專利名稱：一種嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)的試劑盒，特別是飲用水供水系統(tǒng)中嗜肺軍團(tuán)菌的快 速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
飲用水供水系統(tǒng)中的嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)方法主要有以下幾類一是基于細(xì)菌培養(yǎng) 的形態(tài)學(xué)與生化鑒定檢測(cè)技術(shù)，以國(guó)標(biāo)GB/T4789. 7-2003為代表；二是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)， 包括血清特異抗體檢測(cè)法、尿抗原檢測(cè)法等；三是分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，包括核酸探針及 PCR檢測(cè)技術(shù)(劉廣華等，軍團(tuán)菌的實(shí)驗(yàn)診斷方法及其研究進(jìn)展.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)[J]， 2006(10) :427-429;林云萬(wàn)，嗜肺軍團(tuán)菌分子生物學(xué)檢測(cè)及流行病學(xué)分型方法.熱帶醫(yī)學(xué) 雜志[J]，2009 (9) :840-842)。其中第一類方法因基于對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的直接分離培養(yǎng)，存在 所需時(shí)間較長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，培養(yǎng)基的配置復(fù)雜，價(jià)格昂貴等不利因素；而免疫學(xué)方法要求待 檢樣品中軍團(tuán)菌含量高，有的敏感性不高，且對(duì)試劑及操作經(jīng)驗(yàn)要求較高等問(wèn)題；近年來(lái)分 子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)不需要對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，越來(lái)越引起重視，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 技術(shù)可直接取樣品用于基因檢測(cè)，在檢測(cè)的快速性、安全性、準(zhǔn)確性、靈敏性等方面均有優(yōu) 勢(shì)，成為嗜肺軍團(tuán)菌快速檢測(cè)的重要方法。分子生物學(xué)檢測(cè)是通過(guò)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因、5S rRNA基因、23S rRNA與5S rRNA基因間隔序列、巨噬細(xì)胞感染力增強(qiáng)因子基因(mip)來(lái)達(dá)到放大目的基因拷貝數(shù)，檢 測(cè)目的菌的目的。其中針對(duì)各種rRNA基因的擴(kuò)增主要是用于軍團(tuán)菌屬(Legionella)的檢 測(cè)，而針對(duì)mip基因的擴(kuò)增則用于嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)的檢測(cè)，mip基因 的表達(dá)產(chǎn)物是巨噬細(xì)胞感染力增強(qiáng)因子，它是一種分子量在M_27kD的外膜蛋白，在嗜肺 軍團(tuán)菌的感染過(guò)程中起重要作用，可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的攝入，破壞細(xì)胞的殺菌作用。 存在于嗜肺軍團(tuán)菌各菌株中的mip基因有較高的同源性(一般> 98% )，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)在 一些非嗜肺軍團(tuán)菌中，如阿尼沙軍團(tuán)菌(Legionella anisa)、鏈球菌(Streptococcus)、麥 氏塔特洛克菌(Tatlockia micdadei)等中也存在mip基因，但與嗜肺軍團(tuán)菌的mip基因同 源性相對(duì)較低。但PCR技術(shù)在軍團(tuán)菌檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用中存在以下問(wèn)題(1)常規(guī)操作繁瑣，尤其是 擴(kuò)增模板的制備方法較繁瑣；( 特異性不夠高，對(duì)相近菌屬的檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性；(3)常 規(guī)檢測(cè)時(shí)間與快速免疫學(xué)檢測(cè)方法相比沒有優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)時(shí)間需要4小時(shí)以上。飲用水供水系統(tǒng)中嗜肺軍團(tuán)菌的大量存在對(duì)飲用者的身體健康有極大的危害，因 此快速有效的檢出方法對(duì)預(yù)防上述危害的發(fā)生就十分必要。由于飲用水供水系統(tǒng)中存在的 嗜肺軍團(tuán)菌數(shù)量相對(duì)較低，不易檢出，因此簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法具有重要的實(shí)際意 義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
一種嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有如下引物
外引物Primer F2 5' TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC 3' Primer R2 :5’ TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA 3’
內(nèi)引物
Primer Fl :5’ TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3’ Primer Rl :5’ AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3，。所述嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒中的2XPCR反應(yīng)液由雙蒸水配制，其組分濃度為 Taq DNA 聚合酶0. 1 0. 2U/ μ LdNTP 混合物(dATP，dGTP, dCTP, dTTP)0. 4 0. 8mmol/L
0017]MgCl2 2 4mmol/L KCl80 120mmol/L16 Mmmol/L 。 上游內(nèi)引物(Primer Fl)Tris-HCl(pH8. 3) 0. 14 0. 18ymol/L
下游內(nèi)引物(Primer Rl)0. 14 0. 18ymol/L
上游外引物(Primer F2)1 1. 6 μ mol/L 下游外引物(Primer R2)1 L 6 μ mol/L上述嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒在飲用水檢測(cè)中的應(yīng)用，步驟如下 (1)取水樣，經(jīng)濾膜過(guò)濾后，無(wú)菌雙蒸水洗脫后，離心，取沉淀，并用無(wú)菌雙蒸水漂 洗1-3次，得模板；(2)取步驟(1)制得的模板，加雙蒸水至與2XPCR反應(yīng)液等體積，然后與嗜肺軍團(tuán) 菌檢測(cè)試劑盒中2 XPCR反應(yīng)液混合，控制PCR反應(yīng)條件如下反應(yīng)1預(yù)變性93°C，2分鐘；然后，變性92°C，15秒，退火58°C，15秒，延伸72°C，5秒， 25個(gè)循環(huán)后；延伸72 °C，2分鐘；反應(yīng)2預(yù)變性93°C，2分鐘；然后，變性92°C，15秒，退火55°C，15秒，延伸72°C，5秒， 35個(gè)循環(huán)后；延伸72°C，2分鐘。所述步驟(1)中的濾膜為0. 22 μ m的濾膜。所述步驟(1)中的離心的條件為12000rpm離心1分鐘。原理說(shuō)明本發(fā)明是根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌各菌株中的mip基因有較高同源性，針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌 (Legionella pneumophila)mip基因中的保守序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，第一次PCR反應(yīng)擴(kuò)增一 對(duì)外引物之間的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二次PCR反應(yīng)的模板，擴(kuò)增內(nèi)引物之間的mip基因中 329bp保守序列。對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌各菌株，即使菌的濃度極低，也可以通過(guò)兩次PCR成功擴(kuò) 增得到329bp mip基因此區(qū)域，而由于兩對(duì)引物與非嗜肺軍團(tuán)菌基因組的同源性低，不能與 非嗜肺軍團(tuán)菌結(jié)合，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的特異性、靈敏度。另外本發(fā)明基于研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于所收集的革蘭氏陰性菌，其PCR反應(yīng)所使用DNA模 板可以采用簡(jiǎn)單的方法制備，即收集菌體后以雙蒸水洗滌1次，最后用雙蒸水懸浮；由于飲
4用水供水系統(tǒng)中PCR反應(yīng)干擾物較少，故可以采用此方法，使檢測(cè)過(guò)程更簡(jiǎn)單、省時(shí)。本發(fā)明的有益效果如下1、本發(fā)明所述的試劑盒使用操作簡(jiǎn)便，PCR反應(yīng)混合體系配制簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速；2、不需富集培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)菌、不需通過(guò)提取基因組DNA制備模板，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單；3、本發(fā)明針對(duì)飲用水供水系統(tǒng)中嗜肺軍團(tuán)菌濃度低的特點(diǎn)，采用高特異性引物， 以及中途進(jìn)退式巢式PCR擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高特異性和敏感性；4、本發(fā)明針對(duì)飲用水的特點(diǎn)，采用無(wú)菌雙蒸水漂洗1-3次的方法制備模板，大大 節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。


圖1是本發(fā)明所述嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的電泳圖；圖中，左泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，右泳道為樣品(檢測(cè)為陽(yáng)性)，擴(kuò)增片斷為329bp。
具體實(shí)施例方式為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將給出本發(fā)明的實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅出于 解釋和說(shuō)明的目的，不應(yīng)該被理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例中的濾膜購(gòu)自Millipole公司的0.22 μ m聚碳酸酯膜；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 可采用 Fermentas FastRuler Low Range DNA Ladder、電泳上樣緩沖液采用 Fermentas 6XOrange Loading Dye。實(shí)施例1
一種嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有如下引物
外引物
Primer F2 5' TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC3，
Primer R2 :5’ TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA3，
內(nèi)引物
Primer Fl :5’ TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3，
Primer Rl :5’ AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3，
PCR反應(yīng)液QX)由雙蒸水配制，其組分濃度為
Taq DNA聚合酶0. IU/μ L
dNTP 混合物(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)0. 4mmol/L
MgCl23mmol/L
KCl1OOmmo1/L
Tris-HCl(pH8. 3)20mmol/L
上游內(nèi)引物(Primer Fl)0. 16ymol/L
下游內(nèi)引物(Primer Rl)0. 16ymol/L
(與發(fā)明內(nèi)容中的范圍不一致，請(qǐng)修改)
上游外引物(Primer F2) 1 2 μ mol/L
下游外引物(Primer R2) 1 2 μ mol/L。
實(shí)施例2
嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒在飲用水檢測(cè)中的應(yīng)用，步驟如下1.水樣濃縮與菌樣收集取5L體積水樣，通過(guò)0. 22 μ m濾膜收集菌樣，過(guò)濾過(guò)程中視水樣量即水樣濁度可 更換濾膜；過(guò)濾后將濾膜置于50mL無(wú)菌的離心管中，加無(wú)菌雙蒸水5mL，如果多張濾膜可兩 張置入一管，漩渦振蕩10秒；取出濾膜，合并洗脫液，12000rpm離心1分鐘，棄上清液，保留沉淀。2.模板制備將獲得的沉淀用l_2mL雙蒸水懸浮混勻，轉(zhuǎn)移至1. 5或2mL離心管中，12000rpm離 心ι分鐘，棄上清液，保留沉淀；重復(fù)上述步驟1次；最后用100 μ L雙蒸水懸浮沉淀、混勻， 即為制得的模板。3. PCR反應(yīng)擴(kuò)增mip片斷將制備的模板12. 5μ L與12. 5μ L的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒中檢測(cè)試劑混合，對(duì) 于陽(yáng)性對(duì)照可采用下表
權(quán)利要求
1.一種嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有如下引物 外引物Primer F2 5' TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC 3' Primer R2 :5’ TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA 3’ 內(nèi)引物Primer Fl 5' TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3' Primer Rl :5’ AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3，。
2.如權(quán)利要求1所述的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑 盒中的PCR反應(yīng)液由雙蒸水配制，其組分濃度為Taq DNA聚合酶0.1 0. 2U/ μ LdNTP混合物0.4 — 0. 8mmol/LMgCl22 - 4mmol/LKCl80 120mmol/LTri s-HCl16 24mmol/L上游內(nèi)引物0.14 0. 18ymol/L下游內(nèi)引物0.14 0. 18ymol/L上游外引物1 L 6 μ mol/L下游外引物1 L 6 μ mol/L。
3.權(quán)利要求1所述嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒在飲用水檢測(cè)中的應(yīng)用，步驟如下(1)取水樣，經(jīng)濾膜過(guò)濾后，無(wú)菌雙蒸水洗脫后，離心，取沉淀，并用無(wú)菌雙蒸水漂洗 1-3次，得模板；(2)取步驟⑴制得的模板，加雙蒸水至與2XPCR反應(yīng)液等體積，然后與嗜肺軍團(tuán)菌檢 測(cè)試劑盒中2 XPCR反應(yīng)液混合，反應(yīng)1預(yù)變性93°C，2分鐘；然后，變性92°C，15秒，退火58°C，15秒，延伸:72°C，5秒，25 個(gè)循環(huán)后；延伸72°C，2分鐘； 反應(yīng)2預(yù)變性93 V，2分鐘；然后，變性92 V，15秒，退火55 °C，15秒，延伸:72 °C，5秒，35 個(gè)循環(huán)后；延伸72 °C，2分鐘。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中的濾膜為0.22μ m的濾膜。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(1)中的離心的條件為12000rpm 離心1分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)的試劑盒，特別是飲用水供水系統(tǒng)中嗜肺軍團(tuán)菌的快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。一種嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)試劑盒，它含有如下引物外引物Primer F25’TGCAAGACGCTATGAGTGGCGC 3’，Primer R25’TCCCAAGTTGATCCAGCGGGCA 3’；內(nèi)引物Primer F15’TGAGTGGCGCTCAATTGGCT 3’，Primer R15’AACCTGGAACGTTGCTGGCT 3’。本發(fā)明針對(duì)飲用水供水系統(tǒng)中嗜肺軍團(tuán)菌濃度低的特點(diǎn)，采用高特異性引物，以及中途進(jìn)退式巢式PCR擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高特異性和敏感性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134588SQ20101055605
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者李力, 賈瑞寶 申請(qǐng)人:山東大學(xué)