轉(zhuǎn)基因苜蓿草j163品系實時熒光pcr檢測用引物和探針及檢測方法和應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性的 實時熒光PCR檢測引物、探針及檢測方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國畜牧業(yè)特別是奶牛飼養(yǎng)量的增加，對于植物類飼料特別是苜蓿草的需求 也在每年增加。苜蓿草是美國繼玉米、小麥、大豆后第四大農(nóng)作物，因其蛋白含量約占總干 草質(zhì)量的17%~20%，與其他豆科牧草相比是一種極好的飼料作物。截至今年7月份，在 我國注冊的美國苜蓿草生產(chǎn)廠商就已達71家，據(jù)統(tǒng)計，2014年1~6月中國進口苜蓿草總 計40. 56萬噸，同比增26. 94% ;進口金額總計14966. 77萬美元，同比增23. 08%。其中，6 月中國進口苜蓿草6. 22萬噸，進口額2362. 75萬美元。
[0003] 轉(zhuǎn)基因苜蓿通過飼料進入動物養(yǎng)殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉(zhuǎn)基因食 品，可能對于人的健康產(chǎn)生影響。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物 進口安全評價管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管 理辦法》，凡是在中國境內(nèi)銷售的轉(zhuǎn)基因生物，必須進行標識。對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識需要檢測 方法的支撐。目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測主要包括對蛋白質(zhì)和核酸檢測兩大類，而后者應用 最廣泛的是熒光PCR檢測技術(shù)，相較普通PCR技術(shù)，它具更高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。實 時熒光PCR方法可通過熒光信號的積累實現(xiàn)實時監(jiān)測整個PCR進程，而后通過擴增曲線和 標準曲線對未知模板進行定性或定量分析。
[0004] 根據(jù)擴增目標片段位置的不同，基于核酸基礎上的PCR檢測又可以分為4種檢測 策略：1)篩查法：對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的啟動子中的啟動子、終止子等通用基因進行篩查；2) 基因特異性檢測：對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源目的基因進行檢測；3)構(gòu)建特異性檢測：對外源 目的基因與啟動子或終止子的特異連接序列進行檢測；4)品系特異性/轉(zhuǎn)化事件特異性檢 測：對外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進行檢測。由于啟動子、終止子、目的基因 可以有多種組合關(guān)系，同一組合轉(zhuǎn)化同一植物也可產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)化事件，特別對于進境監(jiān)管， 同一種作物有些轉(zhuǎn)基因品系是允許進口，而有些品系可能由于某種原因沒有區(qū)得準入。因 此篩查法、基因特異性檢測和構(gòu)建特異性檢測具有局限性，不能完全滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品身份 驗證等檢測、監(jiān)測和安全管理的需求。而品系特異性/轉(zhuǎn)化事件是指某個外源基因表達框 (或片段）插入到宿主基因組某個位置而形成的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。因此轉(zhuǎn)化事件一旦發(fā)生就 具有唯一性，針對轉(zhuǎn)化事件的檢測可以起到身份識別的作用。
[0005] 2014年年8月，國家質(zhì)檢總局近日依據(jù)福建檢驗檢疫局和山東檢驗檢疫局對苜蓿 草的篩查出轉(zhuǎn)基因成分的結(jié)果發(fā)布警示通報，發(fā)起對美國相關(guān)公司進境的轉(zhuǎn)基因苜蓿進行 為期6個月的檢測。
[0006] 抗草甘麟轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163 (商品名Roundup Ready alfalfa events J163)是 由美國孟山都公司研制開發(fā)一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草品系。2005年美國和加拿大批準環(huán)境釋放 和作為飼料應用，目前我國尚批準其進口。草甘膦（glvphosate)是孟山都（Monsanto)公 司生產(chǎn)的是一種施用于葉面的廣譜的、非選擇性的有機膦類除草劑（商品名為Roundup)。 它對于一年生和多年生雜草都有極強的控制能力。草甘膦特異性地抑制植物和細菌中莽草 酸羥基乙酰轉(zhuǎn)移酶（EPSPS)的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途徑中的一個酶，它可逆 地催化 S3P(shikimate_3-phosphate)和 PEP(phosphoenopyrate)縮合成 EPSP 和無機勝。 Monsanto公司將具有抗草甘膦除草劑能力的EPSPS基因轉(zhuǎn)入苜蓿草中，使其具有抗草甘膦 除草劑能力。
[0007] 目前，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因苜蓿草檢測策略大多采用檢測啟動子、終止子或EPSPS基因等 篩查檢測從而確定是否轉(zhuǎn)基因苜蓿草，但對于不同品系的轉(zhuǎn)基因苜蓿草不能進行鑒別性檢 測，無法滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品身份驗證等檢測、監(jiān)測和安全管理的需求。國內(nèi)尚無J163品系特 異性實時熒光PCR檢測方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因苜蓿草采用的篩查檢測技術(shù)不能準 確地檢測具體的轉(zhuǎn)基因品系的不足，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性實時熒光PCR 檢測用引物和探針，其具有高特異性和靈敏度及穩(wěn)定性，基于所述引物和探針，可成功建立 轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性實時熒光PCR檢測方法。
[0009] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性實時熒光 PCR檢測方法。
[0010] 本發(fā)明還一要解決的技術(shù)問題是提供所述檢測方法的應用。
[0011] 本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0012] 本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實驗研宄總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系的 5 '端外源插入片段P-eFMV與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列信息的分析， 設計得到一對特異性的引物，以及探針。并確定了精確地檢測步驟和條件，建立特異性強、 靈敏度高、穩(wěn)定性良好的轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性TaqMan實時熒光PCR檢測方法。
[0013] 具體地，提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性實時熒光PCR檢測用引物J163-1 和 J163-2,，其序列如 SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 2 所示：
[0014] SEQ ID NO. 1 :J163-1 :5 '-CGATTACCCCCTCCTACTTTTTTC-3 '。
[0015] SEQ ID NO. 2 :J163-2 :5 '-TTGGAGACTCTGTACCCTGACCTT-3 '。
[0016] 提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性實時熒光PCR檢測用探針J163-p，其序列 如 SEQ ID NO. 3 所示：
[0017] SEQ ID NO. 3 :J163-p:5 '-FAM-TTGGAGACTCTGTACCCTGACCTT - TAMRA-3 '。
[0018] 提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性實時熒光PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0019] S1.提取DNA作為反應的模板；
[0020] S2.采用所述引物J163-1和J163-2、所述的探針J163-P進行實時熒光PCR定性 和/或定量檢測；
[0021] 其中，S2所述實時熒光PCR檢測反應體系為20yL :Premix Ex Taq TM 10yL， lOymol/L 引物 J163-1 和 J163-2 各 0.4yL，R0X Reference Dye II 0.2yL，探針 J163-p 0? 6 y L，DNA 模板 1. 5 y L 和 ddH20 6. 9 y L ;
[0022] S2所述實時熒光PCR檢測反應程序為：Stage 1 :預變性95°C 30s ;Stage 2 : 95°〇58,60°〇348,40個循環(huán)，并收集熒光信號。
[0023] 優(yōu)選地，S1所述提取DNA的具體方法為：稱取100mg左右研磨成干粉的待測樣品， 使用DNA提取試劑盒并按照其操作說明書提取基因組DNA。提取的基因組DNA用微量分光 光度計nan 〇dr〇p2000c測定濃度，提取的DNA溶液在-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 優(yōu)選地，所述定量檢測的方法為：
[0025] S21.提取轉(zhuǎn)基因苜蓿J163基因組DNA進行梯度稀釋，分別加入J163品系特異性 引物J163-1和J163-2和探針J163-p，以及內(nèi)源基因acc引物和探針，進行擴增；
[0026] 所述內(nèi)源基因acc引物的序列如SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5所示；探針的序列 如 SEQIDNO.6所示：
[0027] SEQ ID NO. 4:acc-l:GATCAGTGAACTTCGCAAAGTAC；
[0028] SEQ ID NO. 5:acc-2:CAACGACGTGAACACTACAAC ;
[0029]探針為：SEQ ID NO. 6:acc-p:TGAATGCTCCTGTGATCTGCCCATGC。
[0030]S22.擴增后得到各稀釋濃度對應的Ct值，該Ct值與濃度的自然對數(shù)（lg)呈線性 關(guān)系，據(jù)此繪制J163標準曲線和acc標準曲線；
[0031] S23.提取待檢樣品的基因組DNA，加入本發(fā)明設計的品系特異性引物J163-1和 J163-2和探針J163-p，進行擴增，擴增后得到的Ct值，根據(jù)繪制J163的標準曲線，代入其 線性方程，可以得到樣品轉(zhuǎn)基因的基因