一種柯薩奇病毒a6型核酸的檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸檢測試劑盒，具體涉及一種快速柯薩奇病 毒A6型的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測試劑盒，可應(yīng)用于公共衛(wèi)生單位和臨床醫(yī)療單位， 以對柯薩奇病毒A6型引起的手足口病暴發(fā)疫情、聚集性病例和臨床病例進(jìn)行快速、定性或 定量檢驗。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口病是由多種腸道病毒（human enterovirus，HEV)引起的出瘆發(fā)熱性急性傳 染病，主要感染嬰幼兒。該病報道最早見于20世紀(jì)50年代末，并分別于1958年、1969年 從臨床樣品中成功分離得到柯薩奇病毒A16型和腸道病毒71型兩種病原體。之后數(shù)十年 中，柯薩奇病毒A16型和腸道病毒71型在世界不同國家和地區(qū)交替流行，被認(rèn)為是手足口 病最重要的病原體。但是自2008年起，另一種可以引起手足口病的腸道病毒--柯薩奇病 毒A6型，其感染性和致病力突然增強(qiáng)。短短數(shù)年間在歐洲（芬蘭、法國、西班牙、英國）、東 亞（日本、中國臺灣）、東南亞（新加坡、泰國）、美洲（美國、古巴）和大洋洲（新西蘭）的 許多國家和地區(qū)引起不同規(guī)模的流行，甚至造成較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。作為手足口病 流行較廣的中國，近幾年來也呈現(xiàn)出病原譜組成發(fā)生改變的新情況。如2011年深圳市數(shù)據(jù) 顯示，柯薩奇病毒A6型已取代柯薩奇病毒A16型，成為該市手足口病排名第二位的病原體。 2012年，湖北十堰、福建福州等多地的柯薩奇病毒A6型感染均上升明顯，也成為當(dāng)?shù)厥肿?口病最主要的病原體之一。2013年初，北京、西安、河南、江蘇、廣東以及全國多地柯薩奇病 毒A6型感染在短時間內(nèi)急劇上升，首次出現(xiàn)全國范圍內(nèi)的柯薩奇病毒A6型手足口疫情。綜 合國內(nèi)外情況，柯薩奇病毒A6型極有可能穩(wěn)定地成為手足口病主要病原體，在未來與腸道 病毒71型、柯薩奇病毒A16型長期并存，交替流行，改變手足口病流行的既有規(guī)律。因此， 開展對柯薩奇病毒A6型腸道病毒的日常監(jiān)測和臨床檢驗已十分必要。
[0003] 長久以來實驗室對柯薩奇病毒A6型的鑒定多采用對病毒基因擴(kuò)增后測序的方式 實現(xiàn)，顯然不適合應(yīng)用在大量樣品的日常篩檢以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢驗之中。近 期有個別品牌的同時檢測柯薩奇病毒A6型和其它某型腸道病毒的雙通道檢測試劑產(chǎn)品面 世。雖然提供了一種檢測方法，但是因其是雙通道產(chǎn)品，成本較高，應(yīng)用在柯薩奇病毒A6型 的專項檢測工作時，存在嚴(yán)重浪費的情況。因此建立一套成熟、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的，專門針對柯薩 奇病毒A6型腸道病毒檢測的方法，以滿足疾控機(jī)構(gòu)和醫(yī)療單位開展柯薩奇病毒A6型的日 常監(jiān)測和應(yīng)急檢驗需求，為新形勢下手足口病防控提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種柯薩奇病毒A6型的核酸檢測試劑盒及檢測 方法。
[0005] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 一種柯薩奇病毒A6核酸的檢測試劑盒，包括：柯薩奇病毒A6正向引物、反向引物 以及特異性熒光探針，其中所述柯薩奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示、 所述柯薩奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述特異性熒光探針的核苷 酸序列如SEQ ID No. 3,其5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
[0007] 在一些實施方案中，所述特異性熒光探針的熒光報告基團(tuán)選自FAM、VIC、JOE、TET、 CY3、CY5、R0X、Texas Red 或 LC RED640 中的任一種，熒光淬滅基團(tuán)選自 BHQ1、BHQ2、BHQ3、 Dabcyl或Tamra中的任一種。
[0008] 在一些實施方案中，所述的核酸檢測試劑盒，還包括實時熒光PCR反應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄 體系、柯薩奇病毒A6型標(biāo)準(zhǔn)品和DEPC處理水中至少一種。
[0009] 在一些實施方案中，所述實時熒光PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、耐熱Taq DNA聚合酶、 硫酸鎂、三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物組成。
[0010] 在一些實施方案中，所述逆轉(zhuǎn)錄體系由MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑和隨機(jī)引物 組成。
[0011] 在一些實施方案中，柯薩奇病毒A6型標(biāo)準(zhǔn)品為含有柯薩奇病毒A6型VPl基因部 分序列的陽性質(zhì)粒。
[0012] 在一些優(yōu)選實施方案中，所述含有柯薩奇病毒A6型VPl基因部分序列的陽性質(zhì)粒 的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種柯薩奇病毒A6核酸的檢測方法，提取待測樣品RNA，以待測 樣品RNA為模板，在柯薩奇病毒A6正向引物、反向引物、特異性焚光探針及實時焚光PCR反 應(yīng)液、逆轉(zhuǎn)錄體系和DEPC處理水存在下進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)實時熒光PCR的 擴(kuò)增曲線分析待測樣品；其中所述柯薩奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示、所述柯薩奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述特異性熒光探針的 核苷酸序列如SEQ ID No. 3,其5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
[0014] 在一些實施方案中，所述正向引物、反向引物和特異性熒光探針的摩爾比為 7:7:2。
[0015] 在一些實施方案中，所述實時熒光定量PCR反應(yīng)程序為：45°C，15min ;95°C，2min ; 然后40個循環(huán)，每個循環(huán)95°C，15s ;60°C，60s。
[0016] 本發(fā)明提供的柯薩奇病毒A6型核酸的檢測試劑盒至少具有如下技術(shù)效果之一：
[0017] 1、本發(fā)明所述試劑盒中各組分配制體系時操作簡單便捷，PCR擴(kuò)增時間較短，約為 60-70min，PCR體系各組分加量完畢后反應(yīng)管始終封閉，降低了發(fā)生實驗室污染的幾率，且 具有高度的特異性和敏感性。
[0018] 2、本發(fā)明所述試劑盒可以對柯薩奇病毒A6型進(jìn)行定量檢測和定性檢測，適合對 手足口病病人的病情進(jìn)展情況和臨床治療效果進(jìn)行評估。
[0019] 3、本發(fā)明所述試劑盒采用單通道檢測技術(shù)，對PCR擴(kuò)增儀要求低，適合針對柯薩 奇病毒A6型的大樣本量的專門篩檢，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0021] 圖1示實施例1五組引物探針對陽性臨床樣品A的PCR擴(kuò)增結(jié)果對比圖，其中，圖 中曲線1-5分別代表第1組-第5組引物探針對；
[0022] 圖2示實施例1五組引物探針對陽性臨床樣品B的PCR擴(kuò)增結(jié)果對比圖，其中，圖 中曲線1-5分別代表第1組-第5組引物探針對；
[0023] 圖3示實施例2不同引物探針摩爾配比對同一陽性臨床樣品樣本的PCR擴(kuò)增結(jié)果 對比圖；
[0024] 圖4示實施例5采用本發(fā)明實施例3所述試劑盒檢測對柯薩奇病毒A6型陽性臨 床標(biāo)本的檢測結(jié)果圖；
[0025] 圖5示試驗例1采用本發(fā)明實施例3所述試劑盒對不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲 線，A、B、C、D、E、F 代表分別代表1. 0 X 107copies/mL、I. 0 X 106copies/mL、I. 0 X IO5Copies/ mL、I. 0 X 104copies/mL、I. 0 X 103copies/mL 和 I. 0 X 102copies/mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0026] 圖6示試驗例1采用本發(fā)明實施例3所述試劑盒對不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo) 準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為PCR反應(yīng)起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)為CT值，A、B、C、D、E、F代表分別 代表1. 0X 107copies/mL、I. 0X 106copies/mL、I. 0X 105copies/mL、I. 0X 104copies/mL、 1.0 X 103copies/mL 和 1.0 X 102copies/mL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0027] 圖7示試驗例2采用本發(fā)明實施例3所述試劑盒檢測柯薩奇病毒A6型的特異性 實驗結(jié)果圖，僅有柯薩奇病毒A6型出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16 型、A4型、AlO型、B2型、B3型、?？刹《?型、A組輪狀病毒、甲型流感病毒H3型、新HlNl 型、乙型流感病毒Victoria型、Yamagata型、麻瘆病毒和風(fēng)瘆病毒，均無特異性擴(kuò)增曲線產(chǎn) 生。
【具體實施方式】
[0028] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A6核酸的檢測試劑盒，包括：柯薩奇病毒A6正向引 物、反向引物以及特異性熒光探針。
[0030] 引物是在聚合作用的起始時，與反應(yīng)物以共價鍵形式連接的一段短的單鏈核苷酸 序列，作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3'端開始合成新的核酸鏈。本發(fā) 明所述柯薩奇病毒A6核酸的檢測試劑盒中所述柯薩奇病毒A6正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示、所述柯薩奇病毒A6反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明所述柯薩奇病毒A6正向引物和所述柯薩奇病 毒A6反向引物可以分別各自獨立的存在于本發(fā)明所述柯薩奇病毒A6核酸的檢測試劑盒 中。
[0032] 本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以理解，本發(fā)明所述柯薩奇病毒A6正向引物和所述柯薩奇 病毒A6反向引物可以以引物混合液形式存在于本發(fā)明所述柯薩奇病毒A6核酸的檢測試劑 盒中。所述引物混合液中所述柯薩奇病毒A6正向引物與所述柯薩奇病毒A6反向引物的摩 爾比為1:1。
[0033] 實時熒光PCR擴(kuò)增時，在加入一對引物的同時需加入一個特異性的熒光探針，該 探針為一段5'端和3'端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)，可以特異性與 PCR產(chǎn)物以共價鍵形式結(jié)合的寡核苷酸序列。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅 基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，探針與PCR產(chǎn)