合，例如阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)- ( + )-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜:孽、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生素。教導(dǎo)此類寡 核苷酸綴合物的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)
4,828, 979; 4, 948, 882; 5, 218, 105; 5, 525, 465; 5, 541, 313; 5, 545, 730; 5, 552, 538;5,578,717，5, 580, 731; 5, 580, 731; 5, 591, 584; 5, 109, 124; 5, 118, 802; 5, 138, 045;
5,414, 077; 5, 486, 603; 5, 512, 439; 5, 578, 718; 5, 608, 046; 4, 587, 044; 4, 605, 735;4, 667, 025; 4, 762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941; 4, 835, 263; 4, 876, 335; 4, 904, 582;
4,958, 013; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5, 214, 136; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5, 214, 136;
5,245, 022; 5, 254, 469; 5, 258, 506; 5, 262, 536; 5, 272, 250; 5, 292, 873; 5, 317, 098;5,371,241，5, 391, 723; 5,416,203，5, 451, 463; 5, 510, 475; 5, 512, 667; 5, 514, 785;
5,565, 552; 5, 567, 810; 5, 574, 142; 5, 585, 481; 5, 587, 371; 5, 595, 726; 5, 597, 696;5，599，923; 5，599，928 和 5，688，941。制劑
本發(fā)明的化合物還可以與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式結(jié)合，作為例如脂質(zhì)體，受體靶向分子，經(jīng)口、直腸、局部或其他制劑，用于幫助攝取、分布和/或吸收。教導(dǎo)此類攝取、分布和/或吸收輔助制劑制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào) 5，108,921 ;5，354，844 ;5，416，016 ;5，459，127 ;5，521,291 ；5，543，165 ；5, 547，932 ；5, 583，020 ；5, 591，721 ；4, 426，330 ；4, 534，899 ；5, 013，556 ；5，108，921 ；5, 213，804 ；5, 227，170 ；5, 264，221 ；5, 356，633 ；5, 395，619 ；5, 416，016 ；5，417，978 ；5, 462，854 ；5, 469，854 ；5, 512，295 ；5, 527，528 ；5, 534，259 ；5, 543，152 ；5，556,948 ；5, 580，575 ;和5，595，756，其各自引入本文作為參考。盡管反義寡核苷酸無(wú)需在載體的背景中施用，以便調(diào)節(jié)靶表達(dá)和/或功能，但本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于表達(dá)反義寡核苷酸的表達(dá)載體構(gòu)建體，包括啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子基因序列，且具有強(qiáng)組成型啟動(dòng)子活性，或可以在所需情況下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)踐涉及用合適的核酸遞送系統(tǒng)施用前述反義寡核苷酸中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括與多核苷酸可操作地連接的非病毒載體。此類非病毒載體的例子包括單獨(dú)(例如，SEQ ID NO:23 - 263中的任何一個(gè)或多個(gè))或與合適蛋白質(zhì)、多糖或脂質(zhì)制劑組合的寡核苷酸。另外合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，一般是來(lái)自下述中的至少一種的序列:腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、輔助病毒依賴型腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或日本脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合物的血凝病毒。優(yōu)選地，病毒載體包括與多核苷酸可操作地連接的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。另外優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠類白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包括至少2種載體，其中g(shù)ag和pol基因來(lái)自HIV基因組，并且基因來(lái)自另一種病毒。DNA病毒載體是優(yōu)選的。這些載體包括痘病 毒載體例如正痘病毒或雞痘病毒載體、皰疫病毒載體例如單純皰疫 I 病毒(HSV)載體[Geller, A.1.等人，(1995)7； Neurochem, 64:487 ；Lim, F.,等人，DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995) ；Geller, A.1.等人，(1993)/￥oc Natl.Acad.Sc1.:U.S.A.:90 7603 ；Geller,A.1.，等人，(1990)/￥oc 艙Acad.Sci USA:87:1149]、腺病毒載體(LeGal LaSalle等人，5bi<9/ c<9, 259:988 (1993) ；Davidson,等人，(1993)7fe1.Genet.3: 219 ；Yang,等人，(1995)7； Virol.69: 2004)和腺相關(guān)病毒載體(KaplUt，M.G.，等人，(1994)艙1.Genet.8:148)。本發(fā)明的反義化合物包含任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或此類酯的鹽、或任何其他化合物，其在施用于動(dòng)物包括人后，能夠提供(直接或間接地)生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物或其殘余。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明化合物的生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽:即保留母體化合物的所需生物活性且不對(duì)其賦予不希望有的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽。對(duì)于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的鹽的優(yōu)選例子及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以許多方式施用，這依賴于是需要局部還是全身性治療和依賴于待治療的區(qū)域。施用可以是局部的(包括眼和至粘膜包括陰道和直腸遞送)、肺的例如通過(guò)粉劑或氣溶膠的吸入或吹入，包括通過(guò)噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和經(jīng)皮)、經(jīng)口或腸胃外的。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。為了處理中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織，給藥可以通過(guò)例如注射或輸注到腦脊液中進(jìn)行。反義RNA在腦脊液中的給藥在例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0117772、“用于減慢家族性ALS疾病進(jìn)展的方法”中描述，其整體并入本文作為參考。當(dāng)意圖本發(fā)明的反義寡核苷酸給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞時(shí)，給藥可以應(yīng)用能夠促進(jìn)主題反義寡核苷酸滲透通過(guò)血腦屏障的一種或多種試劑進(jìn)行。注射可以例如在海馬內(nèi)嗅皮層中進(jìn)行。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過(guò)施用腺病毒載體到肌肉組織中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的遞送描述于例如美國(guó)專利號(hào)6，632，427、“腺病毒載體介導(dǎo)的向延髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的基因轉(zhuǎn)移”，其并入本文作為參考。載體向腦例如紋狀體、丘腦、海馬或黑質(zhì)中的直接遞送是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如美國(guó)專利號(hào)6，756，523、“用于運(yùn)輸外源基因到中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是腦的細(xì)胞中的腺病毒載體”中，其并入本文作為參考。施用可以是快速的，如通過(guò)注射，或在一段時(shí)期內(nèi)進(jìn)行，如通過(guò)緩慢輸注或施用緩慢釋放制劑。主題反義寡核苷酸可以與提供期望藥學(xué)或藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的試劑連接或偶聯(lián)。例如，反義寡核苷酸可以與本領(lǐng)域已知促進(jìn)跨血腦屏障滲透或轉(zhuǎn)運(yùn)的任何物質(zhì)偶聯(lián)，諸如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體，并且通過(guò)靜脈內(nèi)注射施用。反義化合物可以與病毒載體連接，例如，其使得反義化合物更有效和/或增加反義化合物跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。滲透血腦屏障破壞也可以這樣實(shí)現(xiàn)，通過(guò)例如輸注糖，包括但不限于內(nèi)消旋赤蘚醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D⑴木糖、半乳糖醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D⑴阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纖維二糖、D (+)麥芽糖、D⑴棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D㈠核糖、核糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來(lái)蘇糖、L(+)來(lái)蘇糖和L(-)來(lái)蘇糖，或氨基酸，包括但不限于谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和?；撬?。用于增加血腦屏障滲透的方法和材料描述于例如美國(guó)專利號(hào)4，866，042“用于輸送遺傳材料跨血腦屏障的方法”、6，294，520“用于通過(guò)血腦屏障的材料”和6，936，589 “胃腸外輸送系統(tǒng)”中，它們都整體并入本文作為參考。主題反義化合 物可與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物例如脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服、直腸、局部或其他制劑混合、包封、偶聯(lián)或另外連接，用于促進(jìn)攝取、分配和/或吸收。例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)可以包含在制劑中以促進(jìn)寡核苷酸攝取。顯示促進(jìn)攝取的一種這樣的組合物是 LIP0FECTIN (可得自 GIBCO-BRL, Bethesda, MD)。具有至少一個(gè)2’ -O-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸被認(rèn)為對(duì)于經(jīng)口施用特別有用。用于局部施用的藥物組合物和制劑可以包括經(jīng)皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體，水、粉末或油基，增稠劑等可以是需要或希望的。包被避孕套、手套等也可以是有用的?？梢苑奖愕匾詥挝粍┬统尸F(xiàn)的本發(fā)明的藥物制劑可以根據(jù)藥物工業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。此類技術(shù)包括使活性成分與一種或多種藥學(xué)載體或賦形劑達(dá)到結(jié)合的步驟。一般而言，制劑通過(guò)下述進(jìn)行制備:使活性成分與液體載體或精細(xì)分開的固體載體或兩者均勻地且緊密地達(dá)到結(jié)合，并且隨后在需要時(shí)使產(chǎn)物成形。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能劑型中的任何，例如但不限于片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿劑、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可以在水、非水或混合介質(zhì)中配制為栓劑。水懸浮液可以進(jìn)一步包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳狀液、泡沫和含脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可以包括一種或多種穿透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。乳狀液一般是一種液體以直徑通常超過(guò)0.1 μ m的小滴形式在另一種中分散的非均質(zhì)系統(tǒng)。乳狀液除分散相可以包含另外組分，以及可以作為在水相、油相中的溶液或其自身作為分離相存在的活性藥。微乳液包括作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。乳狀液及其用途是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。如在本發(fā)明中使用的，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”意指由在一個(gè)或多個(gè)球狀雙層中排列的兩親脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體是單層或多層囊泡，其具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水性內(nèi)部。陽(yáng)離子脂質(zhì)體是帶正電的脂質(zhì)體，其被認(rèn)為與帶負(fù)電的DNA分子相互作用，以形成穩(wěn)定復(fù)合物。其為pH敏感或帶負(fù)電的脂質(zhì)體被認(rèn)為誘陷DNA而不是與之復(fù)合。陽(yáng)離子和非陽(yáng)離子脂質(zhì)體已用于將DNA遞送至細(xì)胞。脂質(zhì)體還包括“立體穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，如本文使用的，它是指包括一種或多種專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體的術(shù)語(yǔ)。當(dāng)摻入脂質(zhì)體內(nèi)時(shí)，這些專門脂質(zhì)導(dǎo)致相對(duì)于缺乏此類專門脂質(zhì)的脂質(zhì)體，具有增強(qiáng)的循環(huán)壽命的脂質(zhì)體。立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體的例子是其中脂質(zhì)體的囊泡形成脂質(zhì)部分的部分包括一種或多種糖脂，或由一種或多種親水聚合物例如聚乙二醇(PEG)部分衍生的那些。脂質(zhì)體及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述。本發(fā)明的藥物制劑和組合物還可以包括表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳狀液中的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。表面活性劑及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明采用各種穿透促進(jìn)劑，以實(shí)現(xiàn)核酸特別是寡核苷酸的有效遞送。除幫助非親脂藥物擴(kuò)散越過(guò)細(xì)胞膜外，穿透促進(jìn)劑還增強(qiáng)親脂藥物的滲透性。穿透促進(jìn)劑可以分類為屬于5個(gè)廣泛范疇之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、和非螯合非表面活性劑。穿透促進(jìn)劑及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到照常規(guī)根據(jù)其預(yù)期用途即施用途徑來(lái)設(shè)計(jì)制劑。用于局部施用的優(yōu)選制劑包括其中本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送試劑混合的那些，所述局部遞送試劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑。優(yōu)選脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性(例如二油酰-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性(例如二肉豆蘧酰磷脂酰甘油DMPG)和陽(yáng)離子的(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。對(duì)于局部或其他施用，本發(fā)明的寡核苷酸可以封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或可以與其特別是與陽(yáng)離子脂質(zhì)體形成復(fù)合物?？商娲?，寡核苷酸可以與脂質(zhì)特別是與陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合。優(yōu)選脂肪酸和酯、其藥學(xué)上可接受的鹽及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述。用于經(jīng)口施用的組合物和制劑包括粉劑或顆粒劑、微粒、納米顆粒、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或小片。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或結(jié)合劑可能是希望的。優(yōu)選經(jīng)口制劑是其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種穿透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑結(jié)合施用的那些。優(yōu)選表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。優(yōu)選膽汁酸/鹽和脂肪酸及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。還優(yōu)選的是穿透促進(jìn)劑的組合，例如與膽汁酸/鹽組合的脂肪酸/鹽。特別優(yōu)選的組合是月桂酸的鈉鹽、癸酸和UDCA。進(jìn)一步的穿透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以以顆粒形式包括噴霧干燥顆粒經(jīng)口遞送，或復(fù)合以形成微?；蚣{米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑及其用途在美國(guó)專利號(hào)6，287，860中進(jìn)一步描述，其引入本文作為參考。用于腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用的組合物和制劑可以包括無(wú)菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適添加劑，例如但不限于穿透促進(jìn)劑、載體化合物和其他藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的特定實(shí)施方案提供包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種其他化學(xué)治療劑的藥物組合物，所述其他化學(xué)治療劑通過(guò)非反義機(jī)制起作用。此類化學(xué)治療劑的例子包括但不限于癌癥化學(xué)治療藥，例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、依達(dá)比星、依索比星、博來(lái)霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞甙、雙-氯乙基-亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光輝霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、它莫西芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、噴司他丁、4-羥基過(guò)氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、依立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，此類化學(xué)治療劑可以個(gè)別(例如5-FU和寡核苷酸)、順次(例如5-FU和寡核苷酸一段時(shí)間，隨后為MTX和寡核苷酸)、或與一種或多種其他此類化學(xué)治療劑組合(例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射療法和寡核苷酸)使用?？寡姿幇ǖ幌抻诜橇趔w抗炎藥和皮質(zhì)類固醇，和抗病毒藥包括但不限于利巴韋林、阿糖腺 苷、阿昔洛韋和更昔洛韋，也可以在本發(fā)明的組合物中組合。反義化合物和其他非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。2種或更多種組合化合物可以一起或順次使用。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含靶向第一種核酸的一種或多種反義化合物特別是寡核苷酸，和靶向第二種核酸靶的一種或多種另外反義化合物。例如，第一種靶可以是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的特定反義序列，并且第二種靶可以是來(lái)自另一種核酸序列的區(qū)域?？商娲?，本發(fā)明的組合物可以包含靶向相同脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因核酸靶的不同區(qū)域的2種或更多種反義化合物。反義化合物的眾多例子在本文中舉例說(shuō)明，并且其他可以選自本領(lǐng)域已知的合適化合物。2種或更多種組合化合物可以一起或順次使用。給藥:
治療組合物的配制及其后續(xù)施用(給藥)被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)。給藥依賴于待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重度和應(yīng)答性，應(yīng)用持續(xù)數(shù)天到數(shù)月的治療過(guò)程，或直至實(shí)現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的縮減。最佳給藥方案可以由患者體內(nèi)的藥物蓄積測(cè)量進(jìn)行計(jì)算。普通技術(shù)人員可以容易地決定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)速率。最佳劑量可以依賴于個(gè)別寡核苷酸的相對(duì)功效而變，并且一般可以基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的EC5(ls進(jìn)行估計(jì)。一般而言，劑量是0.01 Ug- 100 g/kg體重,并且可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次,或甚至每2 - 20年給予一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地估計(jì)關(guān)于給藥的重復(fù)速率，這基于在體液或組織中測(cè)量的藥物停留時(shí)間和濃度。在成功治療后，可以希望使患者經(jīng)歷維持療法以預(yù)防疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中寡核苷酸以維持劑量施用，范圍為0.0l μ g - 100 g/kg體重，每天一次或多次,到每20年一次。在各實(shí)施方案中，患者用下列藥物劑量治療:至少約1、至少約2、至少約3、至少約
4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90或至少約100 mg/kg體重。反義寡核苷酸的某些注射劑量描述于例如美國(guó)專利號(hào)7，563，884、“PTP1B表達(dá)的反義調(diào)節(jié)”中，其整體并入本文作為參考。盡管已在上文描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解它們僅作為例子而不是限制呈現(xiàn)。依照本文公開內(nèi)容可以進(jìn)行對(duì)于公開實(shí)施方案的眾多改變，而不背離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)受上述實(shí)施方案中的任何限制。本文提及的所有文件引入本文作為參考。本申請(qǐng)中引用的所有出版物和專利文件為了所有目的引入作為參考，其程度與每個(gè)個(gè)別出版物或?qū)＠募绱藗€(gè)別指出相同。通過(guò)其在本文件的各種參考文獻(xiàn)中的引用，申請(qǐng)人不承認(rèn)任何具體參考文獻(xiàn)是其發(fā)明的“現(xiàn)有技術(shù)”。本發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案在下述實(shí)施例中舉例說(shuō)明。
實(shí)施例下述非限制性實(shí)施例用來(lái)舉例說(shuō)明本發(fā)明的選擇實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解在所示組分元件中的比例和可替代物中的變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且在本發(fā)明的實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)施例1:反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)，其對(duì)于與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因反義的核酸分子和/或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的有義鏈具有特異性
如上所述，術(shù)語(yǔ)“對(duì)于……特異的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶”指具有下述序列的寡核苷酸:(i )能夠與靶基因的部分形成 穩(wěn)定復(fù)合物，或(ii )能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的部分形成穩(wěn)定雙鏈體。合適寡核苷酸的選擇通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序得到促進(jìn)，所述計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列且指出同一性或同源性區(qū)域。此類程序用于比較獲得的核酸序列，例如通過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)例如GenBank或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物。來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較允許選擇展示物種之間的合適同一性程度的核酸序列。在未測(cè)序的基因的情況下，執(zhí)行DNA印跡以允許測(cè)定靶物種和其他物種中在基因之間的同一性程度。通過(guò)在各種嚴(yán)格程度下執(zhí)行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可以獲得同一性的近似測(cè)量。這些操作允許選擇這樣的寡核苷酸，其顯示出與待控制受試者中的靶核酸序列的高度互補(bǔ)性和與其他物種中的相應(yīng)核酸序列的較低程度互補(bǔ)性。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在選擇用于在本發(fā)明中使用的基因的合適區(qū)域中存在相當(dāng)大的活動(dòng)余地。反義化合物是“可特異性雜交的”，此時(shí)化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以引起功能和/或活性調(diào)節(jié)，并且存在足夠程度的互補(bǔ)性，以避免在其中需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況下在生理?xiàng)l件下，和其中在體外測(cè)定情況下執(zhí)行測(cè)定的條件下。本文描述的寡核苷酸的雜交性質(zhì)可以通過(guò)如本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測(cè)定進(jìn)行測(cè)定。例如，使用解鏈曲線測(cè)定，通過(guò)測(cè)定靶天然反義和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度可以獲得本文描述的寡核苷酸的性質(zhì)。使用測(cè)量分子間相互作用強(qiáng)度的任何確定方法例如解鏈曲線測(cè)定，可以估計(jì)靶天然反義和潛在藥物分子(分子)之間的結(jié)合強(qiáng)度。解鏈曲線測(cè)定確定在其下對(duì)于天然反義/分子復(fù)合物發(fā)生從雙鏈到單鏈構(gòu)象的快速轉(zhuǎn)變的溫度。這個(gè)溫度被廣泛公認(rèn)為2種分子之間的相互作用強(qiáng)度的可靠測(cè)量。使用實(shí)際天然反義RNA分子的cDNA拷貝或與分子的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的合成DNA或RNA核苷酸，可以執(zhí)行解鏈曲線測(cè)定。包含執(zhí)行這種測(cè)定的所有必需試劑的多種試劑盒是可獲得的(例如Applied Biosystems Inc.MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包括包含雙鏈DNA (dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等)之一的合適緩沖溶液。dsDNA染料的性質(zhì)是這樣的，使得它們以游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但在與dsDNA結(jié)合時(shí)是高度熒光的。為了執(zhí)行測(cè)定，使cDNA或相應(yīng)寡核苷酸與分子以由具體制造商的方案限定的濃度混合。使混合物加熱至95°C，以解離所有預(yù)形成的dsDNA復(fù)合物，隨后緩慢冷卻至室溫或由試劑盒制造商限定的其他較低溫度，以允許DNA分子退火。新近形成的復(fù)合物隨后緩慢加熱至95°C，伴隨關(guān)于由反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量的同時(shí)連續(xù)數(shù)據(jù)收集。熒光強(qiáng)度與反應(yīng)中存在的dsDNA量成反比。數(shù)據(jù)可以使用與試劑盒相容的實(shí)時(shí)PCR儀器(例如ABI’ s StepOnePlus Real Time PCR System 或 LightTyper 儀器，Roche Diagnostics, Lewes, UK)進(jìn)行收集。

使用合適軟件(例如LightTyper (Roche)或 SDS Dissociation Curve, ABI),通過(guò)針對(duì)溫度(X軸)標(biāo)繪就溫度而言的熒光負(fù)衍生物(在I軸上的-d (熒光)/dT)構(gòu)建解鏈峰。分析數(shù)據(jù)以鑒定從dsDNA復(fù)合物到單鏈分子的快速轉(zhuǎn)變的溫度。這個(gè)溫度被稱為Tm，并且與2種分子之間的相互作用強(qiáng)度成正比。一般地，Tm將超過(guò)40°C。實(shí)施例2:脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的調(diào)節(jié) 用反義寡核苷酸處理518A2細(xì)胞:
使獲自 Albert Einstein-Montefiore Cancer Center, NY 的 518A2 細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone 目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV)+10 % FBS(Mediatech 目錄號(hào) MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在37°C和5% 0)2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco 目錄號(hào) 31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào)11668019)在室溫孵育20分鐘，并且應(yīng)用于具有518Α2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí)，去除培養(yǎng)基，并且使用來(lái)自 Promega 的 SV Total RNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181),根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)或 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (目錄號(hào) 4368813)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，其使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào)4369510)和由ABI設(shè)計(jì)的弓I物 / 探針(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay, Applied BiosystemsInc., Foster City CA)。使用下述PCR循環(huán):使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)的 50。。2 分鐘，95°C 10 分鐘，40 個(gè)循環(huán)(95°C 15 秒，60°C I 分鐘)。基于處理和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。結(jié)果
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ABCAl反義AK311445設(shè)計(jì)的siRNAs中的一個(gè)處理后48h，518A2細(xì)胞中ABCAl mRNA的水平顯著增加(圖1A)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ABCAl反義AK311445設(shè)計(jì)的寡聚物中的6個(gè)處理后48 h，518A2細(xì)胞中ABCAl mRNA的水平顯著增加(圖1B)。用反義寡核苷酸處理3T3細(xì)胞:
使來(lái)自ATCC (目錄號(hào)CRL-1658)的3T3細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在 37°C和 5% CO2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫孵育 20分鐘，并且應(yīng)用于具有3Τ3細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的SV TotalRNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自 Thermo Scientific 的 Verso cDNA 試劑盒(目錄號(hào) AB1453B)或 High Capacity cDNAReverse Transcription Kit (目錄號(hào)4368813)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，其使用ABI TaqmanGene Expression Mix(目錄號(hào) 4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物 / 探針(Applied BiosystemsTaqman Gene Expression Assay, Applied Biosystems Inc., Foster City CA)。使用下述PCR循環(huán):使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)的 5CTC2分鐘，95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C I分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。結(jié)果
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)小鼠ABCAl反義BF133827設(shè)計(jì)的寡聚物中的3個(gè)處理后48 h，3T3細(xì)胞中ABCAl mRNA的水平顯著增加(圖1C)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LRPl反義DC401271和AW544265的寡聚物處理后48 h，3T3細(xì)胞中LRPl mRNA的水平顯著增加(圖1J)。

用反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞方法1:用裸反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞:
使來(lái)自ATCC的！fepG2細(xì)胞(目錄號(hào)HB-8065)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)MT35-011-CV)+ 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在 37°C和 5% CO2 下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以0.5 X 104/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5%CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為1.5 ml/孔新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸在水中稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合，并且應(yīng)用于具有ifepG2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬處理對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后72小時(shí)，如上文中所述使細(xì)胞再次給藥。在第二次給藥后48-72小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào)Z3105)或來(lái)自Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181),根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自Thermo Scientif ic的VersocDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá),其使用ABI Taqman Gene ExpressionMix(目錄號(hào) 4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物/探針(Applied Biosystems Inc.,Foster CityCA)。使用下述PCR循環(huán):使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C I分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。方法2:用反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞:
使來(lái)自ATCC的！fepG2細(xì)胞(目錄號(hào)HB-8065)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在 37°C和 5% CO2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使 2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào) 31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫孵育20分鐘，并且應(yīng)用于具有H印G2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的 SV Total RNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNAIsolation試劑盒(目錄號(hào)74181)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，其使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào)4369510)和由ABI設(shè)計(jì)的引物/探針(Applied Biosystems Inc., Foster City CA)。使用下述 PCR 循環(huán):使用 Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C I分鐘)。基于處理和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。
結(jié)果
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的兩個(gè)處理后48h，H印G2細(xì)胞中LCAT mRNA的水平顯著增加(圖1E)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的一個(gè)處理后48 h, H印G2細(xì)胞中LCAT mRNA的水平顯著增加(圖1F)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LRPl反義DC401271的寡聚物處理后48 h，!fepG2細(xì)胞中LRPl mRNA的水平顯著增加(圖1H)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LDLR反義sherf lor.aApr07的反義寡聚物處理后48h,HepG2細(xì)胞中LDLr mRNA的水平顯著增加。針對(duì)LDLr反義bloflor.aApr07設(shè)計(jì)的寡聚物(CUR-1059-CUR-1063)不提高 LDLr 水平(圖1K 和 1L)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)APOE反義Hs.626623設(shè)計(jì)的反義寡聚物中的三個(gè)處理后48 h, HepG2細(xì)胞中APOE mRNA的水平顯著增加。針對(duì)AP0E4反義Hs.714236設(shè)計(jì)的寡聚物不顯著提高APOE mRNA (圖M)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)ApoAl反義DA327409ext的反義寡聚物中的一些處理后48 h，HepG2細(xì)胞中ApoAl mRNA的水平顯著增加(圖1N至圖1P)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照比較，在用裸LNA或硫代磷酸酯寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞后7天期間，在ApoAl mRNA (上圖)和ApoAl天然反義DA327409ext RNA (下圖)中的倍數(shù)變化(圖Q)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用LNA寡核苷酸處理!fepG2細(xì)胞后，在ApoAl mRNA (橙色條)和ApoAl天然反義DA327409ext RNA (藍(lán)色條)中的倍數(shù)變化(圖R)。

用反義寡核苷酸處理Hek293細(xì)胞:
使來(lái)自ATCC的Hek293細(xì)胞(目錄號(hào)CRL-1573)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在 37°C和 5% CO2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫孵育 20分鐘，并且應(yīng)用于具有Hek293細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的SV TotalRNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自 Thermo Scientific 的 Verso cDNA 試劑盒(目錄號(hào) AB1453B)或 High Capacity cDNAReverse Transcription Kit (目錄號(hào)4368813)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，其使用ABI TaqmanGene Expression Mix(目錄號(hào) 4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物 / 探針(Applied BiosystemsTaqman Gene Expression Assay,Applied Biosystems Inc., Foster City CA)。使用下述PCR 循環(huán):使用 Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)或 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)的 50。。2 分鐘，95°C 10 分鐘，40 個(gè)循環(huán)(95°C 15 秒，60。。I 分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。結(jié)果:
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的三個(gè)處理后48h, Hek293細(xì)胞中LCAT mRNA的水平顯著增加(圖1D)。用反義寡核苷酸處理Vero76細(xì)胞
使來(lái)自ATCC的Vero 76細(xì)胞(目錄號(hào)CRL-1587)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在 37°C和 5% CO2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫孵育 20分鐘，并且應(yīng)用于具有Vero 76細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的SV TotalRNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自 Thermo Scientific 的 Verso cDNA 試劑盒(目錄號(hào) AB1453B)或 High Capacity cDNAReverse Transcription Kit (目錄號(hào)4368813)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，其使用ABI TaqmanGene Expression Mix(目錄號(hào) 4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物 / 探針(Applied BiosystemsTaqman Gene Expres sion Assay,Applied Biosystems Inc., Foster City CA)。使用下述PCR 循環(huán):使用 Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)或 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)的 50。。2 分鐘，95°C 10 分鐘，40 個(gè)循環(huán)(95°C 15 秒，60。。I 分鐘)。基于處理和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。結(jié)果
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LCAT反義Hs.668679設(shè)計(jì)的寡聚物中的一個(gè)處理后48h，Vero細(xì)胞中LCAT mRNA的水平顯著增加(圖1G)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對(duì)LRPl反義DC401271和Hs.711951的寡聚物處理后48 h, Vero細(xì)胞中LRPl mRNA的水平顯著增加(圖1I)。用于Applied Biosystems Gene Expression Assays 的檢測(cè)探針:
ABCAl: Hs00194045_ml (人)，Mm01350760_ml (小鼠)
LCAT: Hs00173415_ml
LRPl: Hs00233856_ml (人)，Mm00464608_ml (小鼠)
LDLR: Hs00181192_mlApoE: Hs00171168_mlApoAl: Hs00163641_ml, 18S 目錄號(hào) 4319413E 對(duì)ApoAl反義DA327409ext定制設(shè)計(jì)的分析:
FAM，標(biāo)記的:TTTGGATCTGGACGACTTC (SEQ ID NO: 275)。實(shí)施例3:脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 材料和方法
用下列方法中的任一處理細(xì)胞:
方法1:用裸反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞:
使!fepG2細(xì)胞在MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào)SH30024) +10% FBS +青霉素/鏈霉素中在37°C和5% 0)2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 104/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并置于37°C和5% CO2下。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮MEM/EBSS+10% FBS0由IDT制造的所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070)混合，并且應(yīng)用于具有H印G2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在加入反義寡核苷酸后72小時(shí)，去除培養(yǎng)基，并且如上述重復(fù)給藥程序。重復(fù)給藥RNA 后 48-72 h,使用來(lái)自 Promega 的 SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號(hào) 74181),根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，其使用ABI Taqman GeneExpression Mix(目錄號(hào) 4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物 / 探針(Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)。使用下述PCR循環(huán):使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C I分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。用于ApoAl天然反義DA327409ext的用戶定制設(shè)計(jì)Taqman測(cè)定的引物和探針。大寫字母指示未修飾的脫氧核糖核苷酸:
探針序列(FAM，標(biāo)記的)TTTGGATCTGGACGACTTC (SEQ ID NO: 275)
正向引物序列 CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (SEQ ID NO: 276)
反向引物序列 CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (SEQ ID NO: 277) 方法2:用反義寡核苷酸處理H印G2細(xì)胞:
使來(lái)自ATCC的！fepG2細(xì)胞(目錄號(hào)HB-8065)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/EBSS (Hyclone目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV) +10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CI))中在 37°C和 5% CO2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，使細(xì)胞以1.5 X 105/ml的密度再鋪到6孔板內(nèi)，并且在37°C和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基替換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào) 31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育20分鐘,并且應(yīng)用于具有H印G2細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。 在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的 SV Total RNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNAIsolation試劑盒(目錄號(hào)74181),根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào)4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物 / 探針(Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)。使用下述 PCR循環(huán):使用]\^4000熱循環(huán)儀(3丨以丨3861^)的501:2分鐘，951: 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C I分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。用于ApoAl天然反義DA327409ext的用戶定制設(shè)計(jì)Taqman測(cè)定的引物和探針。大寫字母指示未修飾的脫氧核糖核苷酸:
探針序列(FAM，標(biāo)記的)TTTGGATCTGGACGACTTC (SEQ ID NO: 275)
正向引物序列 CTCCTCCTGCCACTTCTTCTG (SEQ ID NO: 276)
反向引物序列 CTGGTGGATGAAGAAGGTTTGC (SEQ ID NO: 277) 原代猴肝細(xì)胞的處理
通過(guò)RxGen Inc.將原代猴肝細(xì)胞引入培養(yǎng)，并且在6孔板中鋪平板。它們?nèi)缦掠霉押塑账徇M(jìn)行處理。將6孔板中的培養(yǎng)基替換為由William’s Medium ECSigma目錄號(hào)W4128)組成的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基 ，其補(bǔ)充有5% FBS、50 U/ml青霉素和50 ug/ml鏈霉素、4 ug/ml胰島素、I uM 地塞米松、10 ug/ml 菌纖維素(Fungin) (InVivogen, San Diego CA)。所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。使2 μ I這種溶液與400 μ I Opt1-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào) 31985-070)和 4 μ I Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019)在室溫下孵育20分鐘，并且應(yīng)用于具有細(xì)胞的6孔板的每個(gè)孔。包括2 μ I水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸后48小時(shí),去除培養(yǎng)基,并且使用來(lái)自Promega的 SV Total RNA Isolation System (目錄號(hào) Z3105)或來(lái)自 Qiagen 的 RNeasy Total RNAIsolation試劑盒(目錄號(hào)74181),根據(jù)制造商的說(shuō)明書從細(xì)胞中提取RNA。將600 ng RNA加入使用來(lái)自Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB1453B)執(zhí)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，如制造商的方案中所述。來(lái)自這種逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用于通過(guò)實(shí)時(shí)PCR監(jiān)控基因表達(dá)，使用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào)4369510)和由 ABI 設(shè)計(jì)的引物 / 探針(Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)。使用下述 PCR循環(huán):使用Mx4000熱循環(huán)儀(Stratagene)的50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C I分鐘)?；谔幚砗湍M轉(zhuǎn)染樣品之間在18S標(biāo)準(zhǔn)化dCt值中的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸處理后在基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用MabTech Inc.ApoAl ELISA試劑盒目錄號(hào)3710_11_6執(zhí)行漢/5 。結(jié)果顯示于圖1Q至圖1T中。圖Q顯示如通過(guò)檢測(cè)到的ApoAl mRNA (上圖)和ApoAl反義DA327409ext RNA(下圖)量測(cè)量的，具有硫代磷酸酯主鏈即核苷酸間鍵合的2種寡核苷酸和LNA寡核苷酸在調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)中是有效的。圖R顯示在用針對(duì)DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理的H印G2細(xì)胞中的ApoAl mRNA (橙色條)和ApoAl反義DA327409extRNA (藍(lán)色條)水平。圖S顯示在用針對(duì)DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理的HepG2培養(yǎng)物中ApoAl mRNA(下圖)和蛋白質(zhì)(上圖)的劑量依賴性上調(diào)。圖T顯示在用針對(duì)DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理后，在原代非洲綠猴肝細(xì)胞中ApoAl mRNA的上調(diào)。實(shí)施例4:在非洲綠猴中CUR-962的功效和作用持續(xù)時(shí)間研究
這個(gè)研究的目的是評(píng)估且比較不協(xié)調(diào)非編碼反義序列的反義擊倒效應(yīng)，所述不協(xié)調(diào)非編碼反義序列在非人靈長(zhǎng)類模型中在靜脈內(nèi)施用后調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因。設(shè)計(jì)為抑制APOAl調(diào)節(jié)序列的反義寡核苷酸測(cè)試物品命名為CUR-962。CUR-962:+G料OT* A*G*T* C*T*G* +T*+T*+G (SEQ ID NO:278)。CUR-963 (對(duì)照):+G*+T*C* T*G*A* T*G*G* +A*+G*+A (SEQ ID NO:279)。調(diào)節(jié)測(cè)試指導(dǎo)
這個(gè)研究依照公認(rèn)的毒理學(xué)原理且遵照International Conference ofHarmonization(ICH)Harmonized Tripartite GuidelinesCNon-Clinical Safety Studiesfor the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals ICH M3 (m),2000November 9)和一般公認(rèn)用于治療劑測(cè) 試的操作進(jìn)行設(shè)計(jì)。測(cè)試和對(duì)照物品 測(cè)試物品鑒定和制備
測(cè)試物品CUR-962是化學(xué)上穩(wěn)定的反義寡核苷酸。用于靜脈內(nèi)遞送的載體是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。載體表征
對(duì)于PBS載體，組成、批號(hào)、有效期限和貯存條件(溫度和光/暗)得自供應(yīng)商。測(cè)試物品貯存和處理
測(cè)試物質(zhì)和載體根據(jù)相應(yīng)地由發(fā)起人和制造商提供的公認(rèn)貯存條件進(jìn)行貯存。測(cè)試物品制劑的分析
測(cè)試物品制劑的樣品將冷凍保存用于分析測(cè)試物質(zhì)制劑的濃度、穩(wěn)定性和同質(zhì)性。測(cè)試系統(tǒng)原理
靈長(zhǎng)類是對(duì)于管理當(dāng)局可接受作為潛在危害指示劑的合適非嚙齒類物種，并且關(guān)于其的廣泛背景信息是可獲得的。非洲綠猴特別是多種人生理學(xué)和疾病狀態(tài)的高度臨床相關(guān)模型。靜脈內(nèi)施用途徑與可能的人治療途徑對(duì)應(yīng)。測(cè)試物品的劑量基于先前在非洲綠猴中執(zhí)行的類似化合物的劑量發(fā)現(xiàn)研究的結(jié)果。選擇非洲綠猴作為選擇的靈長(zhǎng)類，因?yàn)闇y(cè)試物品的靶序列跨越物種是保守的，在靈長(zhǎng)類中具有100%同源性。另外，測(cè)試物質(zhì)是合成寡核苷酸。因此，在靈長(zhǎng)類中給藥允許這些化合物功效的優(yōu)良評(píng)估，所述化合物將比在任何其他物種中更反映在人中可能可見的攝取。動(dòng)物
物種:青猴(Chlorocebus sabaeus),非人靈長(zhǎng)類。品種:認(rèn).Kitts本土非洲綠猴。來(lái)源'.-RxGen,Lower Bourryeau, St.Kitts, West Indies。
期望年齡..測(cè)試動(dòng)物是成年的。y—..猴重量約3-4 kg。實(shí)際范圍可以改變但將記錄在數(shù)據(jù)中。/主琢..測(cè)試動(dòng)物是成年雌性。動(dòng)物數(shù)目..篩選10只動(dòng)物以確保適合于加入研究中的8只動(dòng)物的鑒定。級(jí)究費(fèi)#..雌性:8。關(guān)于研究數(shù)目的論證
這個(gè)研究設(shè)計(jì)為使用最少可能數(shù)目的動(dòng)物，與評(píng)估測(cè)試物品在非洲綠猴中的治療功效的主要目標(biāo)和這類寡核苷酸在這個(gè)物種中的全身性施用的先前研究一致。動(dòng)物規(guī)格
在研究中采用重量范圍3 - 4 kg的10只成年非洲綠猴。猴是從居住于島的野生群體中人道捕獲的首次用于藥物的成年動(dòng)物。被捕獲猴用驅(qū)腸蟲劑(antihelminthics)處理，以消除任何可能的腸寄生蟲負(fù)荷 ，并且在就研究加入篩選前隔離觀察最低限度4周。被捕獲猴的年齡通過(guò)大小和齒形結(jié)構(gòu)進(jìn)行估計(jì)，從研究中排除年長(zhǎng)動(dòng)物。在研究加入前，對(duì)每只猴執(zhí)行臨床檢查，包括移動(dòng)和靈巧評(píng)估。獲得血樣且送往Antech DiagnosticsCMemphis,TN),用于綜合臨床化學(xué)和全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和脂肪譜(參見關(guān)于規(guī)格的節(jié)段9.2和319567928)。如通過(guò)與在St.Kitts集落中對(duì)于猴確定的正常范圍比較測(cè)定的，從研究中排除具有異常實(shí)驗(yàn)室值的猴。為了鑒定滿足這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的8只猴，篩選10只猴，根據(jù)需要篩選另外動(dòng)物。在研究開始前，將選擇的猴轉(zhuǎn)移至個(gè)別籠，以適應(yīng)個(gè)別飼養(yǎng)一周時(shí)期。僅認(rèn)為適合于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物將加入研究。在研究開始時(shí)的實(shí)際(或估計(jì))年齡和重量范圍將在原始數(shù)據(jù)和最后報(bào)告中詳述。動(dòng)物健康與福利
遵循最高標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物福利且堅(jiān)持由St.Kitts農(nóng)業(yè)部(Department of Agriculture)和美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部(U.S.Department of Health and Human Services)規(guī)定的指導(dǎo)。所有研究將依照這些要求以及用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和飼養(yǎng)的所有可應(yīng)用實(shí)踐規(guī)范進(jìn)行。關(guān)于獸醫(yī)學(xué)管理、操作和審查的所有可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)如NIH動(dòng)物管理和使用指導(dǎo)(Guide forthe Care and Use of Animals)中包含的。St.Kitts設(shè)施保持如由指導(dǎo)要求的審查方案且檢查設(shè)施的動(dòng)物研究委員會(huì)?；饡?huì)具有由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利局(Office of LaboratoryAnimal Welfare)提交的批準(zhǔn)保證，如由指導(dǎo)#A4384_01 (Axion研究基金會(huì)(ResearchFoundation) /St.Kitts 生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)(Biomedical Foundation))要求的。不存在由這個(gè)研究中指定的研究提出的專門非人靈長(zhǎng)類獸醫(yī)學(xué)管理內(nèi)容和生物危害內(nèi)容。飼養(yǎng)和環(huán)境
為了允許檢測(cè)任何處理相關(guān)臨床體征，在手術(shù)前和手術(shù)后動(dòng)物個(gè)別飼養(yǎng)直至處死時(shí)。個(gè)別籠位于其中的靈長(zhǎng)類建筑物完全由環(huán)境光照明，如U.S.D.H.H.S指導(dǎo)中推薦的，這在北緯17度約12小時(shí):12小時(shí)光-暗周期。RxGen靈長(zhǎng)類建筑物完全通風(fēng)至室外。另外的空氣流動(dòng)通過(guò)吊扇確保，以維持23-35°C的恒定靶溫度，如St.Kitts全年一般的。每天測(cè)量24小時(shí)溫度極端和相對(duì)濕度(這也將不受控制)。在研究過(guò)程中，籠定期進(jìn)行清潔。飲食和水
每只動(dòng)物提供約90克/天的標(biāo)準(zhǔn)猴食物飲食(TekLad，Madison, WI )。記錄飲食的具體營(yíng)養(yǎng)組成。水定期分析微生物純度。關(guān)于儲(chǔ)備飲食和水供應(yīng)中可接受水平的污染物標(biāo)準(zhǔn)分別在由飲食制造商確定的分析規(guī)格和定期設(shè)施水評(píng)估內(nèi)。水符合對(duì)于證明為可接受用于人消耗所需的所有標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 動(dòng)物標(biāo)識(shí)和隨機(jī)化
借助于基于體重和血漿膽固醇譜的分層隨機(jī)化操作完成分配。在分配至組前和后，每只動(dòng)物通過(guò)腹部上的紋身進(jìn)行鑒定。紋身置于所有集落動(dòng)物上，作為在常規(guī)健康檢查過(guò)程中的鑒定方法。擬定籠計(jì)劃以鑒定在內(nèi)飼養(yǎng)的個(gè)體，并且個(gè)別猴通過(guò)與其分別籠附著的標(biāo)記標(biāo)簽進(jìn)一步鑒定。組大小、劑量和標(biāo)識(shí)號(hào)
動(dòng)物分配至2個(gè)處理組，由每個(gè)組中的4只猴組成。根據(jù)設(shè)施編號(hào)系統(tǒng)，對(duì)每只猴提供專門動(dòng)物標(biāo)識(shí)號(hào)。這個(gè)系統(tǒng)通過(guò)字母隨后為3個(gè)數(shù)字號(hào)例如Y032獨(dú)特地鑒定每只猴。施用途徑和頻率
在靜脈內(nèi)遞送的第1、3和5天時(shí)，動(dòng)物通過(guò)手動(dòng)輸注經(jīng)過(guò) 10分鐘每天給藥一次。輸注率將是24 mL/kg/小時(shí)。在給藥操作前和過(guò)程中，動(dòng)物用氯胺酮和賽拉嗪進(jìn)行鎮(zhèn)靜。將靜脈導(dǎo)管(Terumo微型靜脈輸液裝置，20號(hào)針，或相似的合適輸液裝置)插入隱靜脈內(nèi)。給藥在每只猴中在動(dòng)物醒來(lái)后不久且在進(jìn)食前在8:00和10:00 a.m之間發(fā)生。如下文血液化學(xué)節(jié)段中所述，僅在每次輸注前收集血樣，以評(píng)估血漿膽固醇和其他脂質(zhì)水平。采血在2次取樣間隔時(shí)的進(jìn)食前，以使飲食對(duì)膽固醇測(cè)量的作用降到最低。臨床觀察
在每天給藥時(shí)記錄治療反應(yīng)的所有可見體征。此外，動(dòng)物就物理屬性例如外表和一般狀況每周檢查至少一次。

體重
在處理過(guò)程中和處理后時(shí)期以每周間隔記錄體重。食物消耗
不定量個(gè)體食物消耗。然而，監(jiān)控進(jìn)食方式且作出任何較大改變的備注。死亡率和發(fā)病率
將記錄死亡率和發(fā)病率。在研究負(fù)責(zé)人和可能的發(fā)起人的監(jiān)控科學(xué)家商量后，作出關(guān)于過(guò)早處死的任何決定。將對(duì)發(fā)現(xiàn)死亡或被過(guò)早殺死的動(dòng)物實(shí)施尸檢，收集肝臟、腎、心臟和脾肺組織用于組織病理學(xué)。在過(guò)早處死的事件中，還將獲取血樣(可能時(shí))且測(cè)定參數(shù)。在固定工作時(shí)間后發(fā)現(xiàn)死亡的動(dòng)物將冷凍過(guò)夜，且在下一個(gè)工作日開始時(shí)執(zhí)行尸檢。如果動(dòng)物狀況需要過(guò)早處死，那么它將通過(guò)靜脈內(nèi)過(guò)劑量的戊巴比妥鈉實(shí)施安樂(lè)死。所有研究受動(dòng)物使用原則(Principles for Use of Animals)控制。RxGen由法律要求遵照美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部靈長(zhǎng)類設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，這指示必須遵守在這個(gè)研究?jī)?nèi)指定為溫和的操作的嚴(yán)重性水平。臨床實(shí)驗(yàn)室研究 血樣
在處理前從所有動(dòng)物獲得3個(gè)血樣，以確定血漿膽固醇基線。在處理后收集血樣且經(jīng)由淺表靜脈穿刺獲取。在任何一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)收集的體積不超過(guò)8 ml，這代表成年猴的約4%總血容量。
動(dòng)物在2個(gè)基線時(shí)間點(diǎn)時(shí)以及在研究第1、3、5、7、9、11、13和15天時(shí)抽血，伴隨如
果意識(shí)到擾動(dòng)那么其后繼續(xù)的 每周收集，直至組I中的血漿膽固醇標(biāo)準(zhǔn)化(AP0A1)。在第
1、6和11天時(shí)收集8毫升血液，以允許評(píng)估臨床化學(xué)、脂質(zhì)譜和凝固譜。在所有其他天數(shù)時(shí)，僅收集足夠用于臨床化學(xué)和脂質(zhì)譜的5毫升血液。在進(jìn)行化學(xué)和血液學(xué)測(cè)量當(dāng)天將血樣分成3份。將一個(gè)樣品收集到包含25 μ I肝素的血漿收集管內(nèi)，并且標(biāo)記有研究編號(hào)、劑量水平、天數(shù)、日期、獨(dú)特動(dòng)物標(biāo)識(shí)號(hào)。在分離后，取出I毫升血漿至攜帶上述細(xì)節(jié)的無(wú) 菌凍存管，且適當(dāng)貯存直至運(yùn)送用于血液化學(xué)分析。取出一個(gè)血漿等分試樣(0.5毫升)至標(biāo)記有上述細(xì)節(jié)的無(wú)菌凍存管，且適當(dāng)貯存直至運(yùn)送用于血漿膽固醇分布和脂質(zhì)譜分析。使另外I毫升和0.5毫升血漿等分試樣速凍且貯存于液氮中，以充當(dāng)備份樣品用于可能的另外分析。2個(gè)另外的全血樣等分試樣(各2.5毫升)用酸性檸檬酸鹽葡萄糖(ACD)抗凝劑處理且標(biāo)記，并且貯存于4°C直至運(yùn)送用于下文詳述的凝固和CBC測(cè)量。運(yùn)送樣品以在取樣24小時(shí)內(nèi)達(dá)到，或在穩(wěn)定條件下貯存用于在確定合適的時(shí)間、一 、. /.
僅在取樣方法或測(cè)定方法被認(rèn)為超出正常質(zhì)量限制時(shí)獲取重復(fù)樣品。將樣品獲取到標(biāo)記管內(nèi)。血液學(xué)
對(duì)在第1、6和11天時(shí)(以及如果在這些時(shí)間點(diǎn)中的任何時(shí)檢測(cè)到擾動(dòng)的另外天時(shí))收集的所有樣品測(cè)量全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)、凝血酶原時(shí)間、PTT、纖維蛋白原和D-二聚體。對(duì)在包含EDTA的真空采血管中收集的I毫升全血評(píng)估血細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)在包含酸性檸檬酸鹽葡萄糖(ACD)抗凝劑的真空采血管中收集的約2.0毫升血液執(zhí)行凝固譜測(cè)定。血液化學(xué)
葡萄糖、血尿素氮、肌酸酐、總蛋白質(zhì)、白蛋白、總膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT )、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST )、膽固醇、鈣、磷、鈉、鉀、氯化物、A/G比值、BUN/肌酸酐(計(jì)算的)、球蛋白(計(jì)算的)、脂肪酶、淀粉酶、甘油三酯、CPK、乳酸脫氫酶、Y谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、鎂、總膽固醇 LDL、VLDL、HDL、ApoA1、ApoA2、ApoB、ApoE、ApoLp (a)。對(duì)每一個(gè)血漿樣品進(jìn)行超化學(xué)(superchemistries)以及LDL和HDL測(cè)量。在評(píng)估LDL和HDL數(shù)據(jù)后，對(duì)選擇樣品進(jìn)行ApoAl測(cè)量。對(duì)約1.0 mL血漿執(zhí)行測(cè)定用于超化學(xué)測(cè)量，且對(duì)0.5ml血漿執(zhí)行測(cè)定用于膽固醇分布和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因測(cè)量。收集另外的血漿等分試樣且貯存用于可能的未來(lái)分析。肝臟活組織檢查
在基線時(shí)以及在第7和17天時(shí)，對(duì)所有猴執(zhí)行經(jīng)皮肝臟活組織檢查。將采用14號(hào)活組織檢查針(INRAD),以獲得來(lái)自肝臟右和左葉的2個(gè)中心活組織檢查(長(zhǎng)度 1.0 cm)。在如下所述的再分前，通過(guò)在活組織檢查針上的活組織檢查樣品的目視檢查證實(shí)成功的活組織檢查。合并樣品且隨后以下述方式分開。將來(lái)自左葉的一個(gè)活組織檢查的一半Γ0.5cm)浸入多聚甲醛中，用于切片用于組織病理學(xué)和原位分析。立即將每個(gè)分開活組織檢查的其余一半以及其他2個(gè)完整的活組織檢查浸入包含2 mis RNAlater (Qiagen)的標(biāo)記凍存管中，并且在4°C下孵育過(guò)夜，這之后抽吸RNAlater且使樣品管在液氮中速凍。在液氮中轉(zhuǎn)運(yùn)后，采用Trizol或TriReagent法分離總RNA,具有 40 μ g/1.0 cm 14 g中心活組織檢查的期望得率(對(duì)于衍生自來(lái)自單只猴的所有4個(gè)合并中心活組織檢查的合并RNA總共 80-100 y g，不存在保存用于組織病理學(xué)和原位的組分)。5yg RNA級(jí)分用于靶特異性實(shí)時(shí)qPCR (TaqMan miRNA測(cè)定，ABI )。其余RNA級(jí)分保存用于可能的全基因組表達(dá)分析。處理固定組織用于石蠟包埋。切片染色用于H&E和在肉眼組織學(xué)發(fā)現(xiàn)下報(bào)告組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。在這個(gè)工作中生成的所有載玻片攜帶具有研究編號(hào)、劑量水平、天數(shù)、日期、獨(dú)特動(dòng)物標(biāo)識(shí)號(hào)的標(biāo)記。統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)
執(zhí)行關(guān)于血液學(xué)、臨床化學(xué)和脂質(zhì)譜的描述統(tǒng)計(jì)學(xué)。對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合適生物信息學(xué)分析。樣本大小
基于給非洲綠猴施用修飾反義寡核苷酸且產(chǎn)生臨床化學(xué)和脂質(zhì)譜改變的先前實(shí)驗(yàn)和相關(guān)變異性進(jìn)行樣本大小測(cè)定。用于功效評(píng)估的受試者總數(shù)目是20只加入的(enrolled)動(dòng)物，其中4只動(dòng)物/處理組，和4只另外篩選的動(dòng)物。結(jié)果:
結(jié)果顯示于下述圖中。圖1U:如分別通過(guò)實(shí)時(shí)PCR和ELISA測(cè)定的(2個(gè)左圖)，與基線水平比較，在用⑶R-962針對(duì)ApoAl反義DA327409ext設(shè)計(jì)的寡核苷酸處理后，在猴肝臟活組織檢查中增加的ApoAl mRNA (上圖)和蛋白質(zhì)(下圖)水平。在用在體外顯示對(duì)ApoAl水平?jīng)]有作用的寡核苷酸(CUR-963，2個(gè)右圖)給藥的對(duì)照組中相同時(shí)間段后，ApoAl mRNA和蛋白質(zhì)水平不改變。盡管本發(fā)明已就 一個(gè)或多個(gè)實(shí)現(xiàn)而言舉例說(shuō)明且描述，但在閱讀和理解本說(shuō)明書和附圖后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到等價(jià)改變和修飾。此外，雖然本發(fā)明的特定特征可以就幾個(gè)實(shí)現(xiàn)中的唯一一個(gè)而言公開，但此類特征可以與其他實(shí)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)其他特征組合，如對(duì)于任何給定或特定應(yīng)用可以是所需和有利的。公開內(nèi)容的摘要將允許讀者快速確定技術(shù)公開內(nèi)容的性質(zhì)。提供該摘要并理解，它將不用于解釋或限制下述權(quán)利要求范圍或含義。
權(quán)利要求
1.靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)域的至少一種反義寡核苷酸在制備用于體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中相對(duì)于對(duì)照，所述脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的功能和/或表達(dá)在體內(nèi)或體外增加。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的天然反義序列。
4.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
5.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
6.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述至少一種反義寡核苷酸包括一種或多種修飾，所述修飾選自:至少一種修飾的糖部分、至少一種修飾的核苷間鍵合、至少一種修飾的核苷酸和其組合。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述一種或多種修飾包括至少一種修飾的糖部分，所述至少一種修飾的糖部分選自2’-O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’-甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、雙環(huán)糖部分及其組合。
8.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述一種或多種修飾包括至少一種修飾的核苷間鍵合，所述至少一種修飾的核苷間鍵合選自硫代磷酸酯、2’-O甲氧基乙基(M0E)、2’_氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亞氨酸乙酯、羧甲基酯和其組合。
9.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所`述一種或多種修飾包括至少一種修飾的核苷酸，所述至少一種修飾的核苷酸選自肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)，其類似物、衍生物和組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，其調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的表達(dá)和/或功能，尤其是通過(guò)靶向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因的天然反義多核苷酸。本發(fā)明也涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因表達(dá)有關(guān)的疾病和病癥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/713GK103223177SQ20131015626
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者J.科拉德, O.霍爾科瓦謝爾曼 申請(qǐng)人:庫(kù)爾納公司