嗜肺軍團(tuán)菌Ⅰ型檢測(cè)試劑盒及嗜肺軍團(tuán)菌Ⅰ型檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于衛(wèi)生防預(yù)病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試 劑盒及嗜肺軍團(tuán)菌I型的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 軍團(tuán)病是近20年以來新發(fā)現(xiàn)的傳染病之一，并且該病已成為世界各國(guó)及我國(guó)普 遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。嗜肺軍團(tuán)菌是引起人類軍團(tuán)病的主要病原菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有14個(gè)血 清型，其中嗜肺軍團(tuán)菌I型是最常見的現(xiàn)感染型。嗜肺軍團(tuán)菌（legionella pneumophila) 為軍團(tuán)菌屬的短小球桿菌，又名退伍軍人桿菌。嗜肺軍團(tuán)菌可入侵變形蟲，或是人類的巨噬 細(xì)胞內(nèi)。主要存在于溫暖潮濕的自然環(huán)境，也廣泛分布于人工供水系統(tǒng)中。其專性需氧，在 自然界可長(zhǎng)期存活，如在蒸餾水中可存活1〇〇天以上，污水中可存活一年，對(duì)熱和一般消毒 劑敏感。人們通常是由于呼吸了被軍團(tuán)桿菌污染的水源散發(fā)的水霧而感染。輕微感染者會(huì) 出現(xiàn)發(fā)燒和肌肉痛等癥狀，嚴(yán)重感染者甚至可能引發(fā)肺炎。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)外的軍團(tuán)菌檢測(cè)方法主要依據(jù)IS011731-1:1998 ; ISO 11731-2 : 2004 (E)、《軍團(tuán)菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)》及《公共場(chǎng)所集空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生管理辦法》。定性測(cè)試 兩種方法的檢測(cè)步驟大致相同，基本包括以下步驟：
[0004] (1)采樣及運(yùn)送：
[0005] 采樣容器可為無菌玻璃瓶，聚乙烯瓶或無菌采樣袋，并且瓶口或袋口能密封；采 樣量一般在300-400ml左右，如果經(jīng)過氯或臭氧消毒的水，采樣后加入少量硫代硫酸鈉溶 液，以中和樣品中的氧化物；采樣至送達(dá)實(shí)驗(yàn)室最長(zhǎng)時(shí)間不得超過2天。
[0006] (2)樣品處理：
[0007] 對(duì)含少量軍團(tuán)菌的樣品一般用薄膜過濾法來濃縮樣品的濃度，如有雜質(zhì)的樣品可 靜置沉淀或離心過濾去除，并對(duì)樣品進(jìn)行熱處理和酸處理以減少非軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)。
[0008] (3)接種和培養(yǎng)：
[0009] 軍團(tuán)桿菌在分類學(xué)上是一種獨(dú)特的需氧革蘭氏陰性桿菌，無莢膜，在普通培養(yǎng)基 上不生長(zhǎng)，屬于細(xì)胞內(nèi)寄生菌。目前標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基為活性碳酵母浸膏瓊脂平板，也稱軍團(tuán)菌生 長(zhǎng)平板（BCYE)。接種在BCYE平板上的樣品在溫度為35-37°C，培養(yǎng)10天，在濃度為2. 5% 〇)2的環(huán)境下培養(yǎng)更有利于軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)。軍團(tuán)菌的菌落通常呈白色、灰色、有熒光。
[0010] ⑷軍團(tuán)菌的鑒定：
[0011] 挑取至少3個(gè)疑似軍團(tuán)菌的菌落接種至軍團(tuán)菌生長(zhǎng)BCYE平板和半光氨酸缺失的 BCYE-Cys平板，在35-37°C條件下培養(yǎng)至少5天，凡是在BCYE平板上生長(zhǎng)而在平板和半光 氨酸缺失BCYE-Cys平板上不生長(zhǎng)，并且血清學(xué)陽性的的則判為軍團(tuán)菌。
[0012] 根據(jù)上述目前的檢測(cè)方法，檢測(cè)樣品中軍團(tuán)菌的周期過長(zhǎng)（至少15天以上）、操作 煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復(fù)雜和所需試劑繁多、挑取疑似軍團(tuán)菌菌落的失誤性高等缺 點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足快速檢測(cè)的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑 盒和嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)方法。旨在解決現(xiàn)有嗜肺軍團(tuán)菌I型周期長(zhǎng)、靈敏的低等技術(shù)問 題。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0015] 一種嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑盒，包含PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包含彼此被分 開的第一反應(yīng)液、含有酶的第二反應(yīng)液，所述第一反應(yīng)液包含用于熒光定量PCR的嗜肺軍 團(tuán)菌I型靶基因的引物探針。
[0016] 一種嗜肺軍團(tuán)菌I型的檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0017] 提取待測(cè)樣本DNA;
[0018] 以所述提取待測(cè)樣本DNA為模板，采用如上述的嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行 PCR反應(yīng)后收集熒光數(shù)據(jù)；
[0019] 將熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較判斷。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)異技術(shù)效果：
[0021] 上述嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑盒能將含有嗜肺軍團(tuán)菌I型靶基因的引物探針的 第一反應(yīng)液與含有酶的第二反應(yīng)液在檢測(cè)時(shí)直接混合進(jìn)行PCR反應(yīng)，能快速的檢測(cè)嗜肺軍 團(tuán)菌I型，且能避免污染，靈敏度高，有效避免了傳統(tǒng)檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌I型的周期長(zhǎng)，易污 染且靈敏度低的不足。
[0022] 上述嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)方法利用上述嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒 光PCR反應(yīng)，顯著縮短了嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)的時(shí)間和檢測(cè)質(zhì)量，克服了目前傳統(tǒng)嗜肺軍 團(tuán)菌I型檢測(cè)方法存在的不足，彌補(bǔ)了目前應(yīng)急應(yīng)對(duì)預(yù)防和控制傳染病毒感染癥候病因?qū)W 確認(rèn)等領(lǐng)域存在的缺陷和不足，具有重要的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)推廣意義。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例使用的Ct值的示意性說明，其中所述的閾值線對(duì)應(yīng)于特定探 針；
[0024] 圖2為使用本發(fā)明實(shí)施例嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)方法流程圖；
[0025] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑盒中陽性對(duì)照PCR擴(kuò)增圖；
[0026] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑盒中陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增圖；
[0027] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)4份樣品采用本發(fā)明實(shí)施例嗜肺軍團(tuán)菌I型檢測(cè)試劑 盒熒光定量PCR擴(kuò)增圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0029] 與本發(fā)明相關(guān)關(guān)鍵詞的解釋：
[0030] Tris :三異丙基乙磺酰
[0031] EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
[0032] dNTP :deoxy_ribonucleoside triphosphate,脫氧核糖核苷三憐酸
[0033] FAM:Carboxyfluorescein,竣基突光素。
[0034] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR):是體外酶促合成特異DNA 片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循 環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。
[0035] 實(shí)時(shí)熒光PCR法：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)