生鮮果蔬食品中致病菌檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] 本發(fā)明涉及一種食品中致病菌快速檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】 [0002] 水果蔬菜中富含人體必需的維生素、有機酸、無機鹽和植物纖維等營養(yǎng) 成分，而即食生鮮果蔬食品因為食用方便、口味清新和味道鮮美，更是人們?nèi)粘Ｉ钪泻筒?桌上常見的食物。但是，生鮮果蔬食品僅經(jīng)簡單清洗，未經(jīng)高溫殺菌處理，其表面和內(nèi)部附 著的微生物，尤其是金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌等水果蔬菜中常見的致病菌因 而可能部分殘留，對生鮮果蔬食品的食用安全性造成了極大的隱患。因而，對生鮮果蔬食品 中致病菌的快速、準(zhǔn)確的檢測和鑒定技術(shù)就顯得格外重要了。目前，我國對生鮮果蔬食品中 致病菌的檢測仍以常規(guī)的微生物學(xué)檢測和鑒定方法為主。它的不足之處：費時、費力，且難 以快速、準(zhǔn)確的進行檢測，檢測成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種省時、省力，且能夠快速、準(zhǔn)確的進行檢測，節(jié) 約檢測成本的生鮮果蔬食品中致病菌多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒。
[0004] 本發(fā)明所述的檢測試劑盒，其中各組分組成及濃度為：⑴檢測金黃色葡萄球菌的 引物：上游引物 5'-TGC GAA ACA TCC ACG ACA TA-3'，下游引物 5'-CGT ITG TGC TGA ITT CCC TAC-3'，濃度為0.5~2.0ymol/L⑵檢測沙門氏菌的引物：上游引物5'-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3'，下游引物 5' -TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3'，濃度 為0. 5~2. Oymol/L，⑶檢測大腸桿菌的引物：上游引物5'-GGC GGA TAA GAC TTC GGC 丁八-3'，下游引物5'-〇6!'1'17 66〇4(^41'1'16〇〇：-3'，濃度0.5~2.0 11111〇1/1^4)鎂鹽， 濃度為1. 〇~2. 0 y mol/L，(5)脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)，濃度為0. 15~0. 25 y mol/L， (6) 10X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L，(7)水生棲熱菌（Taq)DNA聚合酶1. 0~ 3. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50. 0 yL。其中，鎂鹽為氯化鎂或硫酸鎂。
[0005] 應(yīng)用上述試劑盒對生鮮果蔬食品中致病菌進行檢測的方法具體如下：
[0006] (1)無菌操作取樣品放入無菌均質(zhì)袋（內(nèi)含100mL無菌生理鹽水）中在均質(zhì)儀上 拍打混勻，取1. 0mL樣液無菌操作涂于LB肉湯固體平板，37°C恒溫培養(yǎng)24h。在無菌條件下 將單菌落分別挑入各滅菌離心管中，分別加50 yL Lysis Buffer細(xì)胞裂解液，80°C水浴裂 解20min，1000r/min離心10min，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)模板液；
[0007] (2)將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中，試劑盒內(nèi)各 組分組成及濃度為：檢測金黃色葡萄球菌的引物0. 5~2. 0 ymol/L，檢測沙門氏菌的引 物0? 5~2. 0 y mol/L，檢測大腸桿菌的引物0? 5~2. 0 y mol/L，鎂鹽1. 0~2. 0 y mol/ L，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)0. 15~0. 25ymol/L，10X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng) 緩沖液5. 0 y L，水生棲熱菌（Taq)DNA聚合酶1. 0~3. 0U，用滅菌無離子水補足體積至 50. 0 y L。各致病菌DNA模板各3 y L，按現(xiàn)有技術(shù)，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴增儀（Thermo Scientific，型號：Arktik)上孵育，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min ; 95°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)32次；72°C終延伸10min，結(jié)束聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（PCR)擴增；
[0008] (3)將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取擴增后的產(chǎn)物5yL點樣于1%瓊脂 糖凝膠，其中含〇.5 y g/mL嗅化乙錠，以1000bp Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，以5V/cm的電 場強度于0. 5XTBE電泳緩沖液中電泳30min，電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析， 待檢樣品與陽性對照同時擴增出426bp的條帶，則判定為金黃色葡萄球菌陽性；待檢樣品 與陽性對照同時擴增出284bp的條帶，則判定為沙門氏菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時 擴增出151bp的條帶，貝1」判定為大腸桿菌陽性。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明針對生鮮果蔬食品中主要致病菌 而設(shè)計，一次可檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌三種致病菌，檢測時間由常規(guī)檢 測的3-5天，縮短為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)檢測的30小時以內(nèi)，省時省力，節(jié)約檢測成本。
【附圖說明】
[0010] 圖1為本發(fā)明試劑盒對實施例1的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1
[0012] (1)無菌操作取香菜樣品10g放入無菌均質(zhì)袋（內(nèi)含100mL無菌生理鹽水）中，在 均質(zhì)儀上拍打混勻，取1. OmL樣液無菌操作涂于LB肉湯固體平板，37°C恒溫培養(yǎng)24h。在無 菌條件下將單菌落分別挑入各滅菌離心管中，分別加50 yLLysis Buffer細(xì)胞裂解液，80°C 水浴裂解20min，1000r/min離心10min，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)模板液；
[0013] (2)將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中，試劑盒內(nèi) 各組分組成及濃度為：檢測金黃色葡萄球菌的引物l.Oumol/L，檢測沙門氏菌的引物 1. 0 ymol/L，檢測大腸桿菌的引物1. 0 ymol/L，氯化鎂1. 5 ymol/L，脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 0? 2 y mol/L，10 X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L，水生棲熱菌（Taq) DNA 聚合酶2. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50. 0 y L。各致病菌DNA模板各3 y L，在聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴增儀上孵育，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min;95°C 變性3〇8,59°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,32個循環(huán) ；721：終延伸1〇111111，結(jié)束聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴增；
[0014] (3)取擴增后的產(chǎn)物5yL點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0. 5yg/mL嗅化乙錠， 以1000bp Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，以5V/cm的電場強度于0. 5XTBE電泳緩沖液中電泳 30min，電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析。
[0015] 從圖1中可以看出，四種供檢測的香菜樣品中均不同程度的檢測出金黃色葡萄球 菌、沙門氏菌和大腸桿菌的存在。
[0016] 編號 M 為 1000bp marker ;
[0017] 編號1-4為四種供檢測的香菜樣品；
[0018] 編號5為金黃色葡萄球菌（426bp);
[0019] 編號6為沙門氏菌（284bp);
[0020] 編號7為大腸桿菌（151bp);
[0021] 編號8為陰性對照。
[0022] 待檢樣品與陽性對照同時擴增出426bp的條帶，則判定編號5的金黃色葡萄球菌 陽性。如待檢樣品與陽性對照同時擴增出284bp的條帶，則判定為編號6的沙門氏菌陽性； 如待檢樣品與陽性對照同時擴增出151bp的條帶，則判定為編號8的大腸桿菌陽性。
[0023] 實施例2
[0024] (1)無菌操作取黃瓜樣品10g放入無菌均質(zhì)袋（內(nèi)含100mL無菌生理鹽水）中，在 均質(zhì)儀上拍打混勻，取1. OmL樣液無菌操作涂于LB肉湯固體平板，37°C恒溫培養(yǎng)24h。在無 菌條件下將單菌落分別挑入各滅菌離心管中，分別加50 yLLysis Buffer細(xì)胞裂解液，80°C 水浴裂解20min，1000r/min離心10min，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)模板液；
[0025] (2)將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中，試劑盒內(nèi) 各組分組成及濃度為：檢測金黃色葡萄球菌的引物2.0 ymol/L，檢測沙門氏菌的引物 2. 0 ymol/L，檢測大腸桿菌的引物2. 0 ymol/L，氯化鎂2. 0 ymol/L，脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)0? 25 y mol/L，10X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L，水生棲熱菌（Taq) DNA 聚合酶3. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50.0 yL。各致病菌DNA模板各3 yL。在聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴增儀上孵育，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min;95°C 變性3〇8,59°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,32個循環(huán) ；721：終延伸1〇111111，結(jié)束聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴增；
[0026] (3)取擴增后的產(chǎn)物5 y L點樣于1 %瓊脂糖凝膠，其中含0. 5 y g/mL嗅化乙錠， 以1000bp Marker為標(biāo)準(zhǔn)