一種食品中致病菌定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品微生物檢測領域，具體涉及一種食品微生物的快速檢測方法，尤 其涉及一種食品中致病菌的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 食品安全是一個世界性的影響人類健康的重大問題，其與人類生存環(huán)境和社會穩(wěn) 定息息相關。其中細菌性食物中毒的危害最為嚴重，感染者輕可造成發(fā)熱、頭痛、腹痛、腹瀉 和嘔吐，重則會出現肌肉痙攣，甚至休克直至死亡，因此微生物的檢驗成為食品檢測必不可 少的重要組成部分，是衡量食品衛(wèi)生質量的重要指標之一，也是判定被檢食品能否食用的 科學依據之一。通過食品微生物檢驗，還可以判斷食品加工衛(wèi)生環(huán)境，能夠對食品被細菌污 染的程度做出正確的評價，為各項衛(wèi)生管理工作提供科學依據，提供傳染病和人畜食物中 毒的防治措施。
[0003] 據統(tǒng)計，目前導致細菌性食物中毒的細菌種類中，最常見的主要是沙門氏菌、單核 細胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌等等。針對這些細菌及其他 易危害人體健康的食品微生物，現有的檢測方法主要依賴于微生物富集培養(yǎng)-選擇性分 離-生化鑒定方法，該方法存在手工操作繁瑣費時、檢測靈敏度低、易出現假陰性等缺陷， 且衛(wèi)生指導反饋慢，給商品生產和流通帶來一定的影響。此外還有常用的免疫學方法和基 因探針法，前者雖能彌補傳統(tǒng)方法的一些不足，但也有誤差大、周期長的局限性；而后者也 存在檢測費用昂貴、實驗步驟多且費時的缺點。因此研宄食品微生物快速、準確、經濟的檢 測方法以預防和控制食品安全事件的發(fā)生，具有重要的現實意義。
[0004] 針對上述問題，近年來微生物學專家和工程技術人員密切合作，采用了各種物理 化學及生物技術對如何快速準確經濟的鑒定微生物進行了研宄分析，如采用了光散射技 術、發(fā)光技術、色譜技術、電氣電子技術、免疫技術及放射技術等，并基于上述分析技術發(fā)明 了許多定性或定量鑒定微生物的分析方法。常見的有：（1)檢測某些細菌的專有酶及代謝 產物進行快速鑒定；（2)應用免疫學方法檢測微生物抗原或抗體，如放射免疫分析（RIA)、 酶免疫分析（EIA)、熒光免疫分析（FIA)、化學發(fā)光免疫分析（CIA)、生物發(fā)光免疫分析 (BIA)等；（3)細菌毒素的快速檢測；(4)細菌對抗菌藥物的敏感性試驗的快速檢測；(5)分 子生物學技術在檢測微生物中的應用，如核酸探針（Nuclear acid probe)、聚合酶鏈反應 (Polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片技術（microarray)等；（6)快速檢測細菌生 化反應及成套鑒定系統(tǒng)；（7)病原微生物的自動化系統(tǒng)，其中最有代表性的是AMS微生物自 動分析系統(tǒng)。
[0005] 目前應用最多的是采用多重PCR方法來進行食品中微生物的檢測，例如楊國興在 多重PCR檢測肉及肉制品中四種食源性致病菌的研宄中，根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸 酶基因 nuc、沙門氏菌的侵染性質?？乖瑽基因 ipaB、志賀氏菌的侵染性質粒抗原H基因 ipaH、單核增生李斯特氏菌的內化素 A基因 inlA設計了四對特異性引物，進行多重PCR反 應，可同時實現對四種食源性致病菌的檢測；試驗過程中對多重PCR反應體系中引物添加 量、鎂離子濃度、dNTP混合物添加量及退火溫度和循環(huán)數等影響要素進行優(yōu)化，確定了適宜 的多重PCR反應體系和擴增程序（參見楊國興，"多重PCR檢測肉及肉制品中四種食源性 致病菌的研宄"，中國優(yōu)秀碩士學位論文數據庫，2008年6月10日）；另外，蘇裕心在建立 幾種食源性致病菌熒光定量PCR的檢測方法時，采用通過lambda噬菌體DNA標準物質候選 物的制備研宄，進行金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌DNA 基因組定量標準物質的制備研宄；并利用SmartCycler系統(tǒng)建立一種高敏、特異、簡便、快 速的qPCR檢測金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、沙門氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法， 并在LightCycler2. 0, ABI 7300儀器上對所建立的體系進行評估（參見蘇裕心，"幾種食 源性致病菌熒光定量PCR檢測方法的建立"，中國優(yōu)秀碩士學位論文數據庫，2010年5月26 日）。從目前的研宄來看，對于食品微生物進行多重PCR檢測時，主要集中在對PCR程序的 改進上，其存在微觀、不易操作的缺陷，并對設備和實驗室的要求比較高，而且容易出現假 陽性和假陰性樣本。
[0006] 目前也有一些研宄證實，通過調整混合培養(yǎng)基可以有效增殖致病菌，從而有助于 定量檢測食品中的微生物，例如楊軍等研宄了多重PCR法對食品中3種致病菌的同時快速 檢測，其通過調整混合培養(yǎng)基的配比摸索了食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌 的快速共增菌條件，使得3種致病菌在37°C搖床培養(yǎng)后濃度達到IO fVmL(參見楊軍等，"多 重PCR法對食品中3種致病菌的同時快速檢測"，中國乳品工業(yè)，第38卷第4期，2010年4 月25日）。然而，由于該研宄只針對上述3種致病菌的檢測，其存在一定的局限性，而對于 食品中的其它致病菌是否能夠進行同時快速檢測尚未知否。
[0007] 上述各種方法與傳統(tǒng)檢測方法相比，在高效快速方面雖已具有較大的進步，但仍 不能適應日益嚴格的食品質量檢測方面的高要求。而且，上述各方法中PCR鑒定方法基本 上具備了食品微生物檢驗新要求的各種條件，但在實際操作中仍會存在假陽性和無法判斷 微生物活性狀態(tài)等問題，因此如何尋找一種靈敏度高、特異性好，經濟、簡便的食品尤其是 食品中致病菌的定量檢測方法是目前亟待解決的問題。
[0008] CN103388031A中公開了一種結合非特異性擴增和多點RTQ-PCR的食品微生物檢 測方法，雖然其公開了將非特異性擴增培養(yǎng)、多點實時定量采樣及特異性實時定量PCR鑒 定技術結合起來，并根據PCR結果進行數據分析來檢測食品微生物的方法，然而，其所用的 非特異性擴增培養(yǎng)基為緩沖蛋白胨水，其對于沙門氏菌的擴增效果較好，但對于其它微生 物的擴增效果卻有限，因此，有必要尋找一種適合同時擴增多種食品微生物并使其均達到 良好擴增效率的非特異性擴增培養(yǎng)基；另外，該方法中對于最優(yōu)的非零時刻的選取并不明 確，其分別在3h、6h、9h和24h進行了檢測，在表1中列舉了 6h、8h、10h和12h所對應的Ct 值，盡管從表1中可以看出Ct值成下降趨勢，然而，其首先并未明確在哪個非零時刻的選取 可以同時使各種微生物的擴增實現最大效率，另外，更沒有明確Ct值選取何值時可以判定 食品中含有致病菌，甚至致病菌中活菌和死菌的情況，因此，如何明確上述問題也是目前急 需解決的一個問題。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種食品中致病菌的定量檢測方法，特別提供了一種 在短時間內判斷出食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性狀況及污染歷史的定 量檢測方法，通過該方法可以由目前使用的7天的細菌培養(yǎng)方法縮短至24小時；準確度由 目前的生理生化標準提高至分子水平；靈敏度可以達到單個菌；準確度和特異性都可以在 99%以上。
[0010] 為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0011] 第一方面，本發(fā)明提供了一種食品中致病菌定量檢測方法，其包括以下步驟： [0012] (1)擴增步驟：將疑似含有目標致病菌的樣品通過非特異性培養(yǎng)進行致病菌的擴 增；
[0013] (2)實時定量取樣步驟：在步驟（1)所述