專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法及該方法所用的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的菌株和發(fā)酵生產(chǎn)L-乳 酸的方法。
背景技術(shù)：
乳酸(α-羥基-丙酸)廣泛存在于人體、動物及微生物代謝之中，也存在于與人 們生活密切相關(guān)的多種食品中。乳酸可用于食品、飲料、醫(yī)藥塑料、飼料、農(nóng)藥、日用化工、造 紙及電子工業(yè)等領(lǐng)域。在食品、飲料工業(yè)上，乳酸用作酸味劑、強化劑、防腐劑，是絕對安全 的添加劑。乳酸衍生物，如乳酸鈣、乳酸鋅、乳酸亞鐵是食品、飲料、保健品的強化劑，乳酸類 乳酸乙酯是多種名酒的主香成分。在醫(yī)藥工業(yè)中，乳酸及其衍生物(如乳酸鈉)可與氯化 鈉、氨基酸等配伍，生產(chǎn)治療高鉀血癥或酸中毒的大輸液，乳酸還被用于羅弗沙星等藥物的 生產(chǎn)。乳酸酯又是良好的有機溶劑，可用于生產(chǎn)醇酸樹脂、油墨和涂料等化工產(chǎn)品。近年來， 國際上以L-乳酸開發(fā)的聚乳酸PLA是一種新型聚酯材料，其能勝任其他合成塑料的用途， 而且具有良好的生物可降解性。比起石油化學(xué)合成樹脂，其具有獨特優(yōu)異的性能。目前世界乳酸生產(chǎn)大部分采用發(fā)酵法生產(chǎn)，而應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸常用的微生物 僅有兩大類，一類為細(xì)菌，多采用乳酸菌(Lactic acid bacteria)；另一類為霉菌，多采用 根霉(Rhizopus)。我國的乳酸發(fā)酵工業(yè)經(jīng)過了幾十年的發(fā)展，工藝上多數(shù)采用米根霉發(fā)酵 大米糖化液進行生產(chǎn)。根霉是好氧真菌，營養(yǎng)要求簡單，可以直接以淀粉為碳源，理論轉(zhuǎn)化 率為75%。由于生產(chǎn)設(shè)備簡陋，發(fā)酵工藝粗放，電耗、水耗和能耗均較高，而且發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率 偏低，成本難以同國外進口的同類產(chǎn)品競爭。特別是近年來，隨著國內(nèi)糧食和煤炭等重要工 業(yè)原料價格的大幅度上漲，乳酸行業(yè)的成本也隨之上升，使許多乳酸企業(yè)的生產(chǎn)難以為繼。近年來，采用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸技術(shù)受到重視。常用的菌種有德氏乳桿菌和鼠李 糖乳桿菌。乳酸菌屬于化能異養(yǎng)型微生物，可以在兼性厭氧條件下發(fā)酵，設(shè)備投資和動力 消耗顯著降低。乳酸發(fā)酵的理論轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。一般乳酸細(xì)菌最適發(fā)酵溫度在37 420C，提高發(fā)酵溫度后，其產(chǎn)量會大幅度減少。在乳酸生產(chǎn)中，提高乳酸菌的發(fā)酵溫度可以 大大減少工廠生產(chǎn)中冷卻水的消耗，降低發(fā)酵成本；同時，提高發(fā)酵溫度可以減少雜菌污染 的機會，提高乳酸的純度，減少倒罐幾率等，所以如何改良細(xì)菌的高溫耐受性逐漸引起了許 多國內(nèi)外研究者的關(guān)注。另外，乳酸發(fā)酵生產(chǎn)中，高濃度的葡萄糖和乳酸對乳酸菌的生長和乳酸合成都有 強烈的抑制作用，是影響乳酸發(fā)酵單位產(chǎn)量的技術(shù)瓶頸。如果能通過菌種的選育，實現(xiàn)高葡 萄糖濃度、高乳酸濃度的發(fā)酵，就可以提高乳酸發(fā)酵的強度，達(dá)到提高乳酸生產(chǎn)率的目的。全局轉(zhuǎn)錄機制工禾呈(Global transcription machinery engineering，gTME)技術(shù) 是通過基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子使整個轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程發(fā)生變化從而改變或提 高目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。此項技術(shù)近年來在細(xì)胞代謝工程方面已得到成功應(yīng)用。其中， Hal Alper等在2006年就采用突變TATA結(jié)合蛋白的方法在真核生物中篩選到耐受高乙醇 和葡萄糖濃度的菌株。隨后的2007年Hal Alper又采用gTME技術(shù)突變編碼σ 7°的rpoD基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選得到耐受高乙醇、高代謝通量、多樣化細(xì)胞表型的菌株。另外，劉 紅梅等利用全局轉(zhuǎn)錄工程(gTME)方法將全局轉(zhuǎn)錄因子sptl5隨機突變并克隆表達(dá)，構(gòu)建突 變庫。最終篩選得到能夠很好的利用木糖并共發(fā)酵木糖和葡萄糖的菌株。因此，gTME技術(shù) 可以在微生物代謝途徑的基因組層面上定向進化或同時改變多個相關(guān)基因群，使細(xì)胞在整 體水平上適應(yīng)某些物質(zhì)的代謝或利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，使其具有高產(chǎn)L-乳酸的特點。本發(fā)明還提供一種L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌，使其具有耐高溫高糖和高產(chǎn)的特點。本發(fā)明還提供這種耐高溫高糖的高產(chǎn)L-乳酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，是在培養(yǎng)基中通過微生物發(fā)酵來 生產(chǎn)L-乳酸，所述的微生物是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094，所述的培養(yǎng)基為含高糖的培養(yǎng)基，該含高糖的培養(yǎng)基的成分為葡萄糖 100-150g/L、酵母粉5-20g/L。本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸方法的發(fā)酵過程是在50°C _55°C之 間進行。本發(fā)明提供的通過鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCCN0 M2010094發(fā)酵來生產(chǎn)L-乳酸的具體方法包括以下步驟a.活化菌株配制MRS培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基pH值為6. 0-7.0，于121°C滅菌 30min ；將保存的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094 菌株 接種至IOOmL的MRS培養(yǎng)基，于42°C、150rpm搖床中培養(yǎng)過夜，得到活化菌株；b.種子制備將活化菌株按5-10% (ν/ν)接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，將其置于 42°C、150rpm搖床中培養(yǎng)16h，完成種子制備；c.發(fā)酵配制高糖發(fā)酵培養(yǎng)基，將配制好的高糖發(fā)酵培養(yǎng)基于121°C滅菌30min 后冷卻到50-55°C ；再將制備好的種子按5-10% (ν/ν)接種量接種于高糖發(fā)酵培養(yǎng)基，于 500C _55°C攪拌轉(zhuǎn)速IOOrpm下發(fā)酵，發(fā)酵過程中以6mol/L的NaOH作為中和劑將發(fā)酵液中 PH控制在5. 5-6. 5之間；d.補料在發(fā)酵24h后，不斷補充葡萄糖使發(fā)酵體系中的糖含量維持在100_150g/ L,持續(xù)補糖24h，然后停止補糖，繼續(xù)發(fā)酵24至30h至殘?zhí)墙档偷絣g/L以下后停止發(fā)酵，得 L-乳酸。在本發(fā)明一個實施例中，MRS培養(yǎng)基的組織成分是蛋白胨10g/L，牛肉膏IOg/ L,酵母粉5g/L，K2HP04 2g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5g/L，葡萄糖20g/L,吐溫801mL, MgS04 ·7Η20 0. 58g/L，MnS04. 4H20 0. 25g/L ；調(diào)節(jié) MRS 培養(yǎng)基 pH值的具體方法是以 6mol/ L的NaOH調(diào)MRS培養(yǎng)基pH值至pH6. 8。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，乳酸終產(chǎn)量達(dá)到220g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 90%。本發(fā)明提供的L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌，是通過利用全局轉(zhuǎn)錄工程(gTME)方法將細(xì)菌 RNA聚合酶的σ因子隨機突變，構(gòu)建突變庫，將突變基因連接到表達(dá)載體pBBRlMCS-5上，轉(zhuǎn) 化鼠李糖乳桿菌中表達(dá)，經(jīng)培養(yǎng)基初篩獲得的耐高溫、高糖和高乳酸濃度的高產(chǎn)L-乳酸重組菌株。該菌株已經(jīng)于2010年4月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢)， 保藏號為 CCTCC NO :M2010094，名稱為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) HR03。本發(fā)明所提供的L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1) σ因子的編碼序列的擴增根據(jù)genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，設(shè)計一對引物，以Lactobacillus rhamnosus總DNA為模板，PCR擴增得到σ 因子的編碼序列。(2) σ因子上游控制序列的擴增根據(jù)genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，設(shè)計一對引物，以Lactobacillus rhamnosus總DNA為模板，PCR擴增得到σ 因子上游控制序列。(3) ο因子完整的表達(dá)序列的構(gòu)建根據(jù)σ因子編碼序列和其上游控制序列，設(shè)計一對融合引物，以上述步驟(1)和 (2)獲得的片段為模板，進行融合PCR，得到σ因子和其上游控制序列的融合基因片段，然 后將此融合基因連接到PGEM-T載體上進行保存和測序。(4) σ因子表達(dá)序列中隨機突變的引入根據(jù)σ因子編碼序列和其上游控制序列，設(shè)計一對帶酶切位點的引物，以融合基 因為模板，進行易錯PCR擴增。(5) σ因子表達(dá)載體的構(gòu)建將易錯PCR產(chǎn)物回收后和載體pBBRlMCS-5同時進行雙酶切，然后用T4連接酶 將雙酶切后的融合基因和PBBR1MCS-5載體連接。將隨機突變的σ因子表達(dá)序列插入 pBBRlMCS-5載體的多克隆位點，構(gòu)成σ因子表達(dá)載體。(6) σ因子表達(dá)載體導(dǎo)入鼠李糖乳桿菌將正常的乳酸桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)12小時后，向其中加入氨芐 青霉素，靜置培養(yǎng)3小時后。將上述培養(yǎng)液離心后棄上清。將上述乳酸桿菌細(xì)胞沉淀用PEB 溶液清洗，重復(fù)兩次。最后用預(yù)冷的PEB溶液和50%的甘油混勻后分裝，即得到乳酸桿菌的 感受態(tài)細(xì)胞液。將連接產(chǎn)物加入乳酸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞溶液中，轉(zhuǎn)移到電極杯中冰浴后進 行電轉(zhuǎn)化。然后用高滲MRS培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)5個小時。然后吸取培養(yǎng)液涂布到含慶大霉素 的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。(7)耐高溫、高糖的高產(chǎn)乳酸菌的篩選將轉(zhuǎn)化子分別劃線至葡萄糖濃度為150 200g/L、乳酸濃度為50 100g/L的培 養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中均加入65ug/ml的慶大霉素。放置42°C進行篩選轉(zhuǎn)化陽性菌株。再劃線 至高糖平板上50°C-55°C，進行再篩選。將篩選得到的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶進 行雙酶切驗證，再以經(jīng)過酶切驗證后的質(zhì)粒為模板，以F-BamHLR-HindIII為引物進行PCR 驗證。


圖1為σ因子的編碼序列的PCR電泳圖。圖2為σ因子上游控制序列的PCR電泳圖。
圖3為σ因子的編碼序列和σ因子上游控制序列的融合PCR電泳圖。圖4為融合PCR產(chǎn)物連接PGEM-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后PCR驗 證。圖5為σ因子表達(dá)序列易錯PCR電泳6為σ因子表達(dá)序列易錯PCR產(chǎn)物BamHI、HindIII雙酶切電泳圖。圖7為載體PBBR1MCS-5經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切后電泳圖。圖8為在高糖、高乳酸、含慶大霉素的MRS固體平板上，55°C高溫篩選得到的轉(zhuǎn)化 子圖。以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
具體實施例方式實施例1(1) σ因子的編碼序列的擴增；根據(jù)genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，利用OLIGO 6. 0引物設(shè)計軟件設(shè)計如下一對引物L(fēng)Rsigma-up :5， -ATGGCTGATAAAAAAACAGCAAC-3，LRsigma-down :5’ -TTATTCAAGAAAATCCTTAAGCTGC-3’在50 μ L的反應(yīng)體系中，上述兩條引物的濃度均為^!!!(^/^!^(!^？各？。 !^^/ μ L ；Mg2+15pmol/y L ；Lactobacillus rhamnosus 基因組 DNA 模板 IOpmol ；Pfu DNA 聚合 酶 2. 5U。PCR 擴增條件為95°C 5min ;94°C lmin，57°C lmin，72 °C 2min，進行 30 個循環(huán)； 72°C IOmin。將PCR產(chǎn)物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三 版，2002年版)，結(jié)果顯示得到一條約1251bp的特異片段，與預(yù)期擴增的目的片段大小吻 合。PCR產(chǎn)物的回收采用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能博彩 生物技術(shù)科技有限公司)?；厥蘸蟮钠?20°C保存?zhèn)溆谩?2) σ因子上游控制序列的擴增；根據(jù)genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，設(shè)計如下一對引物Psigma-up :5， -ACTTGCTTTTCTTGATTCATCAGGCT-3，Psigma-down :5’ -TCCGGCGATATCAGCTCACT-3’在50 μ L的反應(yīng)體系中，上述兩條引物的濃度均為^!!!(^/^!^(!^？各？。 !^^/ μ L ；Mg2+15pmol/y L ；Lactobacillus rhamnosus 基因組 DNA 模板 IOpmol ；Pfu DNA 聚合 酶 2. 5U。PCR 擴增條件為95°C 5min ;94°C lmin, 52 °C lmin, 72 °C lmin，進行 30 個循環(huán)； 72°C IOmin。將PCR產(chǎn)物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三 版，2002年版)，結(jié)果顯示得到一條約185bp的特異片段，與預(yù)期擴增的目的片段大小吻合。 PCR產(chǎn)物的回收采用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能博彩生物 技術(shù)科技有限公司)。回收后的片段-20°C保存?zhèn)溆谩?3) σ因子完整的表達(dá)序列的構(gòu)建；
根據(jù)σ因子編碼序列和其上游控制序列，設(shè)計一對融合引物如下Psigma-RH :5 ’ -GTTGCTGTTTTTTTATCAGCCATTCCGGCGATATCAGCTCACT-3 ’ LRs i gma-RH 5’ -AGTGAGCTGATATCGCCGGAATGGCTGATAAAAAAACAGC AAC-3’以上述步驟(1)獲得的片段為模板，以LRsigma-RH和LRsigma-down為引物進行 PCR得到sigma factor的中間融合基因片段，記為LRsigma-RH_M。在50 μ L反應(yīng)體系中上 述兩條引物的濃度均為lpmol/μ L ；dNTP 20pmol/yL ；Mg2+15pmol/μ L ；步驟(1)獲得的片 段為模板 IOpmol ；Pfu DNA聚合酶 2. 5U。PCR擴增條件為:95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin, 72°C 2min，進行 30 個循環(huán)；72°C IOmin0以上述步驟⑵獲得的片段為模板，以Psigma-up和Psigma-RH為引物進行PCR 得到sigma factor promoter的中間融合基因片段，記為Psigma-RH-M。在50 μ L反應(yīng)體 系中上述兩條引物的濃度均為lpmol/μ L ；dNTP各20ρπιο1/μ L ；Mg2+15pmol/μ L ；步驟(2) 獲得的片段為模板IOpmol ；Pfu DNA聚合酶2. 5U。PCR擴增條件為95°C 5min ；94°C lmin, 53°C lmin，72°C lmin，進行 30 個循環(huán)；72°C IOmin0在不添加引物的情況下先以Psigma-RH、LRsigma-RH互為引物進行預(yù)PCR得到中 間產(chǎn)物。在50 μ L反應(yīng)體系中:LRsigma-RH-M和Psigma-RH-M的濃度均為IOpmol ；dNTP 20pmol/y L ；Mg2+15pmol/μ L ；Pfu DNA聚合酶2. 5U。PCR擴增條件為94°C lmin，58°C lmin, 72 °C 5min.共15個循環(huán)。以此中間產(chǎn)物為模板，采用如下程序PCR程序進行進一步的融合PCR得到融合基 因。在50 μ L反應(yīng)體系中引物Psig-UP和LRsigma-down的濃度均為lpmol/μ L ;dNTP 20pmol/y L ；Mg2+15pmol/μ L ；中間產(chǎn)物的片段為模板10 μ L ；Taq DNA聚合酶5U。PCR擴增 條件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C 2min，進行 30 個循環(huán)；72°C IOmin0然后將此融合基因連接到pGEM-T載體上進行保存和測序。連接體系如下PCR 產(chǎn)物 IOyLpGEM-T0. 5 μ LT4Buffer 7 μ LT4Ligase 0. 5 μ L4°C過夜連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后65°C保溫10分鐘，以滅活T4連接酶。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，37°C，150轉(zhuǎn)搖床上溫育培養(yǎng)1小時，然后取 100 μ L溫育液涂布含20ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，14小時候可得到陽性克隆。挑取 陽性克隆到含有100ug/ml氨芐青霉素的1. 5ml離心管中37°C，150轉(zhuǎn)培養(yǎng)約7小時，管中 可見菌體，取菌液進行菌液PCR程序鑒定陽性克隆。在50yL反應(yīng)體系中引物Psig-up和 LRsigma-down 濃度均為 lpmol/μ L ；dNTP 20pmol/ μ L ；Mg2+15pmol/ μ L ；1 μ L 菌液為模板； Pfu DNA 聚合酶 2. 5U。PCR 擴增條件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin, 72°C 2min，進行 30個循環(huán)；72°C IOmin0結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)化子為100%。將菌液PCR驗證的陽性轉(zhuǎn)化子繼續(xù)培養(yǎng)至OD值約為1. 2，將該菌液送到上海桑尼 生物科技有限公司進行測序。該編碼序列具有如序列表SEQ ID No. 1所示的序列，與報道 的σ因子的編碼序列的一致性大于99%。(4) σ因子表達(dá)序列中隨機突變的引入；根據(jù)σ因子編碼序列和其上游控制序列，設(shè)計一對帶酶切位點的引物如下
F-BamHI :5，GGCGGATCCACTTGCTTTTCTTGATTCAT 3，R-HindIII :5，CAGAAGCTTTTATTCAAGAAAATCCTT3’采用易錯PCR試劑盒(購自吉林藍(lán)罡生物科技有限公司)引入突變。在50yL的 反應(yīng)體系中，上述兩條引物的濃度均為lpmol/μ L ;ER dNTP 20pmol/y L ； 10XERBufferl 10μ L ；IOXER Buffer2 10 μ L ；融合基因為模板 IOpmol/μ L ;Taq DNA 聚合酶 5U。PCR 擴 增條件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，進行 35 個循環(huán)；72°C IOmin0將PCR產(chǎn)物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三 版，2002年版)，結(jié)果顯示得到一條約1454bp的特異片段，與預(yù)期擴增的目的片段大小吻 合。PCR產(chǎn)物的回收采用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能博彩 生物技術(shù)科技有限公司)。(5) σ因子表達(dá)載體的構(gòu)建；將易錯PCR產(chǎn)物回收后和載體pBBRlMCS-5同時進行雙酶切，根據(jù)易錯PCR擴增基 因所用的引物兩端的酶切位點為BamHI、HindIII，該PCR用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII 進行酶切，產(chǎn)生粘性末端的DNA片段，為下一步的互補粘性末端連接做準(zhǔn)備，具體步驟
PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系(50 μ L) PCR回收產(chǎn)物 25 μ L BamHI0. 6 μ L
HindIII1. 2μ L
Buffer BamHI 5 μ L H2O18. 2 μ L
載體pBBRlMCS-5酶切反應(yīng)體系(50 μ L) pBBRlMCS-5 25 μ L
0.6μ L
1.2μ L 5 μ L
_18. 2μ L
37°C反應(yīng)過夜。酶切后的DNA溶液于65°C保溫20分鐘，使內(nèi)切酶BamHI、HindIII 失活。酶切產(chǎn)物的回收采用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能 博彩生物技術(shù)科技有限公司)。 然后用T4連接酶將雙酶切后的融合基因和pBBRlMCS-5載體連接，將隨機突變的 σ因子表達(dá)序列插入pBBRlMCS-5載體的多克隆位點，構(gòu)成σ因子表達(dá)載體。具體步驟 經(jīng)過相同雙酶切并且純化的PCR產(chǎn)物和載體pBBRlMCS-5的酶連接體系為(12 μ L)
BamHI HindIII Buffer BamHI H9O
PCR產(chǎn)物 pBBRlMCS-5 載體 PEG4000
T4Ligase Buffer T4Ligase
5. 5 μ L 2μ L,
0.8μ L
1.2μ L, 0· 5 μ L0
16°C過夜連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后65°C保溫10分鐘，以滅活T4DNA連接酶c (6) σ因子表達(dá)載體導(dǎo)入鼠李糖乳桿菌；
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將正常的乳酸桿菌稀釋后涂布MRS固體培養(yǎng)基，24小時后挑取單菌落到20mlMRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時。按照2%的比例取菌液接種到IOOmlMRS液體培養(yǎng)基中靜置 培養(yǎng)12小時，向其中加入終濃度為25ug/ml的氨芐青霉素，繼續(xù)靜置培養(yǎng)3小時至OD值 =0. 5-0. 8。將上述培養(yǎng)液分裝至50ml離心管中，4°C，7000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上 清。將上述乳酸桿菌細(xì)胞沉淀每管用0. 5ml的4°C預(yù)冷的PEB溶液(蔗糖272mmol/L、 MgCl2O. 5mmol/L、KH2PO4O. 5mmol/L)清洗，在4°C，6500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，重復(fù)兩次。最 后每管用Iml預(yù)冷的PEB溶液，2ml 50%的甘油混勻后60 μ L/管進行分裝，即得到乳酸桿 菌的感受態(tài)細(xì)胞液，_80°C保存?zhèn)溆?。將連接產(chǎn)物加入乳酸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞溶液中，冰浴10分鐘。再轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電 極杯中，冰浴2分鐘。將電極杯置于電轉(zhuǎn)化儀(Eppendorf AG22331N0. 430830095)中，采 用2000V電壓電擊乳酸桿菌細(xì)胞溶液，時間為4ms。然后向上述電極杯中加入Iml 4°C預(yù)冷 的高滲MRS培養(yǎng)基?；靹蚝筠D(zhuǎn)移到離心管中37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時。然后，4°C、 1000轉(zhuǎn)離心30秒，去除部分上清，后吸取100 μ L的培養(yǎng)液到含65ug/ml的慶大霉素固體培 養(yǎng)基上涂布均勻后，42°C培養(yǎng)24小時篩選轉(zhuǎn)化子。(7)耐高溫、高糖的高產(chǎn)乳酸菌的篩選用牙簽挑取篩選得到的轉(zhuǎn)化子分別劃線至葡萄糖濃度為180g/L、乳酸濃度為 90g/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中均加入65ug/ml的慶大霉素。放置42°C進行篩選。將篩選到 的菌株再劃線至高糖平板上50°C _55°C，進行再篩選。將篩選得到的轉(zhuǎn)化子采用AxyPr印 質(zhì)粒小量試劑盒(購自愛思進生物技術(shù)有限公司)小量提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamHI、 HindIII進行雙酶切驗證，再以經(jīng)過酶切驗證后的質(zhì)粒為模板，以F-BamHI、R-HindIII為 引物進行PCR驗證，在50 μ L反應(yīng)體系中引物F-BamHI、R-HindIII濃度均為lpmol/ μ L ； dNTP 各 20pmol/ μ L ；Mg2+15pmol/μ L ；質(zhì)粒 DNA 為模板；Pfu DNA 聚合酶 2. 5U。PCR 擴增條 件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C 2min，進行 30 個循環(huán)；72°C IOmin0 將 PCR 產(chǎn) 物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三版，2002年版)，結(jié)果 顯示得到一條約1454bp的特異片段，與預(yù)期擴增的目的片段大小吻合。說明已經(jīng)成功獲得 含有重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌。實施例2本發(fā)明耐高溫、高糖的高產(chǎn)乳酸菌株的乳酸發(fā)酵a.活化菌株配制MRS培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基的組織成分是蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母粉5g/L，K2HP042g/L,檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫801mL， MgS04 · 7H20 0. 58g/L, MnS04. 4H20 0. 25g/L ；以 6mol/L 的 NaOH 調(diào) MRS 培養(yǎng)基 pH 值至 pH6. 8，于 121°C 滅菌 30min ；將保存的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCC NO :M2010094菌株接種至IOOmL的MRS培養(yǎng)基，于42°C、150rpm搖床中培養(yǎng)過夜，得 到活化菌株；b.種子制備將活化菌株按5-10% (ν/ν)接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，將其置于 42°C、150rpm搖床中培養(yǎng)16h，完成種子制備；c.發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基于121°C滅菌30min后冷卻到 50-550C ；再將制備好的種子按5-10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于50°C _55°C攪 拌轉(zhuǎn)速IOOrpm下發(fā)酵，發(fā)酵過程中以6mol/L的NaOH作為中和劑將發(fā)酵液中pH控制在 5. 5-6. 5 之間；頁 d.補料在發(fā)酵24h后，不斷補充葡萄糖使發(fā)酵體系中的糖含量維持在100-150g/ L,持續(xù)補糖24h,然后停止補糖，繼續(xù)發(fā)酵24至30h至殘?zhí)墙档偷絣g/L以下后停止發(fā)酵，得 L-乳酸。測定L-乳酸產(chǎn)量。乳酸終產(chǎn)量達(dá)到220g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%。
權(quán)利要求
一種發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，該方法是在培養(yǎng)基中通過微生物發(fā)酵來生產(chǎn)L-乳酸，其特征在于，所述的微生物是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCCNOM2010094。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為含高 糖的培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，所述的含高糖的培養(yǎng) 基的成分為葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵過程在 50 0C -55 °C之間進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，通過鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094 發(fā)酵來生產(chǎn) L-乳酸具體方法包括以 下步驟a.活化菌株配制MRS培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基pH值為6.0-7.0，于121 °C滅菌30min ； 將保存的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094菌株接種至 IOOmL的MRS培養(yǎng)基，于42°C、150rpm搖床中培養(yǎng)過夜，得到活化菌株；b.種子制備將活化菌株按5-10%(ν/ν)接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，將其置于42°C、 150rpm搖床中培養(yǎng)16h，完成種子制備；c.發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基于121°C滅菌30min后冷卻到 50-550C ；再將制備好的種子按5-10% (ν/ν)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于50°C _55°C攪 拌轉(zhuǎn)速IOOrpm下發(fā)酵，發(fā)酵過程中以6mol/L的NaOH作為中和劑將發(fā)酵液中pH控制在 5. 5-6. 5 之間；d.補料在發(fā)酵24h后，不斷補充葡萄糖使發(fā)酵體系中的糖含量維持在100-150g/L， 持續(xù)補糖24h，然后停止補糖，繼續(xù)發(fā)酵24至30h至殘?zhí)墙档偷絣g/L以下后停止發(fā)酵，得 L-乳酸。
6.一種L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌，其特征在于，該菌是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCC NO :M2010094。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，所述的MRS培養(yǎng)基的 組織成分是蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K2HP042g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉 5g/L,葡萄糖 20g/L，吐溫 801mL, MgSO4 · 7H20 0. 58g/L, MnSO4. 4H20 0. 25g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，步驟a中調(diào)節(jié)MRS培 養(yǎng)基PH值的具體方法是以6mol/L的NaOH調(diào)MRS培養(yǎng)基pH值至pH6. 8。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的 成分為葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。全文摘要
本發(fā)明提供了一種L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌和通過該生產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，本發(fā)明提供的L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)菌是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NOM2010094，具有耐高溫高糖的特性，可以大幅度提高L-乳酸的產(chǎn)量。
文檔編號C12P7/56GK101880696SQ20101022649
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者余龍江, 盧正東, 張力, 曾翔, 魯明波 申請人:華中科技大學(xué)