專利名稱：用于快速檢測嗜肺軍團(tuán)菌的組合物和方法
用于快速檢測嗜肺軍團(tuán)菌的組合物和方法領(lǐng)域本申請涉及用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)的組合物和方法,并且更具體地涉及用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA靶序列的組合物和方法。背景嗜肺軍團(tuán)菌在人類中引起軍團(tuán)菌病和龐蒂亞克熱。性質(zhì)上它可以是社區(qū)獲得性的或醫(yī)院的，以及偶發(fā)性的或流行性的。其死亡率在無免疫應(yīng)答的患者中可接近50%。已知軍團(tuán)菌屬細(xì)菌也存留在諸如蓄水池的潮濕環(huán)境中，潮濕環(huán)境有利于通過諸如冷卻塔或飲用水分配系統(tǒng)的感染源傳播疾病。已描述了一些檢測軍團(tuán)菌屬細(xì)菌的方法。識(shí)別水樣中嗜肺軍團(tuán)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”程序是分離培養(yǎng)[10]。使用專門的緩沖炭酵母提取物(BCYE)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌是靈敏的和準(zhǔn) 確的，但需要大約兩周以最大限度的恢復(fù)，然后用菌落形態(tài)、革蘭氏染色和血清學(xué)檢測相結(jié)合鑒定細(xì)菌[11-13]。為了克服這些限制，已經(jīng)開發(fā)了利用PCR的免疫熒光方法[14-17]和分子學(xué)方法[18-26]?；赑CR的方法主要靶向嗜肺軍團(tuán)菌的5S、16S和23S rRNA基因，以及巨卩遼細(xì)胞感染性增強(qiáng)蛋白(macrophage infectivity potentiator,mip)基因[1-9,25,26，]。已描述了實(shí)時(shí)PCR方法用于快速檢測軍團(tuán)菌[27-31]。雖然靶向嗜肺軍團(tuán)菌mip基因的DNA的市售實(shí)時(shí)PCR試劑盒可得到，但是基于軍團(tuán)菌DNA檢測的測定可能導(dǎo)致假陽性，因?yàn)樵谝欢l件下細(xì)菌死亡后DNA不會(huì)像RNA —樣很快降解。因此，需要用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌的新的組合物和方法。發(fā)明概述本公開內(nèi)容提供可用于檢測樣品中嗜肺軍團(tuán)菌且靶向23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的組合物以及方法。本公開內(nèi)容提供可用于分離嗜肺軍團(tuán)菌核酸的捕獲探針，以及可用于擴(kuò)增靶序列的PCR引物，以及選擇性結(jié)合靶序列并促進(jìn)檢測靶序列的檢測探針。還提供了使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(rPCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-rPCR)檢測嗜肺軍團(tuán)菌的方法。任選地，使用實(shí)時(shí)PCR定量樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的量。本文所公開的核酸分子和方法對嗜肺軍團(tuán)菌的23S rRNA或編碼23SrRNA的DNA有選擇性。如實(shí)施例2中所示，擴(kuò)增引物和檢測探針對非軍團(tuán)菌的微生物以及對非嗜肺軍團(tuán)菌的物種具有選擇性。此外，如實(shí)施例3中所示，利用靶向23S rRNA的引物和檢測探針，RT-rPCR容易地?cái)U(kuò)增了有相似靈敏度的所有15個(gè)嗜肺軍團(tuán)菌血清群。本文所述的檢測方法比通常需要兩周培育并識(shí)別軍團(tuán)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)方法明顯更快。此外，本發(fā)明方法一般比依賴于免疫熒光或放射免疫測定的方法更為準(zhǔn)確和靈敏。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的核酸分子，其包含與SEQ IDNO :1-15中任何一個(gè)具有至少85%同一'丨生的序列或其互補(bǔ)物(complement)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子包含與SEQ ID NO :1-15中任何一個(gè)具有至少90%、95%或99%同一性的序列或其互補(bǔ)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子與嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA雜父。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含核酸分子和親和標(biāo)記的捕獲探針，所述核酸分子包含與SEQ ID NO 1-6中任何一個(gè)具有至少85%同一性的序列或其互補(bǔ)物。任選地，所述核酸分子包含與SEQ ID NO :1-6中任何一個(gè)具有至少90%、95%或99%同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親和標(biāo)記是生物素。任選地，所述親和標(biāo)記綴合到所述核酸分子的5’ 端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親和標(biāo)記通過間隔分子(例如核酸)綴合到所述核酸分子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供適于擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23SrRNA的DNA的引物，所述引物包含選自SEQ ID N0:l、7、12和13的某一序列。還提供了包含正向引物和反向引物的引物組，所述引物組適于擴(kuò)增23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA靶序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物組包括包含與SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO :7具有至少85%同一性的第二引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物組包括包含與SEQ ID NO :12具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO: 13具有至少85%同一性的第二引物。
另一個(gè)實(shí)施方案包含使用本文所述的引物組，通過PCR擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA 或編碼23S rRNA的DNA而產(chǎn)生的分離的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO :1和7的序列，而且通過PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的所述分離的核酸分子包含SEQ ID N0:17的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO :12和13的序列，而且通過PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO: 16的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供檢測探針，其包括a)核酸分子，其包含與SEQ ID NO :8、9、10、11、14和15中任何一個(gè)具有至少85%同一性的序列或其互補(bǔ)物，和b)可檢測的標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述檢測探針與包含23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶序列雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測探針與通過用本文所述引物組之一的PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的核酸分子雜交。所述可檢測的標(biāo)記可以是熒光團(tuán)或產(chǎn)生可檢測信號的其他標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測探針包含通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或接觸猝滅而與熒光團(tuán)相互作用的猝滅劑。任選地，熒光團(tuán)連接到所述核酸分子的5’端，而猝滅劑連接到所述核酸分子的3’ 端，所述檢測探針適用于實(shí)時(shí)PCR。
本公開內(nèi)容還提供了可用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含本文所述引物組的至少一個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含檢測嗜肺軍團(tuán)菌的說明書。任選地，所述試劑盒包含本文所述的一個(gè)或多個(gè)檢測探針或捕獲探針。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供用于檢測樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的存在情況的方法，其包括
a)提供疑似含有靶核酸的樣品，所述靶核酸含有嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA 的 DNA ；
b)將所述樣品與引物組接觸，所述引物組包括
i)包含與SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO: 7具有至少85%同一性的第二引物，或
ii)包含與SEQ ID NO :12具有至少85%同一性的第一引物，以及包含與SEQ ID NO :13具有至少85%同一性的第二引物；
c)用所述第一引物和第二引物擴(kuò)增所述靶核酸以產(chǎn)生靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物；和
d)檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況，其中所述靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況表示樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的存在情況。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增所述靶核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括用逆轉(zhuǎn)錄酶接觸所述樣品以產(chǎn)生編碼23SrRNA的DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼23S rRNA的DNA是cDNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，引物用于引導(dǎo)23S rRNA的逆轉(zhuǎn)錄， 所述引物包括選自SEQ ID N0:l、13、7和12的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法使用實(shí)時(shí)PCR。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用實(shí)時(shí)PCR檢測靶核酸產(chǎn)物的存在情況。任選地，同時(shí)用所述靶的擴(kuò)增來檢測靶核酸產(chǎn)物。
在一些實(shí)施方案中，通過用本文所述的一個(gè)或多個(gè)檢測探針接觸靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物而檢測靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測探針標(biāo)記有熒光團(tuán)，且用于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)以檢測樣品中靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法包括涉及樣品制備的步驟。例如，在一些實(shí)施方案中，處理樣品以將樣品中的核酸與其他組分分離或分開。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括
將樣品與一個(gè)或多個(gè)捕獲探針混合；和
分離結(jié)合到所述捕獲探針的核酸序列以提供含有嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶核酸的樣品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針包括核酸分子，所述核酸分子包含與選自SEQ ID NO 1-6的序列或其互補(bǔ)物具有至少85%同一性。
附圖
簡述
現(xiàn)在將用附圖來描述本發(fā)明，其中
圖I提供了根據(jù)實(shí)施例I通過RT-rPCR用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2是柱狀圖，其顯示了實(shí)施例3中所述檢測方法對嗜肺軍團(tuán)菌血清群1-15的靈敏度。
圖3顯示了對實(shí)施例4中所述的組I和組2的RT-rPCR引物/探針組的靈敏度。
發(fā)明詳述
本說明書提供用于檢測軍團(tuán)菌屬細(xì)菌(特別是嗜肺軍團(tuán)菌)的組合物和方法，本說明書還提供了分離的核酸分子，其可用于檢測包含嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA 的DNA的靶序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼23S rRNA的DNA被逆轉(zhuǎn)錄成23S rRNA。
在一個(gè)方面，本文所述的方法包括通過檢測23S rRNA靶核酸序列來檢測樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的存在情況。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括分離、擴(kuò)增和/或檢測包含23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用實(shí)時(shí)PCR (rPCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶實(shí)時(shí)PCR (RT-rPCR)檢測靶序列。
在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供分離的核酸分子，其與包含23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶序列雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包含與SEQ ID NO: 1-15中任何一個(gè)具有至少85%同一性的序列或其互補(bǔ)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包含與SEQ ID NO :1-15中任何一個(gè)具有至少90%、95%或99%同一性的序列或其互補(bǔ)物。
如本文所用，術(shù)語“分離的核酸分子”是指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)的基本上不含細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基的核酸、或化學(xué)前體、或化學(xué)合成時(shí)的其他化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語“核酸”是指包括DNA和RNA，并且可以是雙鏈或單鏈。
本文所用的術(shù)語“同一性”是指兩個(gè)核酸序列之間的序列同一性的百分比。為了確定兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，比對序列以獲得最佳比較目的(例如，可在第一核酸序列的序列中引入空位以與第二核酸序列最佳比對)。然后，比較相應(yīng)核苷酸位置上的核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽坏诙蛄兄邢鄳?yīng)位置上的相同核苷酸占據(jù)時(shí)，那么這兩個(gè)分子在該位置上是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=相同重疊位置的數(shù)目/位置的總數(shù)X100%)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的長度是相同的。兩個(gè)序列之間的同一性百分比的確定也可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的、非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul 1990，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87 =2264-2268 的算法，在 Karlin 和 Altschul, 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 :5873_5877 中改良過。這樣的算法被并入 Altschul 等， 1990，J. Mol. Biol. 215 403 的 NBLAST 和 XBLAST 程序中。BLAST 核苷酸檢索可用 NBLAST 核苷酸程序參數(shù)集進(jìn)行，例如，用分?jǐn)?shù)=100，字長=12而獲得與本申請的核酸分子同源的核苷酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可使用Altschul等，1997, Nucleic Acids Res. 25 =3389-3402中所描述的空位BLAST。當(dāng)運(yùn)行這些程序時(shí)，可使用各自程序(例如， NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)(參見例如NCBI網(wǎng)站)。兩個(gè)序列之間的同一性百分比可以使用與如上所述的那些技術(shù)類似的技術(shù)來確定，允許有空位或不允許有空位。在計(jì)算同一性百分比中，通常只計(jì)算精確的匹配。
本文所用的“雜交”是指互補(bǔ)核酸分子中的堿基對之間非共價(jià)鍵的形成。雜交和雜交強(qiáng)度(即，核酸之間的締合強(qiáng)度)受到諸如核酸分子之間的互補(bǔ)程度、所涉及條件的嚴(yán)謹(jǐn)性、以及所形成雜交物的解鏈溫度等因素的影響。
本文所用的“嚴(yán)謹(jǐn)性”是指這樣的條件例如溫度、離子強(qiáng)度、pH和其他化合物的存在，在此條件下進(jìn)行核酸雜交。在高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下，核酸堿基配對將只出現(xiàn)在具有高頻率的互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間。在低嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下，核酸堿基配對將出現(xiàn)在具有較低頻率的互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間。
例如，可以采用以下條件來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)性雜交在5X氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)/5XDenhardt’ s溶液/I. O % SDS中、Tm-5 °C的溫度下雜交15分鐘，然后在 0.2XSSC/0. 1% SDS中、60°C下洗滌。然而應(yīng)理解的是，用替代的緩沖液、鹽和溫度也可實(shí)現(xiàn)等效的嚴(yán)謹(jǐn)性。本公開內(nèi)容還考慮根據(jù)所需的核酸分子之間雜交嚴(yán)謹(jǐn)性改變雜交條件。關(guān)于雜交條件的額外指導(dǎo)可參見Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. , 1989,6. 3. 1-6. 3. 6 和 Sambrook 等，Molecular Cloning, a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3。
樣品的制備
本文所用的“樣品”是指疑似含有嗜肺軍團(tuán)菌或來源于嗜肺軍團(tuán)菌的核酸的任何生物或環(huán)境樣品。環(huán)境樣品的實(shí)例包括，但不限于，水樣、土壤、泥漿、碎片、生物膜、來自含水流體的容器中的樣品、空氣中的顆粒或懸浮微粒等。生物樣品的實(shí)例包括，但不限于， 來源于活的或死的生物體(包括人)的任何組織或材料，例如呼吸組織、滲出物、肺切片 (biopsy)、支氣管肺泡灌洗液、鼻拭子、痰、血液(例如,全血、血清、血漿等)、尿、滑膜液、腦脊液等。本文所用的術(shù)語“樣品”包括處理過的樣品，例如如下得到的樣品使樣品通過或穿過一個(gè)或多個(gè)濾器，通過離心，或處理或洗滌樣品例如通過使樣品組分選擇性粘附至培養(yǎng)基、基質(zhì)或支持物上。
樣品可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的任何數(shù)量的制備、處理或濃縮步驟進(jìn)行處理，以去除污染物或濃縮疑似含有嗜肺軍團(tuán)菌的微生物或細(xì)菌。例如，可如下處理樣品通過過濾濃縮來自較大樣品體積的組分，或來自基本上含水的混合物，或捕集來自空氣樣品的空氣中的顆?；騺碜运畼拥奈⑸?。
在一些實(shí)施方案中，疑似含有軍團(tuán)菌細(xì)胞的樣品經(jīng)處理以暴露其中所含的核酸。 例如，可以處理樣品，以裂解樣品中的細(xì)胞并釋放包括核酸的胞內(nèi)組分。在一些實(shí)施方案中，樣品是溶液，并且可以包括其它組分，例如酶、緩沖液、鹽、洗滌劑等。
在一些實(shí)施方案中，樣品中的細(xì)胞可以使用非機(jī)械方法或機(jī)械方法通過破碎細(xì)胞而裂解。非機(jī)械方法包括，但不限于，化學(xué)法、熱法和酶促法。機(jī)械方法包括使用均質(zhì)器的超聲波破碎，或弗氏壓碎器、減壓、和粉碎。本發(fā)明也可考慮本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的裂解細(xì)胞的其它方法。
分離核酸和靶捕獲
在一些實(shí)施方案中，本文所述的方法包括將核酸與其他樣品組分分離，然后檢測包含嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶核酸。任選地，所述核酸使用特異性和/或非特異性方法分離。
非特異性的靶捕獲方法通常包括將樣品中所含的核酸與其他樣品組分(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和/或細(xì)胞碎片)分離或分開。非特異性靶捕獲的例子包括從含有其它組分的樣品混合物中，選擇性沉淀核酸、將核酸粘附到支持物上以及洗滌以除去其他樣品組分，或利用其他手段以物理方式分離核酸(包括軍團(tuán)菌核酸)。另外的非特異性靶捕獲方法可以通過使用捕獲單鏈RNA序列的隨機(jī)寡核苷酸探針而將樣品中RNA(包括軍團(tuán)菌16SrRNA或 23SrRNA)與 DNA 分離。
表I嗜肺軍團(tuán)菌的捕獲探針
SEQID NO.序列Ittcccatcgactacgctctt2tcctgcacatggctagat3ttcacccgagttctctca4uucccauogacuacgcucuu5uccugcacauggcuagau6uucacccgaguucucuca
*所有序列以5’到3’的方式呈現(xiàn)
捕獲探針和特定靶捕獲方法
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過軍團(tuán)菌核酸特異性雜交到捕獲探針以形成靶核酸捕獲探針復(fù)合物而從其他樣品組分中分離軍團(tuán)菌rRNA或編碼rRNA的DNA。
本公開內(nèi)容提供了適用于雜交到包含23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶嗜肺軍團(tuán)菌序列的捕獲探針的核酸分子。如本文所用，術(shù)語“捕獲探針”是指組合物 (composition),該組合物包括至少一個(gè)選擇性雜交到互補(bǔ)祀序列的核酸序列。捕獲探針可如下用于分離樣品中的靶序列將樣品中所含有的核酸與捕獲探針雜交以形成靶核酸/捕獲探針復(fù)合物，然后其可與其他樣品組分分開或分離。任選地，在使用本文所述組合物和方法檢測嗜肺軍團(tuán)菌之前，所述捕獲探針可以用于制備樣品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針包含核酸分子，該核酸分子包含與表I中所不任一個(gè)核酸序列或其互補(bǔ)物具有至少85%同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕獲探針包含與表I中所示任一個(gè)核酸序列或其互補(bǔ)物具有至少90%、95%或99%同一性的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述捕獲探針選擇性雜交到軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針包括捕獲標(biāo)簽。如本文所用的“捕獲標(biāo)簽”是指特異性結(jié)合至相應(yīng)的結(jié)合配偶體(partner)、并允許分開或分離祀核酸/捕獲探針復(fù)合物的部分。捕獲標(biāo)簽可以通過共價(jià)鍵或通過非共價(jià)相互作用(例如氫鍵、疏水或離子相互作用或形成螯合物或配位絡(luò)合物)連接到捕獲探針的核酸序列上。捕獲標(biāo)簽也可以直接或間接地連接到捕獲探針的核酸序列上。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中間隔分子將捕獲標(biāo)簽和核酸序列分開。在另外的實(shí)施方案中，間隔分子是與軍團(tuán)菌靶序列不互補(bǔ)的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸間隔序列是基本上均聚的10-40nt的序列(例如，A10-A40)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)簽包括生物素并且相應(yīng)的結(jié)合配偶體為抗生物素蛋白 /鏈霉親和素。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針的捕獲標(biāo)簽是5'生物素尾連同與軍團(tuán)菌核酸不互補(bǔ)的核苷酸間隔序列?！?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體固定在諸如基質(zhì)或顆粒的支持物上，這有利于靶核酸捕獲探針復(fù)合物的分離。如本文所用的“分離”是指從樣品中去除或分離組分以獲得含有靶核酸分子的樣品。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，從其他樣品組分例如蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片、 酶、緩沖液等中分離靶核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸捕獲探針復(fù)合物結(jié)合到支持物上， 然后用洗滌緩沖液洗滌支持物以去除樣品組分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲標(biāo)簽的結(jié)合配偶體固定在或綴合到支持基質(zhì)上或固定在或綴合到游離于溶液中的顆粒上。支持基質(zhì)或顆?？梢杂杀绢I(lǐng)域中已知的材料制成，所述材料包括，但不限于，硝化纖維、尼龍、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯和/或金屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體固定在或綴合到吸磁顆粒上。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針是生物素化的捕獲探針，其與靶序列雜交，并結(jié)合到存在于均勻的單分散磁性球上的抗生物素蛋白或鏈霉親和素鍵。
正如在實(shí)施例I所示，在檢測特定靶序列之前，本文所述的捕獲探針可用于從樣品中分離靶核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶捕獲發(fā)生在溶液相混合物，所述混合物包含在雜交條件下雜交到軍團(tuán)菌23S rRNA靶核酸的捕獲探針。隨后使靶核酸捕獲探針復(fù)合物與包含捕獲標(biāo)簽的結(jié)合配偶體的支持物接觸，從而將靶核酸捕獲探針復(fù)合物固定到支持物上。在一個(gè)實(shí)施方案中，然后洗滌支持物以從該樣品中除去其他組分，而并不使靶核酸從從捕獲探針上解離或使捕獲探針從特異性結(jié)合配偶體(其已綴合或固定到支持物)上解離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，改變雜交條件，將改變捕獲探針和靶序列之間結(jié)合的特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲雜交在SCC緩沖液中在65°C進(jìn)行10分鐘，隨后用O.IXSSC緩沖液洗滌。在一個(gè)實(shí)施方案中，捕捉探針和靶序列之間的雜交條件包括在捕獲探針的Tm和捕獲探針的Tm之上的15°C范圍內(nèi)的溫度。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲探針的Tm為大約60°C，雜交溫度為60°C -75°C。
在一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸捕獲探針復(fù)合物與擴(kuò)增試劑、引物和/或用于擴(kuò)增和 /或檢測靶序列的檢測探針直接混合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶核酸捕獲探針復(fù)合物被解離以從復(fù)合物中釋放靶核酸。 例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在高于在緩沖溶液中的捕獲序列的Tm的溫度下使復(fù)合物變性而從捕獲探針移除靶核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖溶液是低離子強(qiáng)度溶液，例如去離子水。
擴(kuò)增引物
在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供引物，其可用于擴(kuò)增含有嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA或編碼23S rRNA的DNA的靶序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，引物包括選自如表2中所示的SEQ ID NO :1、7、12和13的核酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了引物組，其適合擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌的23SrRNA或編碼23S rRNA的DNA。如本文所用的術(shù)語“引物組”是指兩個(gè)或更多個(gè)引物，所述引物合作以在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生核酸產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，引物組包括包含與SEQ ID NO :1有至少85% 同一性的第一引物，和包含與SEQ ID NO :7有至少85%同一性的第二引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，引物組包括包含與SEQ ID NO :12有至少85%同一性的第 一引物，和包含與SEQ ID NO :13有至少85%同一性的第二引物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，利用包含第一引物(其含有SEQ ID NO 12的序列)和第二引物(其含有SEQ ID N0:13的序列)的引物組的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增產(chǎn)生了包括以下序列的186個(gè)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物
GATAGGTGGGAGGCTGTGAAGTGAGGACGCTAGTTCTCATGGAGCCGCCCTT
GAAATACCACCCTGTTGTTATTGAGGTTCTAACTTGGTCCAGTAATCCTGGA
TGAGGACAGTGTATGATGGGTAGTTTGACTGGGGCGGTCTCCTCCCAAAGAG
TAACGGAGGAGCACAAAGGTACCCTCGGTA(SEQ ID NO 16)
另一個(gè)實(shí)施方案中，用包含第一引物(其含有SEQ ID NO 7的序列)和第二引物 (其含有SEQ ID N0:1的序列)的引物組擴(kuò)增產(chǎn)生了包括以下序列的167個(gè)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物
GCATTGAGAAGTGTGCTGGAGGTATCAGAAGTGCGAATGCTGACATGAGTAA
CGATAATGTGGGTGAAAAGCCCACACGCCGGAAGTCCCAGGTTTCCTGCACG
ACGTTAATCGGAGCAGGGTGAGTCGGCCCCTAAGGCGAGGCTGAAGAGCGTA
GTCGATGGGAA(SEQ ID NO: 17)
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的引物可用于逆轉(zhuǎn)錄23S rRNA以生成編碼23S rRNA 的靶序列的cDNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物可用于23S rRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物可用于使用RNA擴(kuò)增方法(例如RT-PCR)擴(kuò)增23S rRNA或使用DNA擴(kuò)增方法(例如PCR)擴(kuò)增23S核糖體DNA(rDNA)。本公開內(nèi)容還考慮本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的使用本文所述引物擴(kuò)增核酸的其他方法，例如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP。
表2用于嗜肺軍團(tuán)菌23S rRNA的擴(kuò)增引物和檢測探針*
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含與SEQID NO :1-15中任何一個(gè)具有至少85%同一性的序列或其互補(bǔ)物。
2.權(quán)利要求I的分離的核酸分子，其包含與SEQID NO :1-15中任何一個(gè)具有至少90%、95%或99%同一性的序列或其互補(bǔ)物。
3.權(quán)利要求I的分離的核酸分子，其中所述核酸分子與嗜肺軍團(tuán)菌23SrRNA或編碼23S rRNA 的 DNA 雜交。
4.捕獲探針,包括 a)核酸分子，其包含與SEQID NO :1-6中任何一個(gè)具有至少85%同一性的序列或其互補(bǔ)物，和 b)親和標(biāo)記。
5.權(quán)利要求4的捕獲探針，其中所述親和標(biāo)記包括生物素。
6.權(quán)利要求4的捕獲探針，其中所述親和標(biāo)記通過間隔核酸綴合到所述核酸分子的5’端。
7.適于嗜肺軍團(tuán)菌23SrRNA或編碼23S rRNA的DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的引物，其包含選自SEQ ID ΝΟ:1、7、12、和13中任一個(gè)序列。
8.適于擴(kuò)增23SrRNA或編碼23S rRNA的DNA的引物組，其包含 i)包含與SEQID NO :1具有至少85%同一性的正向引物，以及包含與SEQ ID NO:7具有至少85%同一性的反向引物，或 ii)包含與SEQID NO :12具有至少85%同一性的正向引物，以及包含與SEQ ID NO:13具有至少85%同一性的反向引物。
9.分離的核酸分子，其通過利用權(quán)利要求7的引物組之一，PCR擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌23SrRNA或編碼23S rRNA的DNA而產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求9的分離的核酸分子，其包含與SEQID NO:16或SEQID NO:17序列具有至少85%同一性的序列。
11.檢測探針，其包括 a)核酸分子，其包含與SEQID NO :8、9、10、11、14、或15中任何一個(gè)具有至少85%同一性的序列或其互補(bǔ)物，和 b)可檢測的標(biāo)記。
12.權(quán)利要求11的檢測探針，其中所述探針與權(quán)利要求9或10的分離的核酸分子雜交。
13.權(quán)利要求11的檢測探針，其中所述可檢測的標(biāo)記包括熒光團(tuán)。
14.權(quán)利要求13的檢測探針，還包括通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)與熒光團(tuán)相互作用的猝滅劑。
15.權(quán)利要求14的檢測探針，其用于實(shí)時(shí)PCR，其中所述熒光團(tuán)連接于所述核酸分子的5’端，以及所述猝滅劑連接于所述核酸分子的3’端。
16.用于檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒，其包含權(quán)利要求8的引物組之一及其使用說明書。
17.權(quán)利要求16的試劑盒,還包括權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)檢測探針。
18.權(quán)利要求16或17的試劑盒,還包括權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)捕獲探針。
19.用于檢測樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的存在情況的方法，其包括 a)提供疑似含有靶核酸的樣品，所述靶核酸含有嗜肺軍團(tuán)菌23SrRNA或編碼23SrRNA 的 DNA ； b)將所述樣品與引物組接觸，所述引物組含有 i)包含與SEQID NO :1具有至少85%同一性的正向引物，以及包含與SEQ ID N0:7具有至少85%同一性的反向引物，或 ii)包含與SEQID NO :12具有至少85%同一性的正向引物，以及包含與SEQ ID NO:13具有至少85%同一性的反向引物； c)用所述正向引物和反向引物擴(kuò)增所述靶核酸以產(chǎn)生靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物； d)檢測所述靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況，其中所述靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況表明樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的存在情況。
20.權(quán)利要求19的方法，其中在步驟c)中使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所述靶核酸。
21.權(quán)利要求19的方法，還包括在擴(kuò)增所述靶核酸之前，將所述樣品與逆轉(zhuǎn)錄酶接觸以產(chǎn)生編碼23S rRNA的cDNA。
22.權(quán)利要求19的方法，其中用實(shí)時(shí)PCR檢測步驟d)中靶核酸產(chǎn)物的存在情況。
23.權(quán)利要求19的方法，其中步驟d)還包括將所述靶核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)檢測探針接觸。
24.權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)還包括 i.將所述樣品與權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)捕獲探針混合，以及； ii.分離結(jié)合到所述捕獲探針的核酸序列以提供含有嗜肺軍團(tuán)菌23SrRNA或編碼23SrRNA的DNA靶核酸的樣品。
全文摘要
本申請描述了可用于快速檢測嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)的組合物和方法。所述組合物包括捕獲探針、擴(kuò)增引物、引物組以及檢測探針，所述檢測探針包含與嗜肺軍團(tuán)菌23SrRNA或編碼23S rRNA的DNA靶序列雜交的核酸分子。還描述了使用實(shí)時(shí)PCT rPCR或逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR(RT-rPCR)檢測和/或定量樣品中嗜肺軍團(tuán)菌的量的方法。
文檔編號C12Q1/04GK102939378SQ201080065801
公開日2013年2月20日 申請日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者J·羅, 蔡宏, 陳靜 申請人:通用電氣公司