專利名稱：對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌O5型的wzt基因特異的核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核苷酸及其應(yīng)用，尤其涉及一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌血清型5型 (Legionella pneumophila serogroup 05)的 wzt (LPS O-抗原的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)子，ABC transporter of LPS 0-antigen,以下簡(jiǎn)稱wzt)基因特異的核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
軍團(tuán)菌最初是在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的，是一種的無(wú)芽胞革蘭氏陰性桿菌，對(duì)自然環(huán)境因素抵抗力較強(qiáng)，主要是引起呼吸道傳染疾病，可通過氣溶膠的方式在空氣中散布，人類會(huì)因?yàn)槲牒臍馊苣z而感染，引起軍團(tuán)病(Legionnaires disease, LD)。目前已知軍團(tuán)菌有52個(gè)種70多個(gè)血清型，能引起人類疾病的約有20種。常見的有嗜肺軍團(tuán)舊(XegionellapneumophiIa，LP )、米氏軍團(tuán)鬼{Legionella micdadei )> 博氏軍團(tuán)菌QLegionella bozemanii)、菲氏軍團(tuán)菌QLegionellafeeleii)、杜莫夫軍團(tuán)菌 (.Legionella)和長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌(Z6^io/ <977a Iongbeachae')等。其中嗜肺軍團(tuán)菌與人類疾病關(guān)系最為密切。根據(jù)O-抗原的不同，嗜肺軍團(tuán)菌可分為15個(gè)血清型。其中大約有70%的軍團(tuán)菌感染是由嗜肺軍團(tuán)菌01引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺軍團(tuán)菌導(dǎo)致約5-10%的軍團(tuán)菌感染。嗜肺軍團(tuán)菌為需氧革蘭陰性桿菌，兼性胞內(nèi)寄生菌，無(wú)莢膜，不產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，有一根至數(shù)根側(cè)鞭毛或端鞭毛，可運(yùn)動(dòng)，菌體長(zhǎng)2-50 μ m，寬0.5-1 μ m。該菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求較高，生長(zhǎng)時(shí)需要半胱氨酸，甲硫氨酸和鐵離子等，在活性炭-酵母浸出液瓊脂(BCYE)培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在GVPC平板上呈灰白色，邊緣有紫藍(lán)色光澤，挑起有拉絲；在含2.5 % -5.0 %的CO2環(huán)境中生長(zhǎng)很好，厭氧條件下不生長(zhǎng)。最適溫度為35 V - 36°C，具有一定的耐酸性和耐熱性菌落顏色一般呈灰白色、紫色、藍(lán)色或綠色，但在普通血平板、普通瓊脂或巧克力瓊脂上不生長(zhǎng)。嗜肺軍團(tuán)菌在普通自來(lái)水中可存活400天以上，在60°C左右甚至在火山口附近的水塘里都能發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌的蹤跡。我國(guó)報(bào)告的病例多是嗜肺軍團(tuán)菌血清01型、05型、06 型。在歐美各國(guó)嗜肺軍團(tuán)菌肺炎占肺炎病例中的2. 4 %-8.4 %。隨著分子技術(shù)特別是PCR技術(shù)的發(fā)展，許多分子生物學(xué)方法被用于軍團(tuán)菌分子分型和流行病學(xué)研究。目前已用于軍團(tuán)菌分型的4種常用分子分型技術(shù)為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)、核酸測(cè)序分型(Sequence-based typing, SBT)。由于其一次即可分離出大量DNA片段，且具有操作簡(jiǎn)便，重復(fù)率好等優(yōu)勢(shì)，先后用于軍團(tuán)菌分子分型和流行病學(xué)調(diào)查。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))作為微生物檢測(cè)的技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)增菌或增菌過程，再通過離心及裂解制備細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測(cè)樣品中是否含有待測(cè)的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過程僅需2個(gè)小時(shí)。這對(duì)檢驗(yàn)檢疫部門和臨床檢驗(yàn)無(wú)疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的wzt基因特異的核苷酸， 所述核苷酸為
O SEQ ID NO: I所示的核苷酸和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸；
2)與I)所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。上述核苷酸可以用于制備檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的wzt基因的PCR試劑盒、 基因芯片或微陣列；所述嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型可以取樣于自來(lái)水、礦泉水、空調(diào)冷卻水的培養(yǎng)物的粗提液，或是嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的純培養(yǎng)物的粗提液等。其中所述取樣于自來(lái)水、礦泉水、空調(diào)冷卻水培養(yǎng)物的嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型粗提液指的是采用常規(guī)方法制備獲得。其中所述嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的純培養(yǎng)物的粗提液指的是采用常規(guī)方法制備獲得。本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述 PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物優(yōu)選為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸。SEQ NO: I ATAATAAAGCAAGCCTTGAT特異擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的基因上游引物
SEQ NO: 2 TTCTGGATGAAAACCAGTC特異擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的wzt基因下游
引物
上述多重PCR檢測(cè)試劑盒可以包括如下試劑10 mM dNTP 20 μ L ; 10X酶特異性反應(yīng)緩沖液50 μ L ;5 U/μ L耐熱DNA聚合酶8 μ L ;引物各10 μ L ;陽(yáng)性對(duì)照品10 μ L，陰性對(duì)照 Ftn 10 μ L ； ddH20 5mL。上述針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的PCR試劑盒，整個(gè)檢測(cè)步驟包括樣品預(yù)處理一擴(kuò)增一電泳檢測(cè)結(jié)果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴(kuò)增管中，使用者只需將預(yù)處理后的樣本加入擴(kuò)增管啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)即可，簡(jiǎn)單快速的完成檢測(cè)工作。本發(fā)明還提供一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQ ID N0:1和/ 或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。本發(fā)明還提供一種微列陣，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸優(yōu)選為如SEQ ID NO: I和/或SEQ ID NO: 2所示的核苷酸。由上述的技術(shù)方案可見，本發(fā)明建立的一種PCR反應(yīng)體系，可檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型，該試劑盒有如下優(yōu)點(diǎn)
(I)方法簡(jiǎn)便，周期短、速度快、可操作性強(qiáng)本發(fā)明所配制的PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快、周期短，可操作性強(qiáng)，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻較低，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。本發(fā)明PCR試劑盒若用嗜肺軍團(tuán)菌5型的菌懸液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與經(jīng)提取得到的DNA
4作為模板擴(kuò)增所得結(jié)果一致，且敏感度和特異性無(wú)差別，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法得以簡(jiǎn)化。同時(shí)，相比常規(guī)生化檢測(cè)方法而言，本方法所采用的待測(cè)樣品可以直接是臨床樣品培養(yǎng)液，或者對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單分離培養(yǎng)就可進(jìn)行檢測(cè)，因而節(jié)省了物力人力。(2)檢測(cè)靈敏度高本發(fā)明提供的PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法敏感性高，檢測(cè)精度高，可以檢測(cè)到Ing/μ L的DNA模板。對(duì)常見致病菌可以進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測(cè)與鑒定。(3)檢測(cè)成本相對(duì)較低可以推廣應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域，并為其他不同致病菌檢測(cè)組合提供技術(shù)模式。(4)準(zhǔn)確性高本發(fā)明根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌05型的wzt基因的特異核苷酸序列，設(shè)計(jì)出引物。從而利用弓I物組合成復(fù)合PCR檢測(cè)體系，能夠直接將嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型和其他近源菌分開。


圖I為本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)結(jié)果圖，其中1為待測(cè)樣品，檢測(cè)到病原菌；Ρ為陽(yáng)性對(duì)照品；Ν為陰性對(duì)照品；Μ為DL2000 DNA marker ；
圖2為本發(fā)明試劑盒檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌其他血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌05型G3408 ;2，嗜肺軍團(tuán)菌02型G2773 ;3，嗜肺軍團(tuán)菌03型G2772 ;4，嗜肺軍團(tuán)菌 04型G2781 ;5，嗜肺軍團(tuán)菌01型G2756 ;6，嗜肺軍團(tuán)菌06型G2771 ;7，嗜肺軍團(tuán)菌07型 G3410 ;嗜肺軍團(tuán)菌08型G2820 ;9，嗜肺軍團(tuán)菌09型G2774 ;10，嗜肺軍團(tuán)菌010型G2818 ； 11，嗜肺軍團(tuán)菌011型G2824 ;12，嗜肺軍團(tuán)菌012型G2822 ; 13，嗜肺軍團(tuán)菌013型G2819 ； 14，嗜肺軍團(tuán)菌 014 型 G2817 ;15，嗜肺軍團(tuán)菌 015 型 G2829 ；M, DL2000 DNA marker ；
圖3為本發(fā)明試劑盒檢測(cè)軍團(tuán)菌屬非嗜肺軍團(tuán)菌電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌05 M G3408 ；2, Legionella anisa ；3, Legionella longbeachae ；4, Legionella micdadei ； 5, Legi onella wal ter si i ；6, Legi onella s tei gerwal ti i ；7, Legi onella bozemani i ；8, Legionella gormanii ；M, DL2000 DNA marker ；
圖4為本發(fā)明檢測(cè)軍團(tuán)菌屬臨床菌株電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌05型G3408; 2，嗜肺軍團(tuán)菌05型G2765 ;3，嗜肺軍團(tuán)菌I型G2759 ;4，嗜肺軍團(tuán)菌I型G2760 ;5，嗜肺軍團(tuán)菌2型G2761 ;6，嗜肺軍團(tuán)菌3型G2762 ;7，嗜肺軍團(tuán)菌7型G2763 ;8，嗜肺軍團(tuán)菌7型 G2764 ；M, DL2000 DNA marker ；
圖5為本發(fā)明試劑盒檢測(cè)其它種屬近源菌種標(biāo)準(zhǔn)菌株電泳結(jié)果圖，其中1，嗜肺軍團(tuán)菌 05 型 G3408 ；2, Salmonella ；3, Shigella. Dysenteriae ；4, Staphylococcus aureus ； 5, Yersinia en terocoli tica ；6, Pseudomon asaeruginosa ； 7, Aeromonas hydrophila ；M, DL2000 DNA marker
具體實(shí)施例方式
為保證本發(fā)明的上述和其它目的特征和優(yōu)點(diǎn)更明白易懂，下面特舉較佳實(shí)施例，同時(shí)結(jié)合說(shuō)明書附圖及具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例I :
基因組的提取
(I)在超凈工作臺(tái)中，從菌種保藏管中吸取少量菌液，劃線接種到軍團(tuán)菌BCYE生長(zhǎng)平板上，37。C，5. 0% CO2 培養(yǎng) 5-7 天；(2)向BCYE生長(zhǎng)平板中加入2mL無(wú)菌水，用無(wú)菌圓頭玻璃棒輕輕刮起菌苔，然后將菌懸液吸到I. 5mL離心管中，8000rpm離心5分鐘,棄上清,重復(fù)洗一次；
(3)加入250μ L 50mM Tris-HCl緩沖液(ρΗ8· O)重懸，12000rpm離心5分鐘，棄上清；
(4)加入250 μ L 50mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ8· O)重懸，再加 10 μ L O. 45Μ EDTA (ρΗ8. O)，充分懸浮，37°C溫浴20分鐘；
(5)加入10μ L 20mg/mL溶菌酶，37°C溫浴20分鐘；
(6)加入1.5yL20mg/mL蛋白酶K，輕柔混勻；
(7)加入15μ L 10%SDS, 50°C水浴2小時(shí)至溶液澄清，期間輕輕顛倒混勻若干次；
(8)力口2 μ L 20mg/mL RNAse，65°C水浴 30 分鐘；
(9)用剪去尖頭的槍頭將上述溶液移到新的潔凈離心管中；
(10)在通風(fēng)櫥中加入250μ L苯酚氯仿:異戊醇(25 24 :1)，充分混勻，12000rpm，4°C 離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，重復(fù)一次；
(11)在通風(fēng)櫥中加入250μ L氯仿:異戊醇(24 :1)，充分混勻，12000rpm，4°C離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管；
(12)加入2.5倍體積的提前預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕搖，于_80°C沉淀DNA。12000rpm，4°C 離心15min ；
(13)用lmL70%冰乙醇洗滌DNA沉淀，然后在65°C，IOmin烘干；
(14)用30 μ L TE溶解，并于-20 ° C冰箱備用。用I. O %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果，同時(shí)用NanoDrop2000 OD儀測(cè)量 DNA的純度和濃度。實(shí)施例2
引物的設(shè)計(jì)
嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的O抗原基因簇序列是本實(shí)驗(yàn)室自測(cè)的，通過比對(duì)分析，選取 wzt基因作為該菌的特異靶基因，針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌05型的wzt基因的特異區(qū)設(shè)計(jì)引物；如表I所示，上游引物是5’- ATAATAAAGCAAGCCTTGAT _3’，見序列SEQ ID NO: I ;下游引物是 5’ - TTCTGGATGAAAACCAGTC _3’，見序列 SEQ ID NO: 2。表I嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的特異引物序列
I腦稱引輕|編號(hào)SEQ IDmmi do_軍團(tuán)菌05 I 型P-INO: IATMTAMGCMCCCTTCATP-2NO: 2TTCTCGATGMMCCAGTC
實(shí)施例3
特異引物的篩選
收集了 I株嗜肺軍團(tuán)菌05型標(biāo)準(zhǔn)菌株，14株嗜肺軍團(tuán)菌其它血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株、7株軍團(tuán)菌屬其他菌株、I株嗜肺軍團(tuán)菌05型臨床分離株、6株軍團(tuán)菌屬其它血清型臨床分離株以及6株近緣菌驗(yàn)證引物的特異性，菌株編號(hào)和來(lái)源見下表2。表2供試的標(biāo)準(zhǔn)菌株
權(quán)利要求
1.一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的WZt基因特異的核苷酸，其特征在于所述核苷酸具有1)SEQ ID NO :I所示的核苷酸和/或SEQ ID NO :2所示的核苷酸；2)與I)所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。
2.—種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
3.權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中的SEQNO: I ATAATAAAGCAAGCCTTGAT為特異擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的wzt基因上游引物；SEQ NO:2 TTCTGGATGAAAACCAGTC為特異擴(kuò)增嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型的wzt基因下游引物。
4.權(quán)利要求I所述的試劑盒，還包括如下試劑10mM dNTP 20 μ L ；10Χ酶特異性反應(yīng)緩沖液50yL;5 U/μ L耐熱DNA聚合酶8 μ L ;引物Pl和Ρ2各10 μ L ;陽(yáng)性對(duì)照品 10 μ L,陰性對(duì)照品 10 μ L ;ddH20 5mL。
5.一種基因芯片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括如SEQ ID N0:1和/或SEQ ID N0:2所示的核苷酸。
6.權(quán)利要求I所述PCR試劑盒在制備用于檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌血清型05型方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌血清型O5型的wzt基因特異的核苷酸及其應(yīng)用，所述核苷酸為SEQIDNO:1所示的核苷酸和/或SEQIDNO:2所示的核苷酸；與上述的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。這些核苷酸可用于制備檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌血清型O5型的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列。本發(fā)明的對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌血清型O5型的wzt基因特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列的實(shí)用性強(qiáng)，PCR試劑盒配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，易于商品化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低；準(zhǔn)確性高；靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102604945SQ201210105278
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者馮露, 周光朋, 姚芳芳, 曹勃陽(yáng), 王磊, 高旗利 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司