專利名稱：對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的wzt特異的核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核苷酸及其應(yīng)用，尤其涉及一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型(Legionella pneumophila serogroup 1)的 wzt(LPS 0-抗原的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)器，ABC transporter of LPS 0-antigen，以下簡(jiǎn)稱wzt)特異的核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
軍團(tuán)菌(legionella)是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然和人工環(huán)境的水體、土壤中，可以通過(guò)含菌氣溶膠的方式在空氣中播散而被人體吸入導(dǎo)致人類感染，引發(fā)急性發(fā)熱性肺部疾病——軍團(tuán)病。自1976年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)病以來(lái)，該病已呈現(xiàn)出世界性分布及病死率高的兩大特點(diǎn)。軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)繁殖與環(huán)境因密切相關(guān)，集中空調(diào)的冷卻塔冷卻水、冷凝水以及溫泉水是軍團(tuán)菌在外界適宜的生存環(huán)境。當(dāng)環(huán)境水中的軍團(tuán)菌繁殖到一定濃度，則會(huì)形成氣溶膠進(jìn)而感染人。宿主感染主要受其易感性和細(xì)菌毒力的影響，任何年齡均可發(fā)生，但中老年、基礎(chǔ)免疫較差者、長(zhǎng)途旅行者、吸煙者為高危人群，并以醫(yī)院、賓館、大型建筑工地等公共場(chǎng)所易染軍團(tuán)菌。目前，軍團(tuán)菌屬(Legionellace)已發(fā)現(xiàn)有50多個(gè)種，70多個(gè)血清型，并不斷有新的菌種被發(fā)現(xiàn)。其中與人類關(guān)系最密切的的嗜肺軍團(tuán)菌，最早從環(huán)境中分離出來(lái)，是軍團(tuán)菌屬的代表種。根據(jù)0-抗原的不同，嗜肺軍團(tuán)菌可分為15個(gè)血清型。其中大約有70%的軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌1型引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺軍團(tuán)菌導(dǎo)致約5-10%的軍團(tuán)菌感染，從此可得知，嗜肺軍團(tuán)菌1型在軍團(tuán)菌引起的病例中占有相當(dāng)大的比例，是軍團(tuán)菌的主要致病類群，在軍團(tuán)菌的研究調(diào)查中占有重要的地位。此外，軍團(tuán)菌屬種類多樣，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)和血清鑒定分型，耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，通量低，不能滿足流行病學(xué)調(diào)查及對(duì)突發(fā)致病事件快速分析需要；單克隆抗體分型方法由于 MAbs分型需特殊技術(shù)，昂貴的儀器設(shè)備也只能在特定的實(shí)驗(yàn)室使用。因此，近年來(lái)，越來(lái)越多的分子技術(shù)用于病原菌的鑒定、檢測(cè)及病害診斷中，包括特定基因序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析等。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)，不需要經(jīng)過(guò)病原菌的分離、純培養(yǎng)等過(guò)程，而且具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。1993年，Luk，J.M. C et. al選取沙門氏菌(S. enterica) 0_抗原基因簇的特異核苷酸序列，通過(guò)PCR方法鑒定了沙門氏菌的0-抗原[Luk，J. Μ. C. et. al. (1993) "Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification of S. enterica major serogroups (A, B, C2, andD)，，， J. Clin. Microbiol. 31 :2118-2123]，開啟了從0抗原基因簇中篩選特異分子標(biāo)識(shí)的先河， 為細(xì)菌多樣的0-抗原檢測(cè)提供了高通量、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高的分子檢測(cè)方法。細(xì)菌0抗原種類繁多，一般不同的細(xì)菌具有不同的0-抗原，同一種屬內(nèi)的細(xì)菌也大多有不同的0-抗原。研究表明，細(xì)菌0-抗原的多樣性是由負(fù)責(zé)其合成的基因簇的遺傳學(xué)多樣性導(dǎo)致，0-抗原基因簇中的一些特定基因?qū)τ谄渚幋a的表面抗原具有極高的特異性，由
3此為啟發(fā)，可以從0抗原基因簇中篩選特異分子標(biāo)識(shí)，用于軍團(tuán)菌分子分型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的wzt特異的核苷酸，所述核苷酸為1) SEQ ID NO 1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸；2)與1)所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。上述核苷酸可以用于制備檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌1型用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列； 所述嗜肺軍團(tuán)菌1型可以取樣于自來(lái)水、礦泉水、空調(diào)冷卻水的培養(yǎng)物的粗提液，或是嗜肺軍團(tuán)菌1型的純培養(yǎng)物的粗提液等。本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述 PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物優(yōu)選為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸。上述PCR檢測(cè)試劑盒可以包括如下試劑10mM dNTP 30 μ 1 ；IOX酶特異性反應(yīng)緩沖液50μ 1 ；5υ/μ 1耐熱DNA聚合酶5μ 1 ；引物各10μ 1 ；陽(yáng)性對(duì)照品10μ 1，陰性對(duì)照品 10 μ 1 ； ddH20 Imlo上述針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的PCR檢測(cè)試劑盒，整個(gè)檢測(cè)步驟包括樣品預(yù)處理—— 擴(kuò)增——電泳檢測(cè)結(jié)果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴(kuò)增管中，使用者只需將預(yù)處理后的樣本加入擴(kuò)增管啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)即可，簡(jiǎn)單快速的完成檢測(cè)工作。本發(fā)明還提供一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸；其中所述寡核苷酸探針優(yōu)選為如SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸。本發(fā)明還提供一種微列陣，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)用性強(qiáng)本發(fā)明所配制的PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。本PCR試劑盒若用嗜肺軍團(tuán)菌1 型的菌懸液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與經(jīng)提取得到的DNA作為模板擴(kuò)增所得結(jié)果一致。敏感度和特異性無(wú)差別，這樣，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法得以簡(jiǎn)化。同時(shí)，相比常規(guī)生化檢測(cè)方法而言，本方法所采用的待測(cè)樣品可以直接是臨床樣品培養(yǎng)液，或者對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單分離培養(yǎng)就可進(jìn)行檢測(cè)，因而節(jié)省了人力物力。(2)準(zhǔn)確性高本發(fā)明通過(guò)對(duì)所有的GeneBank中的嗜肺軍團(tuán)菌的wzt基因進(jìn)行比較，找到嗜肺軍團(tuán)菌1型的wzt基因的特異區(qū)，設(shè)計(jì)出引物。繼而利用引物組合成復(fù)合PCR檢測(cè)體系，能夠直接將嗜肺軍團(tuán)菌1型和其近源菌種分開。(3)靈敏度高本發(fā)明提供的嗜肺軍團(tuán)菌1型檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法敏感性高，檢測(cè)精度高， 可以檢測(cè)到Ipg/ μ 1的DNA模板。
為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。


圖1為本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)結(jié)果圖，其中A為待測(cè)樣品，檢測(cè)到病原菌；P為陽(yáng)性對(duì)照品；N為陰性對(duì)照品；M為DL2000 DNA marker ；圖2為本發(fā)明試劑盒檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌1型G2756 ；2，嗜肺軍團(tuán)菌2型G2773 ；3，嗜肺軍團(tuán)菌3型G2772 ； 4，嗜肺軍團(tuán)菌4型G2781 ；5，嗜肺軍團(tuán)菌6型G2771 ；6，嗜肺軍團(tuán)菌8型G2820 ；7，嗜肺軍團(tuán)菌9型G2774 ；8，嗜肺軍團(tuán)菌10型G2818 ；9，嗜肺軍團(tuán)菌11型G2824 ； 10，嗜肺軍團(tuán)菌12 M G2822 ；11，嗜肺軍團(tuán)菌13型G2819 ；12，嗜肺軍團(tuán)菌14型G2817 ；13，嗜肺軍團(tuán)菌15型 G2829 ；M, DL2000 DNA marker ；圖3為本發(fā)明試劑盒檢測(cè)軍團(tuán)菌屬非嗜肺軍團(tuán)菌電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌 1 型G2756 ；2，Legionella waltersii ；3，Legionella micdadei ；4， Legionella Iongbeachae ；5, Legionella anisa ；6, Legionella gormanii -J, Legionella bozemanii ；8, Legionella steigerwaltii ；Μ,DL2000DNA marker ；圖4為本發(fā)明檢測(cè)軍團(tuán)菌屬臨床菌株電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌1型G2756 ；2，嗜肺軍團(tuán)菌1型G2759 ；3，嗜肺軍團(tuán)菌2型G2761 ；4， 嗜肺軍團(tuán)菌3型G2762 ；5，嗜肺軍團(tuán)菌7型G2763 ；6，嗜肺軍團(tuán)菌7型G2764 ；7，嗜肺軍團(tuán)菌5型G2765 ；8，非嗜肺軍團(tuán)菌19型G2766 ；9，非嗜肺軍團(tuán)菌352型G2767 ；M, DL2000 DNA marker ；圖5為本發(fā)明試劑盒檢測(cè)其它種屬近源菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌1型G2756 ；2，沙門氏菌；3，志賀痢疾桿菌；4，金黃色葡萄球菌；5， 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；6，綠膿桿菌；7，嗜水氣單胞菌；M，DL2000 DNA marker 0
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。實(shí)施例1 基因組的提取在BCYE平板培養(yǎng)基中37 °C、5 % CO2過(guò)夜培養(yǎng)嗜肺軍團(tuán)菌1型菌株，50mM Tris-HCl (pH8. 0)刮取菌落，離心收集菌體。用 250ul 50mMTris-HCl (pH8. 0)和 IOul 0. 4M EDTA重懸細(xì)胞，加入IOul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10% SDS, 50°C溫育2小時(shí)，再加入3ull0mg/ml的RNase，65°C溫育20分鐘。 用等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的氯仿異戊醇G9 1)抽提。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70% 乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過(guò)0. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
實(shí)施例2 特異引物的篩誅針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的wzt基因的特異區(qū)設(shè)計(jì)引物；用這對(duì)引物(上游引物是5，-GTACTACTACAACCGCAGCAGA-3，，見序列SEQ IDNO 1 ；下游弓丨物是 5’ -CGAGTGATATCCATGACTGAAC-3’，見序列SEQ ID NO :2)。以1株嗜肺軍團(tuán)菌1型的標(biāo)準(zhǔn)菌株，12株嗜肺軍團(tuán)菌其它血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株、7株軍團(tuán)菌屬其他菌株、1株嗜肺軍團(tuán)菌1型臨床分離株、7株軍團(tuán)菌屬其它血清型臨床分離株以及6株近緣菌為模板進(jìn)行PCR，體系為 5uM 引物 0. 4ul、10Xbuffer2. 5ul、10mM dNTP 0. 25ul、5U/ulTaq 聚合酶 0. 2ul 及的待測(cè)樣品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH20補(bǔ)足至25ul。所有引物都在嗜肺軍團(tuán)菌1型中得到陽(yáng)性結(jié)果，在其他組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，所以該寡核苷酸對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型及其wzt都是高度特異的。實(shí)施例3 =PCR檢測(cè)試劑盒
一、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所需材料及設(shè)備的準(zhǔn)備
1.試劑盒組成
DdNTP(IOmM)30ul ；
2) 10 X buffer (10 X酶特異性反應(yīng)緩沖液)50ul ；
3) Taq 聚合酶(5U/ul)5ul ；
4)引物混合物(5uM)IOul ；
5)陽(yáng)性對(duì)照品(KP)IOul ；
6)陰性對(duì)照品(KN)IOul ；
7) (MH2O5ml ο
每個(gè)試劑盒可用于檢測(cè)10個(gè)樣品。
其中l(wèi)OXbuffer、dNTP、Taq聚合酶由寶生物工程(大連)有限公司提供；引物
混合物為自行設(shè)計(jì)的序列提供給上海英駿生物技術(shù)公司合成；陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和 ddH20由我們自行制備。檢測(cè)所使用的引物的上游引物是5，-GTACTACTACAACCGCAGCAGA-3，(SEQ ID NO: 1)，下游引物是 5，-CGAGTGATATCCATGACTGAAC-3，(SEQ ID NO :2)，比例為 1 1。使用上述的PCR試劑盒檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌1型的PCR檢測(cè)方法包括以下步驟(1)提取待測(cè)環(huán)境樣品模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、10 X酶特異性反應(yīng)緩沖液、Taq聚合酶、引物、待測(cè)樣品模板和ddH20，混勻；(3)將薄壁PCR中混勻的混合物在PCR儀上擴(kuò)增；(4)在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果；(5)分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。上述步驟(1)中的環(huán)境樣品模板為血、痰、支氣管抽提物、胸水肺組織、自來(lái)水取樣、礦泉水取樣、空調(diào)冷卻水取樣等的培養(yǎng)物的粗提液，或是嗜肺軍團(tuán)菌1型的純培養(yǎng)物的粗體液，或是純DNA，或者是陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品。上述步驟(1)中的環(huán)境樣品模板的提取方法為(1) 1.5ml 50mM Tris-HCl (pH8. 0)刮取培養(yǎng)物，在 12000rpm條件下離心 1 分鐘，去
掉上清液；
(2)取500 μ 1的ddH20重懸沉淀，在8000rpm條件下離心5分鐘，去掉上清液，控干；(3)取100 μ 1 ddH20重懸沉淀，在100°C沸水中水浴10分鐘；(4)再置于冰上10分鐘后，在12000rpm條件下離心2分鐘；(5)取3 μ 1中層上清做為PCR反應(yīng)的模板。上述步驟(3)中的PCR儀上的反應(yīng)循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復(fù)性、延伸的溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，具體為前期為使變性能夠達(dá)到所需溫度而必需的前期處理過(guò)程的一個(gè)循環(huán)為95°C，5分鐘；變性溫度和時(shí)間為95 °C，40秒；復(fù)性溫度和時(shí)間為56 °C，40秒；延伸溫度和時(shí)間為72 °C，40秒；變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)次數(shù)為33個(gè)循環(huán)；為穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的溫度和時(shí)間為72°C，5分鐘。上述步驟(4)在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果的具體步驟為(1)取2 5 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物與6 X溴酚藍(lán)上樣緩沖液以5 1的體積比混合；(2)將混合液上樣于1 %的瓊脂糖凝膠上；(3)將瓊脂糖凝膠電泳120ν穩(wěn)壓電泳約10分鐘，用DL2000Marker進(jìn)行對(duì)照；(4)觀察并記錄結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)配制一種可檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌1型的可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的PCR試劑盒，將PCR 檢測(cè)方法需要使用的組分組合在一起，使用時(shí)，提取待測(cè)樣品，同時(shí)經(jīng)過(guò)較為簡(jiǎn)單的操作程序就可以進(jìn)行快速、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)、試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗(yàn)所得，用該試劑盒檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌1型所使用的試驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低。使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照品的目的是用于質(zhì)控整個(gè)操作過(guò)程，以便得出準(zhǔn)確的判斷。 若含有嗜肺軍團(tuán)菌1型，則從電泳結(jié)果中可以觀察到與陽(yáng)性對(duì)照品相同位置的條帶；若不含有嗜肺軍團(tuán)菌1型，則與陰性對(duì)照品一樣不具有這一條帶。本發(fā)明一次檢測(cè)試驗(yàn)所使用的試劑盒中的試劑量見下表1所示，DNA模板量為 3μ 1。表1 一次檢測(cè)試驗(yàn)所使用的試劑盒中的試劑量
權(quán)利要求
1.一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的WZt特異的核苷酸，所述核苷酸為1)SEQID NO 1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸；2)與1)所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。
2.權(quán)利要求1所述的核苷酸在制備檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌1型用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述嗜肺軍團(tuán)菌1型取樣于自來(lái)水、礦泉水、空調(diào)冷卻水的培養(yǎng)物的粗提液，或是嗜肺軍團(tuán)菌1型的純培養(yǎng)物的粗提液。
4.一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于，所述PCR 引物包括權(quán)利要求1所述的核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PCR試劑盒，其特征在于，所述的PCR引物如SEQID N0:1和 / 或 SEQ ID N0:2 所示。
6.一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其特征在于，所述寡核苷酸探針包括權(quán)利要求1所述的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針如SEQID N0:1和 / 或 SEQ ID N0:2 所示。
8.一種微列陣，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微列陣，其特征在于，所述核苷酸如SEQIDNO :1和/或SEQ ID NO 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的wzt特異的核苷酸及其應(yīng)用，所述核苷酸為SEQ ID NO1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO2所示的核苷酸；與上述的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。這些核苷酸可用于制備檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌1型用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列。本發(fā)明的對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌1型的wzt特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列的實(shí)用性強(qiáng)，PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低；準(zhǔn)確性高；靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102311950SQ20101022662
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者馮露, 周光朋, 曹勃陽(yáng), 朱之燕, 王磊 申請(qǐng)人:南開大學(xué)