氧化苦參堿在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種氧化苦參堿在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明提供了氧化苦參堿，在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病，特別是柯薩奇病毒A16型和柯薩奇病毒B3型感染性疾病的藥物的新應(yīng)用。將氧化苦參堿制備得到的藥物，對(duì)柯薩奇病毒感染性疾病有預(yù)料不到的治療效果。
【專利說(shuō)明】氧化苦參堿在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及氧化苦參堿的應(yīng)用，尤其是氧化苦參堿在制備治療柯 薩奇病毒感染性疾病藥物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 氧化苦參堿（Oxymatrine)是從中藥苦豆子中提取的或化學(xué)合成等途徑獲得的一 種生物堿，其分子式為C 15H24N2O2. H2O,分子量為282。無(wú)色結(jié)晶，熔點(diǎn)2080°C，易溶于水。氧 化苦參堿是苦參的主要藥理活性成分之一，具有清熱、燥濕、解毒、利尿、祛風(fēng)、殺蟲(chóng)之功效。
[0003] 柯薩奇病毒屬于小核糖核酸病毒科腸病毒屬，據(jù)其在乳鼠中引起病變的差異分為 A、B兩個(gè)組，A組和B組均可感染人類。經(jīng)消化道傳播感染人類，可引起手足口病、腦膜腦 炎、心肌炎、皰疹性咽峽炎、支氣管炎和腮腺炎等。目前，常用的治療方法主要為抗病毒（利 巴韋林、阿昔洛韋）、免疫調(diào)節(jié)（干擾素、免疫球蛋白）、促進(jìn)心肌代謝（三磷酸腺苷、輔酶A、 肌苷等）、中藥治療、對(duì)癥治療等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供一種氧化苦參堿在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物 的應(yīng)用。特別是提供一種氧化苦參堿在制備治療柯薩奇病毒A16型和柯薩奇病毒B3的藥 物的應(yīng)用。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：一種氧化苦參堿在制備治療 柯薩奇病毒感染性疾病藥物的應(yīng)用。
[0006] 上述的應(yīng)用中，所述的治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物，是治療柯薩奇病毒A16 型和柯薩奇病毒B3的藥物。
[0007] 前述的應(yīng)用中，所述的治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物，是以氧化苦參堿為原料， 按常規(guī)制劑工藝，再加入相應(yīng)輔料，制備成任何一種適合于臨床上使用的口服或非口服劑 型。
[0008] 前述的應(yīng)用中，所述的口服或非口服劑型包括散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、微囊 齊IJ、丸劑、滴丸、軟膠囊、口服液、糖漿劑、分散片、噴霧劑或氣霧劑、靜脈注射劑、肌肉注射 齊IJ、吸入劑或凝膠劑。
[0009] 前述的應(yīng)用中，所述的輔料包括常規(guī)的溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘 合劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、增稠劑、增溶劑和基質(zhì)。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明提供了氧化苦參堿，在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病， 特別是柯薩奇病毒A16型和柯薩奇病毒B3型感染性疾病的藥物的新應(yīng)用。將氧化苦參堿 制備得到的藥物，對(duì)柯薩奇病毒感染性疾病有預(yù)料不到的治療效果。
[0011] 以下是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例：
[0012] 實(shí)驗(yàn)例1 :氧化苦參堿抗柯薩奇病毒A16型和B3型的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
[0013] UHela細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)
[0014] ⑴實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：將一次性細(xì)胞瓶、泡酸并滅菌處理后的移液管及尖頭玻璃離心管、 污物缸放于超凈工作臺(tái)臺(tái)面上，開(kāi)啟紫外30分鐘后關(guān)閉。將4°C保存的1640完全培養(yǎng)基放 入37°C溫箱中預(yù)溫，并將水浴箱中的水預(yù)熱至37°C。
[0015] ⑵將凍存于液氮中的Hela細(xì)胞迅速取出，直接投入已預(yù)熱至37°C的水浴箱中，并 輕輕不斷搖動(dòng)使其內(nèi)容物在1分鐘完全融化成懸液。取出凍存管，用2%新潔爾滅擦拭后放 入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液管將懸液轉(zhuǎn)移至一潔凈尖頭玻璃離心管中，加入2-3mll640完全 培養(yǎng)基，配平后IOOOrpm離心約3-4分鐘，吸凈上清后加入2-3ml 1640完全培養(yǎng)基，將沉淀 輕輕吹勻制成細(xì)胞懸液。
[0016] ⑶倒置顯微鏡下觀察，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)并每日觀察復(fù)蘇后的細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁 情況，待Hela細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后即可傳代。
[0017] ⑷換液及傳代：觀察Hela細(xì)胞換液后貼壁生長(zhǎng)情況良好，形態(tài)正常為多邊形。
[0018] 2.柯薩奇病毒的活化增殖
[0019] ⑴將購(gòu)回的CVA16(即柯薩奇病毒A16型）和CVB3(即柯薩奇病毒B3型）病毒液 從液氮中取出，使其自然完全融化。
[0020] ⑵病毒感染細(xì)胞：在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層Hela細(xì)胞培 養(yǎng)物中的舊培養(yǎng)基吸棄，用IXPBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次后加入融化后的CVA16和CVB3病 毒原液，37°C孵育2小時(shí)使病毒吸附，然后將多余的病毒液吸棄，以I XPBS緩沖液漂洗3次 后加入適量1640維持液，倒置顯微鏡下觀察后37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，48小時(shí)后收集培 養(yǎng)液。
[0021] ⑶收集活化增殖后的病毒液：每日觀察病毒感染細(xì)胞情況，病毒成功在細(xì)胞中增 殖后可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)變大變圓、脫落、出現(xiàn)融合細(xì)胞等細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)，待75%以上細(xì)胞 出現(xiàn)細(xì)胞病變，無(wú)菌操作將細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌尖頭玻璃離心管中，3000rpm離心 約3分鐘后棄去沉淀保留上清液，分裝至凍存管中，-20°C保存?zhèn)溆没騼鲇谝旱小?br> [0022] 3.測(cè)定 CVA16 和 CVB3 對(duì) Hela 細(xì)胞的 TCID50
[0023] ⑴將Hela細(xì)胞計(jì)數(shù)為濃度1-5 X IOVml，并接種到96孔細(xì)胞板上，37°C、5 % CO2培 養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層。
[0024] ⑵將活化增殖后凍于_20°C備用的CVA16和CVB3病毒液自然解凍。在EP管中用 RPMI-1640維持液將CVA16和CVB3病毒液以10倍梯度稀釋法連續(xù)稀釋成KT1-KT'將10 倍梯度稀釋的CVA16和CVB3液，分別接種100 μ 1于各Hela細(xì)胞單層培養(yǎng)物，每稀釋度8 孔。37°C孵育1小時(shí)使病毒吸附，將多余的病毒吸棄，加入100 μ 1/孔1640維持液，37°C、 5% CO2培養(yǎng)，逐日觀察CPE并照相，連續(xù)觀察3-5天（一般2-3天細(xì)胞才會(huì)出現(xiàn)明顯CPE)， 細(xì)胞病變達(dá)50%以上計(jì)為陽(yáng)性。
[0025] ⑶按Reed-Muench方法計(jì)算CVA16的TCID5Q。LgTCID 5tl =高于50%病變率的病毒 稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)之間的差。距離比例=(高于50 %病變率-50 % ) / (>50%病變陽(yáng)性率-低于50%病變率），最后換算為TCID5cZml。病毒感染細(xì)胞后的48小 時(shí)和72小時(shí)都要觀察CPE并計(jì)算TCID 5tl。
[0026] 4. OMT對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0027] ⑴將Hela細(xì)胞計(jì)數(shù)為濃度1-5 X IO5Ail，并接種到96孔細(xì)胞板上，再加入20 μ 1/ 孔用1^^1-1640稀釋的不同稀釋度的01〇'(0.5、1、2、3、4、5、1011^/1111)或?qū)φ眨?xì)胞懸液+ 等量的PBS)，每個(gè)稀釋度OMT各加一排，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。倒置顯微鏡下觀察后37°C、5 % CO2培養(yǎng)48小時(shí)，并每日觀察各孔細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的差異。
[0028] ⑵MTT測(cè)定：將OMT的細(xì)胞毒性測(cè)定的各孔中的上清吸棄，加入I XPBS緩沖液洗 3次后輕輕扣去。避光操作加入20 μ 1/孔5mg/ml的MTT溶液，37°C孵育4小時(shí)后吸凈各孔 內(nèi)液體，加入1〇〇μ 1/孔DMSO終止反應(yīng)。37°C靜置10-15分鐘，震蕩搖勻，待各孔中的紫色 結(jié)晶物完全溶解可觀察見(jiàn)孔內(nèi)液體呈均勻紫色。用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔光吸收 度值。光吸收度值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。數(shù)據(jù)來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，以i± S表示， 用SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)處理，各濃度OMT與對(duì)照間的比較采用成組t檢驗(yàn)。
[0029] 5. OMT(即氧化苦參堿，下同）體外抗柯薩奇病毒實(shí)驗(yàn)
[0030] ⑴將Hela細(xì)胞計(jì)數(shù)為濃度1-5 X IOVml，并接種到96孔細(xì)胞板上，37°C、5 % CO2培 養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層。
[0031] ⑵稀釋OMT :用無(wú)菌蒸餾水溶解0ΜΤ，然后用RPMI-1640將濃度為125μ g/ml的OMT 用1:10PBS緩沖液對(duì)倍稀釋后得濃度為62. 5 μ g/ml的0ΜΤ，共得到濃度分別為1000 μ g/ ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml、125 μ g/ml、62. 5 μ g/ml 的 5 個(gè)不同稀釋度的 rMBD-3 用于抗病毒 實(shí)驗(yàn).
[0032] ⑶稀釋病毒：待凍于液氮中的病毒液自然完全融化，稀釋CVB3為100 X TCID5tl，即 KT3 7〇· lml。
[0033] (4)在EP管中分別先將270 μ 1病毒液和30 μ 15個(gè)不同稀釋度的rMBD-3、干擾素、 利巴韋林混勻備用。洗板后直接將上一步的混合液100 μ 1/孔加入96孔板各孔中，5個(gè)不 同稀釋度的rMBD-3、干擾素和利巴韋林各加一行，每行各設(shè)置3復(fù)孔。37°C孵育1小時(shí)吸棄 各孔上清，加入200μ 1/孔1640維持液維持細(xì)胞生長(zhǎng)。逐日觀察CPE，37°C、5% C02培養(yǎng) 48小時(shí)用MTT法測(cè)定各孔光吸收度值。
[0034] 6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0035] ⑴CVA16和CVB3對(duì)Hela細(xì)胞的TCID5tl測(cè)定結(jié)果
[0036] CVA16和CVB3均可致Hela細(xì)胞病變，正常Hela細(xì)胞為多邊形鋪于瓶壁。CVA16 或CVB3感染Hela細(xì)胞后，出現(xiàn)細(xì)胞變大變圓，脫離瓶壁，可見(jiàn)融合細(xì)胞出現(xiàn)（如圖1，圖1 中A為正常Hela細(xì)胞；B為CVA16感染Hela細(xì)胞后48小時(shí)；C為CVB3感染Hela細(xì)胞后 48小時(shí)）。檢測(cè)、計(jì)算可知：CVA16對(duì)Hela細(xì)胞的TCID 5tl為I(T5 8A). Iml ;CVB3對(duì)Hela細(xì)胞 的 TCID5tl 為 KT3.5/0· lml。
[0037] ⑵OMT對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：加入0· 5、l、2、3、4、5mg/ml0MT對(duì)Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，與對(duì)照組相比P〈〇. 05 ;而10mg/ml0MT可抑制Hela細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組 相比P>0. 1(圖2)
[0038] ⑶OMT體外抗柯薩奇病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖3是OMT抗CVB3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖4是OMT 抗CVA16細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖3和圖4可以看出，與病毒對(duì)照組相比，OMT各劑量組具有抑 制CVB3或CVA16復(fù)制，保護(hù)Hela細(xì)胞的作用（P〈0. 05)。其中，0. 2mg/ml0MT抑制柯薩奇病 毒的作用最顯著（P〈〇. 01)。
[0039] 實(shí)驗(yàn)例2 :氧化苦參堿防治柯薩奇病毒B3的小鼠感染模型
[0040] 1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
[0041] ⑴領(lǐng)取小鼠：領(lǐng)取Balb/C雌性小鼠150只，4周齡，適應(yīng)性喂養(yǎng)2天。
[0042] ⑵隨即將小鼠分為10組，每組15只：
[0043] ①正常組：不做任何處理，同其他組小鼠一起喂養(yǎng)；
[0044] ②模型組：100 X TCID5(ICVB3腹腔接種4次，不做治療或預(yù)防；
[0045] ③利巴韋林治療組：10mg/kg · D, QD,末次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0046] ④OMT治療高劑量組：12. 5mg/kg · D，QD，末次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0047] ⑤OMT治療中劑量組：6. 25mg/kg · D，QD，末次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0048] ⑥OMT治療低劑量組：3. 125mg/kg · D，QD，末次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0049] ⑦利巴韋林預(yù)防組：10mg/kg · D, QD,第一次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0050] ⑧OMT預(yù)防高劑量組：12. 5mg/kg · D，QD，第一次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0051] ⑨OMT預(yù)防中劑量組：6. 25mg/kg · D，QD，第一次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0052] ⑩OMT預(yù)防低劑量組：3. 125mg/kg · D，QD，第一次接種病毒后開(kāi)始治療；
[0053] ⑶稀釋利巴韋林：
[0054] (4)稀釋 OMT :
[0055] 2.檢測(cè)指標(biāo)
[0056] ⑴分別在末次接種病毒后的第5、12天處死3只小鼠/組，檢查小鼠心肌組織的病 理情況和病毒載量。
[0057] ⑵在末次接種病毒后的第28天處死所有小鼠，計(jì)算各組死亡率。
[0058] ⑶心肌組織的病理情況檢查：
[0059] ①稱量處死小鼠的體重，摘取心臟，吸盡血液后稱量心臟重量，計(jì)算心指數(shù)（心指 數(shù)=心臟重量/體重）。
[0060] ②將心臟組織制作成組織切片，行HE染色，顯微鏡下觀察病理反應(yīng)。
[0061] ⑷心肌組織病毒基因含量半定量檢測(cè)（RT-PCR):
[0062] ①稱取心肌組織lOOmg，提取總RNA ;
[0063] ②利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA ;
[0064] ③運(yùn)用CVB3的特異性引物擴(kuò)增其基因片段，瓊脂糖電泳后，分析電泳條帶的灰度 值，與內(nèi)參比較得到CVB3基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0065] 3.檢測(cè)指標(biāo)
[0066] 數(shù)據(jù)來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，以I-±S表示，用SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)處理，各組數(shù)據(jù)之 間的比較采用單因素的方差分析。
[0067] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0068] ⑴OMT對(duì)CVB3感染小鼠死亡率的影響：預(yù)防或治療性給予OMT可有效降低CVB3 感染小鼠的死亡率（表1)。OMT中、低劑量組的小鼠生存率均明顯低于模型組，表明OMT中 劑量和低劑量均具有較強(qiáng)的抗CVB3作用。
[0069] 表I OMT對(duì)CVB3感染小鼠死亡率和心指數(shù)的影響
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 氧化苦參堿在制備治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的治療柯薩奇病毒感染性疾病藥物， 是治療柯薩奇病毒A16型感染性疾病和柯薩奇病毒B3型感染性疾病的藥物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的治療柯薩奇病毒感染性疾病 藥物，是以氧化苦參堿為原料，按常規(guī)制劑工藝，再加入相應(yīng)輔料，制備成任何一種適合于 臨床上使用的口服或非口服劑型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的口服或非口服劑型包括散劑、片 齊?、顆粒劑、膠囊劑、微囊劑、丸劑、滴丸、軟膠囊、口服液、糖漿劑、分散片、噴霧劑或氣霧劑、 靜脈注射劑、肌肉注射劑、吸入劑或凝膠劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的輔料包括常規(guī)的溶劑、崩解劑、矯 味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、增稠劑、增溶劑和基質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK104288146SQ201410587164
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】江滟, 沈祥春, 朱榮金, 牟秋菊, 羅紅 申請(qǐng)人:江滟