專利名稱：一種柯薩奇病毒a16型病毒株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)、分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報導(dǎo)。1957年新西蘭首次報導(dǎo)，1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出HFMD命名。早期發(fā)現(xiàn)的手足口病的病原體主要為Cox A16型，手足口病與EV 71感染有關(guān)的報導(dǎo)則始自20世紀(jì)70年代初，1972年EV 71在美國被首次確認。此后EV 71感染與Cox A16感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。其多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疫，少數(shù)患兒可引起肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個別重癥患兒如果病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。其中柯薩奇病毒(Coxasckievirus) A16型(Cox A16，CA16)是手足口病主要病原體之一，它是小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒，呈20面立體對稱球形。雖然重癥和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但特別值得關(guān)注的是Cox A16與心肌炎、心包炎、難治性休克等綜合性疾病相關(guān)。我國自1981年在上海始見本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、西寧、廣東等十幾個省市均有報道。手足口病的爆發(fā)和流行嚴重影響了人們的日常生活，造成巨大的經(jīng)濟損失和社會負擔(dān)，利用病毒疫苗從根本上切斷病毒的傳播是目前較為有效的預(yù)防途徑之一，目前尚無CA16病毒疫苗的報道，因此分離出適于疫苗生產(chǎn)的CA16病毒株具有巨大的經(jīng)濟和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCCNo. 5373，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2011年10月18日。在電鏡下觀察該毒株，病毒顆粒呈20面立體對稱球形，直徑約23-30nm。前述的應(yīng)用，是將所述柯薩奇病毒A16型病毒株經(jīng)過感染細胞(如Vero細胞、人二倍體細胞或其它敏感細胞)、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，加入免疫佐劑(如氫氧化鋁等)后即得柯薩奇病毒A16型疫苗。前述的應(yīng)用，病毒株感染細胞后，于37°C培養(yǎng)，待細胞病變達75%以上時，收獲病毒液。前述的應(yīng)用，滅活使用β-丙內(nèi)酯或甲醛溶液。優(yōu)選用1 100-1 10000 (ν/ν)的β-丙內(nèi)酯或1 1000-1 10000 (ν/ν)的甲醛溶液滅活。病毒滅活也可在病毒純化以
后進行。本發(fā)明還提供，以本發(fā)明的柯薩奇病毒Α16型病毒株(CGMCC No. 5373)為免疫原制備抗體或雜交瘤細胞或抗血清。其中，抗血清的制備方法為病毒株經(jīng)過感染細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用疫苗原液免疫動物，獲得抗血清。所述動物優(yōu)選為猴、羊、兔等。通過進一步研究本發(fā)明病毒株產(chǎn)生的VPl蛋白，VPl保守區(qū)序列分析和質(zhì)譜分析結(jié)果表明該毒株為CA16病毒，且無外源物污染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(一 )通過蝕斑法分離得到的本發(fā)明的單克隆CA16病毒株，其子代病毒表現(xiàn)為遺傳穩(wěn)定，可用于人用CA16疫苗生產(chǎn)。( 二)利用本發(fā)明的CA16病毒株或由其生產(chǎn)的疫苗可用于預(yù)防由CA16病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩(wěn)定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。(三)本發(fā)明的CA16病毒株可在Vero細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.OlgCCID50/ml。


圖1為本發(fā)明CA16病毒株電鏡觀察結(jié)果(放大比例100，000倍)。圖2為本發(fā)明CA16病毒株蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1 CA16病毒株的分離、培養(yǎng)和鑒定(一)病毒分離、培養(yǎng)自2010年浙江省手足口疫區(qū)(手足口累計發(fā)病人數(shù)達111783)收集CA16病毒PCR結(jié)果陽性的病人糞便標(biāo)本，經(jīng)處理后接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養(yǎng)三代進行病毒分離，得到CA16病毒后，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。(二)病毒鑒定UVPl保守區(qū)序列分析結(jié)果對該毒株VPl保守區(qū)序列進行分析，其與參考株序列(人柯薩奇病毒A16型病毒株shzhOO-Ι，完整基因組序列GenBank :AY790926. 1)相比，核苷酸同源性在94. 8%以上。2、電鏡檢查結(jié)果在電鏡下觀察該株CA16病毒，病毒顆粒呈20面立體對稱球形，直徑約23-30nm。(圖1)3、質(zhì)譜分析結(jié)果對該株CA16病毒蛋白進行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明此毒株蛋白確為CA16病毒蛋白(圖 2)。4、無菌、支原體檢查結(jié)果對該株CA16病毒進行無菌、支原體檢查，結(jié)果表明無支原體和其它微生物污染。(按照《中國藥典》方法進行檢測)
5、病毒滴度檢測結(jié)果采用微量滴定法測定該株病毒收獲液的病毒滴度，病毒滴度可達7. Olg CCID50/ml。方法如下采用Vero細胞進行病毒滴度的測定。用96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Vero細胞，細胞成片后將病毒用細胞維持液從KT1倍比稀釋至10_8，棄去Vero細胞上清，分別加入每個稀釋度的病毒液，接種50 μ 1/孔，每個稀釋度接種8孔，同時設(shè)細胞對照。置37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d觀察細胞感染病毒情況，計算病毒滴度。6、抗原含量檢測采用酶聯(lián)免疫法對該株CA16病毒抗原含量進行檢測，抗原含量不低于200U/ml。采用雙抗體夾心法定量測定樣品中CA16抗原含量。首先將特異性CA16多克隆抗體包被于酶標(biāo)板形成固相抗體；然后加入CA16樣品，與固相抗體形成固相抗原抗體復(fù)合物；最后加入酶標(biāo)記抗體，樣品中的CA16抗原可與酶標(biāo)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)加入底物時出現(xiàn)成色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在適當(dāng)波長測定OD值，通過EXCEL統(tǒng)計分析結(jié)果。實施例2 CA16疫苗的制備CA16病毒株經(jīng)過感染Vero細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用于進一步制備CA16疫苗。(1)建立細胞主種子和工作種子庫(Vero細胞)將源自美國ATCC，120代非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)種子復(fù)蘇，具體操作是自液氮中取出細胞凍存管，置于39-40°C無菌水中，一分鐘之內(nèi)解凍細胞，無菌吸出懸液，IOOOrpm離心3min，棄上清，加入含10 %小牛血清的MEM細胞生長液，輕輕吹打使其混勻，將混勻的細胞懸液接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其貼壁后進行換液，再置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5-7天細胞匯合度達到100%時按1 4進行傳代，每傳代一次細胞代次增加一代。按上述方法制備1 代Vero細胞工作種子庫。依據(jù)上述方法，本領(lǐng)域的研究人員能同樣制備出滿足本發(fā)明要求的工作種子庫。細胞主種子庫和工作種子庫均保存在液氮(_196°C )中。(2)建立主代病毒種子庫和工作種子庫CA16病毒PCR結(jié)果陽性的手足口病患者的臨床標(biāo)本，經(jīng)處理后接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養(yǎng)三代進行病毒分離，得到CA16病毒后，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。按照《中國藥典》關(guān)于種子庫建立方法的要求建立病毒主種子庫和工作種子庫，種子庫均冷凍保存(_60°C以下)。建庫方法如下將CA16病毒株按1 1000(體積比)接種至匯合度在100%的Vero細胞(來自細胞工作種子庫)瓶中(培養(yǎng)基是含2%小牛血清的MEM病毒生長液)，置37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(CPE)。當(dāng)CPE達+++至++++時收獲病毒，置-20°C冷凍，室溫融化后，將凍融物按上述方法繼續(xù)傳代建立病毒主代種子庫和工作種子庫。并送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏。其保藏號為CGMCCNo.5373。每一批收獲液記為一代。(3)病毒收獲液制備復(fù)蘇Vero工作種子庫細胞，經(jīng)擴增后，將本發(fā)明的CA16病毒株按比例接種于長至薄單層的細胞瓶內(nèi)，37°C培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，當(dāng)細胞病變達50%以上時，收獲病毒液，混勻后置-20°C保存，備用。(4)病毒滅活和純化將上述制備的CA16病毒收獲液用1 100-1 10000 (ν/ν)的β -丙內(nèi)酯或1 1000-1 10000 (ν/ν)的甲醛溶液滅活。病毒滅活也可在病毒純化以后進行。病毒滅活后將上述滅活液進行離心澄清后，進行超濾透析，體積濃縮至原體積的1/10-50。得到的病毒超濾液加入磁力攪拌子，置于磁力攪拌器上攪拌，同時緩慢加入PEG (分子量為6000)使PEG終濃度為5_15%，調(diào)pH值至5. 0-7. 0之間，繼續(xù)攪拌10_60min。于2-8°C沉淀8-24h后離心20-60min，沉淀用PBS緩沖液重溶，離心后獲得病毒沉淀液。病毒沉淀液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心，收集病毒所在區(qū)帶后，經(jīng)超濾脫糖得到病毒脫糖液。病毒脫糖液經(jīng)分子篩層析后得到病毒層析液，層析液經(jīng)除菌后得到疫苗原液。(5)疫苗制備將上述疫苗原液與氫氧化鋁佐劑按適宜比例吸附后即獲得CA16疫苗半成品。CA16半成品經(jīng)分裝，檢定后即為成品疫苗。實施例3 CA16病毒株免疫原性試驗將實施例2中制備的CA16毒株疫苗原液進行純化，滅活后免疫小鼠、新西蘭兔、羊均獲得較好的保護效果。原液制備方法同實施例2所述。其中，對羊進行的免疫原性試驗如下將疫苗原液與氫氧化鋁佐劑等比例吸附后，于第0天、7天、14天、21天對羊進行免疫，2ml/只/次，在整個試驗期內(nèi)，對動物的健康情況、行為變化等做詳細記錄。在免疫當(dāng)天動物應(yīng)當(dāng)觀察半小時。每天兩次觀察動物有無死亡情況。分別于第0天、7天、14天、21天、觀天進行采血。靜脈采少量血，3000rpm離心lOmin，分離血清。進行抗CA16中和抗體滴度測定，方法如下在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入分離獲得的羊血清，用維持液進行倍比稀釋至一定濃度后，加入事先稀釋至100CCID50的CA16檢定毒株病毒液，中和1. 5h-2h后加入檢定用細胞懸液，細胞濃度為1.5-2.0X105個/ml，置于37°C，C02培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。5_7天后觀察細胞病變情況，其中以出現(xiàn)細胞病變的血清最高稀釋度為血清中和效價，陽性判定指標(biāo)中和效價大于1 8，陰性對照血清效價小于1 8。結(jié)果見表1。表1對羊進行免疫原性試驗的中和抗體檢測結(jié)果
采血時間血清名稱中和效價(1 )Od陰性血清< 87dCA16疫苗免疫羊血清814dCA16疫苗免疫羊血清1621dCA16疫苗免疫羊血清3228dCA16疫苗免疫羊血清32
從表1可以看出，使用本發(fā)明毒株制備的CA16疫苗從免疫動物第7天開始，就可誘發(fā)羊機體產(chǎn)生抗CA16病毒抗體，并且隨免疫次數(shù)的增加而呈上升趨勢。這一結(jié)果表明，使用該毒株制備的疫苗對羊具有較好的保護效果。實施例4以CA16病毒株為免疫原制備多抗血清將實施例2中使用CA16毒株制備的疫苗原液進行擴大培養(yǎng)，純化，滅活后免疫新西蘭兔，獲得了中和抗體效價較高的兔抗CA16多抗血清。原液制備方法同實施例2所述。將上述原液與弗氏完全佐劑充分乳化后，采取頸背部皮下與肌肉多點注射，3ml/只，5只/批。首次免疫后兩周加強，加強免疫疫苗原液與弗氏不完全佐劑充分乳化后，同樣采取頸背部皮下與肌肉多點注射，2ml/只/次，以后每周加強免疫一次，2ml/只/次，共加強免疫4次，每次加強免疫之前采血，對所得血清進行中和抗體效價測定，判斷最后采血時間。在中和抗體效價達到較高水平后，則在免疫后一周采血，在4°C條件下，3500r/min離心％iin，收集血清，進行中和抗體效價測定，方法如下在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入分離獲得的兔血清，用維持液進行倍比稀釋至一定濃度后，加入事先稀釋至100CCID50的CA16檢定毒株病毒液，中和1.5h-a!后加入檢定用細胞懸液，細胞濃度為1.5-2. OX IO5個/ml，置于37°C，CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。5-7天后觀察細胞病變情況，其中以出現(xiàn)細胞病變的血清最高稀釋度為血清中和效價，陽性判定指標(biāo)中和效價大于1 8，陰性對照血清效價小于1 8。結(jié)果在試驗成立前提下，五只新西蘭兔抗CA16血清混合液，血清效價在1 512以上。該結(jié)果表明使用本發(fā)明的CA16病毒株免疫新西蘭兔，可獲得血清效價較好的兔抗CA16多抗血清。為進一步驗證本發(fā)明CA16疫苗的免疫保護作用，發(fā)明人進行了動物實驗，即將本發(fā)明的CA16疫苗接種實驗動物后，對實驗動物進行毒攻，與未接種疫苗的實驗動物進行比較，結(jié)果表明，本發(fā)明的CA16疫苗具有較好的疫苗保護作用。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCC No. 5373。
2.權(quán)利要求1所述病毒株在制備預(yù)防或治療由柯薩奇病毒所致傳染病的藥物或疫苗及診斷試劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求1所述病毒株經(jīng)過感染細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，加入免疫佐劑后即得柯薩奇病毒A16型疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，病毒株感染的細胞為非洲綠猴腎細胞或人二倍體細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，感染細胞后，于37°C培養(yǎng)，待細胞病變達75%以上時，收獲病毒液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，滅活使用β-丙內(nèi)酯或甲醛溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，免疫佐劑為氫氧化鋁。
8.以權(quán)利要求1所述的病毒株為免疫原制得的抗體或雜交瘤細胞或抗血清。
9.以權(quán)利要求1所述的病毒株為免疫原制備抗血清的方法，其特征在于，權(quán)利要求1所述病毒株經(jīng)過感染細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用疫苗原液免疫動物，獲得抗血清。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述動物為猴、羊、兔。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCC No.5373。在電鏡下觀察該病毒呈20面立體對稱球形，直徑23-30nm。對該毒株分別進行了VP1保守區(qū)序列分析和質(zhì)譜分析，結(jié)果表明是CA16病毒，該株CA16病毒可在Vero細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.0lg CCID50/ml，且該毒株無外源污染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。
文檔編號G01N33/569GK102559606SQ20111044867
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者尹衛(wèi)東, 李雅靜, 王巍巍, 高強 申請人:北京科興生物制品有限公司