專利名稱：嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)MIP基因克隆、重組、表達(dá)和蛋白純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因的重構(gòu)后表達(dá)、純化方法，特別是嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因的重組、表達(dá)和純化；在軍團(tuán)菌感染臨床診斷、治療方面的應(yīng)用。
為了穩(wěn)定的獲得足量的蛋白，同時(shí)為制備用于研究蛋白的高效的抗MIP抗體，本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)基因重組的方法，獲得了重組嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因，為了加強(qiáng)其抗原性，發(fā)明人同時(shí)穩(wěn)定、高效的表達(dá)了嗜肺軍團(tuán)菌MIP蛋白。
本發(fā)明的目的是提供上述嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因、表達(dá)和蛋白純化的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為克隆、重組、表達(dá)純化嗜肺軍團(tuán)菌MIP蛋白的方法，包括以下步驟(1)、克隆嗜肺軍團(tuán)菌MIP的基因，用PCR法擴(kuò)增MIP的基因；(2)、將上述擴(kuò)增的MIP基因與克隆載體連接，構(gòu)建嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因克隆質(zhì)粒；(3)、將上述克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體，再將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌；(4)、表達(dá)人嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因a、將上述帶有嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因的表達(dá)載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)；b、從板上選一個(gè)菌落，放入裝LB培養(yǎng)基(含抗生素)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測(cè)菌液A650OD值為1.0時(shí)停止培養(yǎng)；c、向菌液內(nèi)加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)；d、收獲細(xì)菌；
(5)、純化嗜肺軍團(tuán)菌MIP蛋白a、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次；離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、裂解細(xì)菌，離心取上清液；c、初步純化嗜肺軍團(tuán)菌MIP；d、用離子交換和鎳柱層析法進(jìn)行純化。
本發(fā)明專用引物的序列為引物1 5′AAGGATAAGTTGTCTTATAG 3′引物2 5′AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA 3′下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因表達(dá)的蛋白電泳(SDS-PAGE)實(shí)施例一、嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因的獲得1、取嗜肺軍團(tuán)菌1毫升，離心，12,000轉(zhuǎn)/分，3分鐘，去上清液，用0.3毫升Tris緩沖液懸浮菌體沉淀，置100度水中10分鐘，離心12000轉(zhuǎn)/分5分鐘。
取上請(qǐng)液(含嗜肺軍團(tuán)菌基因組DNA)為模板作PCR擴(kuò)增。
2、設(shè)計(jì)引物如下引物1 5′AAGGATAAGTTGTCTTATAG 3 ′引物2 5′AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA 3′3、將上述DNA為模版，PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃變性50秒，55℃退火1分鐘，
72℃延伸1分30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘4、PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳初步確證后，酚/氯仿抽提回收；二、構(gòu)建嗜肺軍團(tuán)菌基因克隆質(zhì)粒1、將PCR產(chǎn)物用膠回收純化。
2、將A-T克隆載體(任何克隆載體均可以，如T-easy，pGEX等)和PCR產(chǎn)物連接，連接反應(yīng)體系如下A-T克隆載體 1ul5x連接緩沖液2ulT4 DNA連接酶1ulPCR產(chǎn)物 4ulH2O 2ul以上混合物在16℃連接反應(yīng)12小時(shí)；3、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素LB板，挑取陽(yáng)性克隆，用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果和基因庫(kù)(genbank)發(fā)表的序列進(jìn)行基因同源性比較，證實(shí)基因序列正確無(wú)誤。
三、表達(dá)質(zhì)粒pQE30-MIP的構(gòu)建1、將上述克隆載體中嗜肺軍團(tuán)菌的基因片段用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切下，經(jīng)1％瓊脂糖電泳，回收嗜肺軍團(tuán)菌基因片段；2、將上述基因片段與相同酶切的pQE30表達(dá)載體(表達(dá)載體也可為其它載體如pET，pGST等)連接，連接反應(yīng)體系如下pQE30(BamHI，HindIII酶切后) 1ul5x連接緩沖液2ulT4DNA連接酶 1ul嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因片斷 5ul
H2O1ul以上混合物在16℃連接反應(yīng)12小時(shí)3、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化M15感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素和青霉素LB板，挑取陽(yáng)性克?。?、用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒DNA用BamHI和HindIII雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pQE30-MIP含有嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因片斷。
四、pQE30-嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因在大腸桿菌中的表達(dá)1、將篩選出的帶有重組質(zhì)粒pQE30-MIP基區(qū)工程菌接種10ml LB(含卡那霉素和氨芐青霉素)試管內(nèi)，37℃，300r/min搖床培養(yǎng)，測(cè)菌液A650OD值為0.6-0.8時(shí)終止培養(yǎng)。
2、將上述10ml菌液放入裝有1000ml LB培養(yǎng)基(含含卡那霉素和氨芐青霉素)的培養(yǎng)瓶中，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測(cè)菌液A650OD值，其OD值為0.6-0.8時(shí)，向菌液內(nèi)加IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)；3、收集細(xì)菌，以5000轉(zhuǎn)/分，4℃，離心20分鐘，去上清液，收集沉淀。用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀，并立即加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至終濃度1mM，放于-20℃凍溶，并取樣品用SDS-PAGE分析，如圖1所示。
五、嗜肺軍團(tuán)菌MIP蛋白的分離純化1、用超聲破碎法(也可以用溶菌酶裂解法)使細(xì)菌裂解，然后在4℃條件下12,000r/min離心10min，沉淀重懸于30ml基礎(chǔ)緩沖液(8M尿素，10mM Tris，pH8.0)，12,000r/min離心20min，取上清液；2、上清液經(jīng)DEAE離子交換和Ni-NTG-His柱親和層析DEAE離子交換層析柱分別以基礎(chǔ)液加100mM、200mM、400mM的NaCl進(jìn)行洗脫。各組分經(jīng)12.5％SDS-PAGE分析。含所需蛋白的組分進(jìn)行Ni-NTG-His柱親和層析，分別以基礎(chǔ)液加15nM、30mM、60mM、120mM、220mM咪唑洗脫。將收集的各組份作12.5％SDS-PAGE分析。
如圖2所示，純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析呈現(xiàn)一條帶。
在上述實(shí)施例中，表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建還可以用一對(duì)上游和下游的5′端各帶有和表達(dá)載體相對(duì)應(yīng)的二個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，以嗜肺軍團(tuán)菌MIP克隆質(zhì)粒DNA為模板，將PCR產(chǎn)物用常規(guī)方法進(jìn)行純化；用二個(gè)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行酶切，用常規(guī)方法純化酶切后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體；用T4連接酶將純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體連接。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)純化嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因和重組嗜肺軍團(tuán)菌MIP的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、克隆嗜肺軍團(tuán)菌MIP的基因，用PCR法擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌MIP的基因；(2)、將上述擴(kuò)增的嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因與克隆載體連接，構(gòu)建嗜肺軍團(tuán)菌MIP克隆質(zhì)粒；(3)、將上述嗜肺軍團(tuán)菌MIP克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體，再將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌；(4)、表達(dá)嗜肺軍團(tuán)菌MIP蛋白。a、將上述帶有嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因的表達(dá)載體的大腸桿菌接種含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)；b、從板上選一個(gè)菌落，接種LB培養(yǎng)基(含有抗生素)瓶?jī)?nèi)，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測(cè)菌液A650OD值為0.6-0.8時(shí)停止培養(yǎng)；c、向菌液內(nèi)加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)；d、收獲細(xì)菌；(5)、純化嗜肺軍團(tuán)菌MIP蛋白。a、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、超聲裂解細(xì)菌，離心，將沉淀加8M尿素懸浮，離心，取上清液；c、純化人用離子交換和Ni-NTG-His柱親和層析進(jìn)行純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)純化重組嗜肺軍團(tuán)菌MIP基因和方法，其特征在于所述PCR法擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌MIP的基因和所用的引物為引物15′AAGGATAAGTTGTCTTATAG，引物2 5′AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嗜肺軍團(tuán)菌Legionellapneumophila macrophage infectivity potentiator MIP基因的克隆、重組、表達(dá)、純化方法與專用引物，以及MIP蛋白及其類似物、衍生物在軍團(tuán)菌感染病人的臨床診斷和治療方面的應(yīng)用。本方法將獲得的嗜肺軍團(tuán)菌(Legionalla Neomaphalla)MIP基因組DNA，用PCR方法獲得MIP基因，并將該基因重組后克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中，誘導(dǎo)表達(dá)后提取MIP蛋白，進(jìn)而應(yīng)用親和層析方法得到高純度的蛋白，為臨床進(jìn)一步診斷嗜肺軍團(tuán)菌感染應(yīng)用于檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌抗原和抗體。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1664105SQ20041000636
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者楊建國(guó), 王金良, 李曉眠, 張楷 申請(qǐng)人:天津瑞愛(ài)金生物科技有限公司