專利名稱：：基于酵母的對慢性丙型肝炎感染的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及用于對動物進(jìn)行抗丙型肝炎病毒(HCV)免疫接種以及治療或預(yù)防動物中丙型肝炎病毒感染的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(HCV)是全世界范圍內(nèi)急慢性肝炎的一種主要致病因素。據(jù)估計全世界有二億慢性HCV感染個體，其中有四百萬居住在美國。最重要的感染源是通過胃腸外途徑，包括輸血和靜脈吸毒(IVdruguse)。雖然當(dāng)前血庫操作步驟的安全性很高，但感染率仍繼續(xù)增長，這可能是靜脈吸毒或其它形式的暴露所導(dǎo)致的。根據(jù)來自第三次國家健康和營養(yǎng)普查(ThirdNationalHealthandNutritionExaminationSurvey，NHANESIII)的數(shù)據(jù)，美國HCV感染患者中有約70%將成為慢性感染者。慢性感染個體中有相當(dāng)一部分將遭受慢性HCV感染的嚴(yán)重后果，包括發(fā)展為肝硬化，肝代償失調(diào)，肝移植，肝細(xì)胞癌，及死亡。對HCV慢性感染患者進(jìn)行的回顧性長期隨訪研究估計，發(fā)展為肝硬化的比例約20%到50%，其中隨訪時間為10到29年(1-4)。對經(jīng)過輸血后暴露(post-transfusionexposure)的HCV慢性感染患者進(jìn)行的回顧性長期隨訪研究估計，發(fā)展為肝硬化的比例約10%到15%，其中隨訪時間相對較短，為8到16年(5-8)。對于病毒感染繼發(fā)肝硬化的患者，預(yù)計每年有約1%到3%會發(fā)生肝細(xì)胞癌，每年的死亡率約為2%到6%(9-10)。一種使用NHANESIII血清流行病學(xué)數(shù)據(jù)和年齡特異性發(fā)病率流行病學(xué)模型估計，最遲到2015年，美國人群中發(fā)展為肝硬化和相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險將出現(xiàn)峰值，這預(yù)示著不久的將來將出現(xiàn)更加嚴(yán)重的未得到滿足的醫(yī)療需求(11)。已經(jīng)在數(shù)個大系列中顯示，使用基于抗生素的治療方案阻斷慢性病毒感染可有益地改變向肝硬化、肝細(xì)胞癌和死亡發(fā)展的速率(12-14)。使用包含利巴韋林(ribavirin)的聚乙二醇化干擾素-α方案治療慢性丙型肝炎基因型I(在美國出現(xiàn)的主要基因型)，持續(xù)病毒應(yīng)答率只有約50%。另外，基于干擾素加利巴韋林的方案還有顯著的安全問題，包括抑郁，自殺觀念，類似流行性感冒的癥狀，以及中性粒細(xì)胞減少。對于基于干擾素的療法的部分反應(yīng)者(partialresponder),復(fù)發(fā)者(relapsers)和無反應(yīng)者(non-responders)而言，目前治療選項是有限的。HCV是帶包膜的正鏈RNA病毒黃病毒(Flaviviridae)科的成員。其基因組具有約9600個核苷酸，在進(jìn)入細(xì)胞時翻譯為約3000個氨基酸的多聚蛋白。由來源于細(xì)胞和HCV的蛋白酶共翻譯地和翻譯后產(chǎn)生3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(表I)。雖然某些病毒蛋白的作用還沒有清楚地確定，已經(jīng)知道其中的一些，例如HCV結(jié)構(gòu)Core蛋白，El和E2表面糖蛋白，非結(jié)構(gòu)性的NS2和NS3蛋白酶及NS5BRNA依賴的RNA聚合酶在HCV的生命周期中起關(guān)鍵作用。根據(jù)已分離的病毒基因組的遺傳異質(zhì)性，HCV具有6種主要的基因型和多于100種亞型。基因型la，Ib和2主要在北美和歐洲發(fā)現(xiàn)，而在南美，普遍的HCV基因型是la，Ib和3。基因型4，5和6在世界其它所有地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)(19)。雖然某些HCV基因型具有地域性優(yōu)勢，但由于人群遷移的增加，大多數(shù)基因型已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)被確認(rèn)。對于目前被推薦的干擾素/利巴韋林療法，這些不同的基因型的反應(yīng)有差異。特別地，當(dāng)前的治療方案對50%的被HCV基因型I感染的患者無效(19)。具非洲血統(tǒng)的美國人(African-American)對干擾素α的反應(yīng)率低于高加索人種后裔。這些數(shù)據(jù)提示需要作為選擇的治療手段，其理想地增強(qiáng)個體已有的細(xì)胞免疫應(yīng)答。表1.HCV基因和基因產(chǎn)物基因功能HCV基因型Ia和Ib之間的同源性Core核殼體Core蛋白98.4~~El包膜糖蛋白8L8包膜糖蛋白79Γ9P7離子通道81.0NS2金屬蛋白酶8(ΠNS3蛋白酶/解旋酶92ΛNS4aNS3蛋白酶輔因子θΤΤNS4b82ΛNS5aTL!NS5bRNA依賴性RNA聚合酶875HCV蛋白序列獲自國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)，登錄號為AFOl1753(gi:2327074)。使用Genstream生物信息學(xué)站點(InsitutdeGenetiqueHumaine,141ruedelaCardonille,MontpellierFrance)白勺Align程序比較來自Ia和Ib株的HCV蛋白的氨基酸序列。許多研究提示，在HCV感染的個體中，病毒復(fù)制、病毒血(viremia)水平和向慢性狀態(tài)的發(fā)展，直接和間接地受⑶4+T輔助淋巴細(xì)胞(Th)和⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)所介導(dǎo)的、針對結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性病毒蛋白，包括Core和NS3的HCV特異性細(xì)胞免疫的影響(15)。慢性HCV感染的人中其它HCV基因型的超感染的出現(xiàn)進(jìn)一步暗示了這些人缺乏有效的免疫。已有人提出細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)健性(robustness)和廣泛性(breadth)影響HCV感染的自然病程，因此，開發(fā)在暴露于病毒的個體中刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫治療產(chǎn)品具有十分重要的意義。對人類和黑猩猩進(jìn)行的研究顯示，HCV可以在血液和肝臟中發(fā)生⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答之前繁殖數(shù)周。另外，CD8+細(xì)胞(可能還有CD4+細(xì)胞)功能的獲得可能存在延遲，即使在它們在血液中擴(kuò)增之后(15)。功能性CD8+細(xì)胞的出現(xiàn)在動力學(xué)上與病毒血相關(guān)聯(lián)，在某些情況下，還與血清轉(zhuǎn)氨酶的上升相關(guān)聯(lián)，提示急性丙型肝炎中的肝臟損害是免疫性的。血液、肝臟或兩者中均沒有產(chǎn)生可檢測的病毒特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的個體遭受持續(xù)性HCV感染的風(fēng)險最高?？赡茏钪匾氖?，細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生并不一定保證感染會被永久性地控制。CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答必須在病毒復(fù)制的表觀控制時點之后持續(xù)數(shù)周或數(shù)月，以防止復(fù)發(fā)和持續(xù)性感染的確立。CD4+T細(xì)胞為CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的活化和持續(xù)提供輔助，從而在抗-HCV免疫中扮演重要角色。保護(hù)性⑶4+T細(xì)胞似乎主要識別Core、NS3、NS4和NS5蛋白中的表位，雖然針對其它HCV基因產(chǎn)物的應(yīng)答也有報道(20-21)。除了⑶4+T細(xì)胞對⑶8+T細(xì)胞提供的輔助以外，看起來關(guān)鍵的是它們產(chǎn)生Y干擾素以及其它促炎性Th-I而非TH2型細(xì)胞因子。對于控制慢性感染而言，HCV特異性記憶⑶4+T細(xì)胞的建立是同等重要的(20及22)。⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答對自限性HCV感染而言是普遍的，這一發(fā)現(xiàn)暗示它們協(xié)同作用以實現(xiàn)對病毒血的控制。在黑猩猩，可能還有人類中，急性resolving丙型肝炎感染過程中初次接觸抗原的(primed)記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞提供針對病毒持續(xù)感染的長期保護(hù)。通過抗體介導(dǎo)的各種記憶T細(xì)胞亞群的排除(cbpletion)，黑猩猩模型為⑶8+T細(xì)胞在急性丙型肝炎的控制中的重要性以及它們對CD4+T細(xì)胞輔助的依賴性提供了直接證據(jù)(24)。與⑶4+T細(xì)胞相反，急性和記憶⑶8+T細(xì)胞似乎同等地識別所有的HCV細(xì)胞，并且，象⑶4+T那樣，可能關(guān)鍵的是它們能產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，包括Y干擾素(15)。急性到慢性HCV感染的轉(zhuǎn)變伴隨著HCV特異性⑶4+T細(xì)胞的顯著喪失，這些細(xì)胞在宿主的生命過程中似乎不會恢復(fù)。CD8+T細(xì)胞活性也被損害，因為其不足以消減感染。人們已經(jīng)對多種免疫治療的實驗途徑進(jìn)行了研究，包括基于DNA、重組病毒和自身樹突狀細(xì)胞的策略。DNA疫苗可以很好地初次激發(fā)人體中的免疫應(yīng)答，但加強(qiáng)免疫的效果差。相對地，重組病毒加強(qiáng)免疫的效果較好，但受到載體中和(vectorneutralization)的限制。最后，基于樹突狀細(xì)胞的疫苗具有患者特異性，而且勞動量大。因此，本領(lǐng)域中對于有效的抗HCV免疫治療方法的仍然存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方式涉及一種疫苗，其包含a)酵母媒介物jPb)HCV融合蛋白，其中該酵母媒介物重組表達(dá)該融合蛋白。所述HCV融合蛋白可以選自任何下述的HCV融合蛋白，其中特別優(yōu)選包含相互連接的至少一部分HCVNS3蛋白酶和至少一部分HCVCore序列的HCV融合蛋白。因此，在一個方面中，所述HCV融合蛋白包含相互連接的至少一部分HCVNS3蛋白酶和至少一部分HCVCore序列。優(yōu)選地，該HCVNS3蛋白酶缺少天然HCVNS3蛋白酶的催化域。在一個方面中，該HCVNS3蛋白酶基本上由全長NS3蛋白中最先的N端88個氨基酸之后的262個HCVNS3氨基酸(對于SEQIDNO:20為1115到1376位)組成。在一個方面中，HCVCore的疏水C端序列被截短。在一個方面中，HCVCore序列基本上由全長HCVCore序列第2到140位氨基酸(對于SEQIDNO20為2到140位)構(gòu)成。在另一個方面中，HCVCore序列添加并包含了兩個氨基酸谷氨酸和天冬氨酸。在另一個方面中，HCVCore序列添加并包含了氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H-H(SEQIDN0:10)。在一個方面中，HCVNS3蛋白酶在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDN0:2組成。在另一個方面中，所述融合蛋白包含全長的、失活的HCVNS3蛋白。在一個方面中，HCVNS3蛋白包含突變，該突變對于SEQIDNO:20而言在HCV多聚蛋白序列1165位殘基處，造成該蛋白質(zhì)的蛋白水解活性的失活。在另一個方面，所述HCVNS3蛋白酶在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDNO4組成。在另一方面中，所述融合蛋白包含相互融合的截短的HCVEl蛋白和截短的HCVE2蛋白。在一個方面中，截短的HCVEl蛋白基本上由HCVEl的氨基酸I到156(對于SEQIDNO:20為192到347位)組成。在一個方面中，截短的HCVE2蛋白基本上由HCVE2的氨基酸I到334(對于SEQIDNO:20為384到717位)組成。在一個方面中，所述截短的HCVEl蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDNO:6組成。在另一方面中，所述融合蛋白包含缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白。在一個方面中，所述缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白基本上由相互連接的HCVNS4b氨基酸I到69(對SEQIDNO20而言為1712到1780位)和HCVNS4b氨基酸177到261(對SEQIDNO20而言為1888到1972位)組成。在另一個方面中，所述缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDNO8組成。在另一方面中，所述融合蛋白包含全長HCVCore蛋白、全長HCVEl蛋白和全長HCVE2蛋白，其中全長HCVCore蛋白與全長HCVEl蛋白融合，全長HCVEl蛋白與全長HCVE2蛋白融合。在一個方面中，所述全長HCVCore蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDN0:12組成。在另一方面中，所述融合蛋白包含截短的HCVCore蛋白，其與缺失跨膜域的HCVEl蛋白及缺失跨膜域的HCVE2蛋白融合。在一個方面中，截短的HCVCore蛋白基本上由HCVCore蛋白2到140位(對于SEQIDNO20而言為2到140位)組成。在另一方面中，缺失跨膜域的HCVEl蛋白基本上由HCVEl蛋白I到156位(對于SEQIDNO20而言為192到347位)組成。在另一方面中，缺失跨膜域的HCVE2蛋白基本上由HCVE2蛋白I到334位(對于SEQIDNO:20而言為384到717位)組成。在另一方面中，截短的HCVCore蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDN0:14組成。在另一方面中，所述融合蛋白包含HCVNS3、HCVNS4a和HCVNS4b，其中HCVNS3與HCVNS4a融合，HCVNS4a與HCVNS4b融合，其中HCVNS3蛋白酶失活，且HCVN24b缺少跨膜域。在一個方面中，HCVNS3蛋白基本上由HCVHS3的I到631位(對SEQIDNO20而言為1027到1657位)組成，其中對SEQIDNO20而言的1165位上的絲氨酸被丙氨酸取代以使該蛋白酶失活。在一個方面中，HCVNS4a蛋白基本上由HCVNS4a蛋白的I到54位(對SEQIDNO20而言為635到691位)組成。在另一個方面中，HCVNS4b蛋白基本上由相互融合的HCVNS4b的I到69位(對SEQIDNO20而言為1712到1780位)及HCVNS4b的177到261位(對SEQIDNO20而言為1888到1972位)組成。在另一個方面中，HCVNS3蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，所述融合蛋白基本上由SEQIDN0:16組成。在另一方面中，所述融合蛋白包含相互融合的HCVNS5a蛋白和HCVNS5b蛋白，其中NS5b蛋白包含NS5bC端的失活性缺失。在一個方面中，HCVNS5a蛋白基本上由HCVNS5a的I到448(對SEQIDNO:20而言為1973到2420位)組成。在一個方面中，HCVNS5b蛋白基本上由HCVNS5b的I到539(對SEQIDNO20而言為2421到2959位)組成。在另一個方面中，HCVNS5a蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。在另一個方面中，融合蛋白基本上由SEQIDNO:18組成。在一個實施方式中，所述融合蛋白的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動子，例如CUPl的控制。本發(fā)明的另一個實施方式涉及分離的HCV融合蛋白，其中該HCV蛋白是任何上述的蛋白，尤其是選自下列SEQIDNO2,SEQIDNO:4，SEQIDNO6,SEQIDNO8,SEQIDNO12,SEQIDNO14,SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。本發(fā)明的另一個實施方式涉及分離的核酸分子，其包含編碼上述任意融合蛋白的核酸序列。在一個實施方式中，所述融合蛋白的表達(dá)受誘導(dǎo)性啟動子，例如CUPl的控制。本發(fā)明的另一個實施方式涉及包含任何這樣的分離核酸分子的重組核酸分子。在一個實施方式中，所述重組核酸分子是病毒載體。本發(fā)明的另一個實施方式涉及被任何本文所述的重組核酸分子轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞，這樣的細(xì)胞可包括，但不限于腫瘤細(xì)胞或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種疫苗，其包含(a)如上所述的HCV融合蛋白；(b)藥學(xué)可接受的載體(carrier)。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種疫苗，其包含(a)樹突狀細(xì)胞；及(b)如上所述的HCV融合蛋白。這樣的疫苗還可包含酵母媒介物(vehicle)，其中所述樹突狀細(xì)胞也包含該酵母媒介物。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種疫苗，其包含編碼如上所述的HCV融合蛋白的分尚的核酸分子。包括本發(fā)明的分離的HCV融合蛋白的上述任何本發(fā)明的疫苗可以包含至少一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。這樣的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑可以包括，但不限于，細(xì)胞因子、激素、脂質(zhì)衍生物、及小分子藥物。這樣的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑可包括，但不限于抗-CTLA-4、抗-⑶137、抗-CD28、抗-CD40、alemtuzumab、denileukindiftitox、抗-CD4、抗-CD25、抗-PDI、抗-PD-LI、抗-PD-L2、F0XP3組滯劑、Flt-3配體、咪喹莫特(imiquimod)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、沙格斯廷(sargramostim)、Toll樣受體(TLR)_7激動劑和TLR-9激動劑。本發(fā)明的另一個實施方式涉及保護(hù)動物抗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括對已感染HCV或有感染HCV風(fēng)險的動物施用本文所述的任何本發(fā)明的疫苗，其中對該動物施用所述疫苗減少或防止該動物中的HCV感染或HCV感染導(dǎo)致的至少一種癥狀。本發(fā)明的另一個實施方式涉及引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法，包括對動物施用本文所述的任何本發(fā)明的疫苗。本發(fā)明的另一個實施方式涉及在已感染HCV的一群個體中引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法，包括對該群體的個體施用任何上述的疫苗。本發(fā)明的另一個實施方式涉及對有感染HCV風(fēng)險的一群個體進(jìn)行抗HCV免疫的方法，包括對該群體的個體施用上述的任何疫苗。在上述任何方法中，所述疫苗可作為包含編碼HCV抗原的病毒載體的疫苗的加強(qiáng)劑來施用。在上述任何方法中，可以施用所述疫苗對免疫系統(tǒng)進(jìn)行初次免疫，然后用不同的HCV疫苗加強(qiáng)免疫。本發(fā)明另一個實施方式涉及上述任何疫苗在保護(hù)動物抗HCV感染的制劑中的用途。本發(fā)明的另一個實施方式涉及上述任何疫苗在引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的制劑中的用途。本發(fā)明的另一個實施方式涉及上述任何疫苗在治療或預(yù)防疾病或癥候的制劑中的用途。本發(fā)明的另一個實施方式涉及上述任何疫苗在用于免疫有感染HCV風(fēng)險的一群個體的制劑中的用途。本發(fā)明的另一個實施方式涉及上述任何疫苗在用于治療感染了HCV的一群個體的制劑中的用途。本發(fā)明涉及下述各項。I.一種疫苗，包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含相互連接的至少一部分HCVNS3蛋白酶和至少一部分HCVCore序列。2.項I的疫苗，其中所述HCVNS3蛋白酶缺少天然HCVNS3蛋白酶的催化域。3.項I的疫苗，其中所述HCVNS3蛋白酶基本上由全長NS3蛋白中最先的N端88個氨基酸之后的262個HCVS3氨基酸(對于SEQIDNO:20為1115到1376位)構(gòu)成。4.項I的疫苗，其中HCVCore的疏水C端序列被截短。5.項5的疫苗，其中HCVCore基本上由全長HCVCore序列第2到140位氨基酸(對于SEQIDNO:20為2到140位)構(gòu)成。6.項I的疫苗，其中HCVCore序列添加并包含了兩個氨基酸谷氨酸和天冬氨酸。7.項I的疫苗，其中HCVCore序列添加并包含了氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H(SEQIDNO10)。8.項I的疫苗，其中所述HCVNS3蛋白酶在其N端與SEQIDNO9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。9.項I的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO2組成。10.—種疫苗，其包含a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含全長且失活的HCVNS3蛋白。11.項10的疫苗，其中所述HCVNS3蛋白包含突變，該突變對于SEQIDNO20而言在HCV多聚蛋白序列1165位殘基處，該突變造成該蛋白質(zhì)的蛋白水解活性的失活。12.項10的疫苗，其中所述HCVNS3蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。13.項10的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO4組成。14.一種疫苗,其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含相互融合的截短的HCVEl蛋白和截短的HCVE2蛋白。15.項14的疫苗，其中截短的HCVEl蛋白基本上由HCVEl的氨基酸I到156(對于SEQIDNO:20為192到347位)組成。16.項14的疫苗，其中截短的HCVE2蛋白基本上由HCVE2的氨基酸I到334(對于SEQIDNO20為384到717位)組成。17.項14的疫苗，其中所述HCVEl蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。18.項14的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO6組成。19.一種疫苗,其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白。20.項19的疫苗，其中所述缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白基本上由相互連接的HCVNS4b氨基酸I到69(對SEQIDNO20而言為1712到1780位)和HCVNS4b氨基酸177到261(對SEQIDNO20而言為1888到1972位)組成。21.項19的疫苗，其中所述缺失跨膜域的HCVNS4b蛋白在其N端與SEQIDNO9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。22.項19的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO8組成。23.一種疫苗,其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含全長HCVCore蛋白、全長HCVEl蛋白和全長HCVE2蛋白，其中全長HCVCore蛋白與全長HCVEl蛋白融合，全長HCVEl蛋白與全長HCVE2蛋白融合。24.項23的疫苗，其中全長HCVCore蛋白在其N端與SEQIDNO9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。25.項23的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO12組成。26.—種疫苗，其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含截短的HCVCore蛋白，該截短的HCVCore蛋白與缺失跨膜域的HCVEl蛋白及缺失跨膜域的HCVE2蛋白融合。27.項26的疫苗，其中截短的HCVCore蛋白基本上由HCVCore蛋白2到140位(對于SEQIDNO20而言為2到140位)組成。28.項26的疫苗，其中缺失跨膜域的HCVEl蛋白基本上由HCVEl蛋白I到156位(對于SEQIDNO20而言為192到347位)組成。29.項26的疫苗，其中缺失跨膜域的HCVE2蛋白基本上由HCVE2蛋白I到334位(對于SEQIDNO20而言為384到717位)組成。30.項26的疫苗，其中截短的HCVCore蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。31.項26的疫苗，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO14組成。32.—種疫苗，其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含HCVNS3、HCVNS4a和HCVNS4b，且HCVNS3與HCVNS4a融合，HCVNS4a與HCVNS4b融合，其中HCVNS3失活，且HCVN24b缺少跨膜域。33.項32的疫苗，其中HCVNS3蛋白基本上由HCVHS3的I到631位(對SEQIDNO20而言為1027到1657位)組成，其中對SEQIDNO20而言的1165位上的絲氨酸被丙氨酸取代以使該蛋白酶失活。34.項32的疫苗，其中HCVNS4a蛋白基本上由HCVNS4a蛋白的I到54位(對SEQIDNO20而言為635到691位)組成。35.項32的疫苗，其中HCVNS4b蛋白基本上由相互融合的HCVNS4b的I到69位(對SEQIDNO20而言為1712到1780位)及HCVNS4b的177到261位(對SEQIDNO20而言為1888到1972位)組成。36.項32的疫苗，其中HCVNS3蛋白在其N端與SEQIDNO9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。37.項32的疫苗，其中融合蛋白基本上由SEQIDNO16組成。38.一種疫苗,其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含相互融合的HCVNS5a蛋白和HCVNS5b蛋白，其中NS5b蛋白包含NS5bC端的失活性缺失。39.項38的疫苗，其中HCVNS5a蛋白基本上由HCVNS5a的l到448(對SEQIDNO:20而言為1973到2420位)組成。40.項38的疫苗，其中HCVNS5b蛋白基本上由HCVNS5b的I到539(對SEQIDNO20而言為2421到2959位)組成。41.項38的疫苗，其中HCVNS5a蛋白在其N端與SEQIDNO:9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。42.項38的疫苗，其中融合蛋白基本上由SEQIDNO18組成。43.項I到42任一項的疫苗，其中所述融合蛋白的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動子的控制。44.項43的疫苗，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是CUP1。45.項I到42任一項的疫苗，其中所述疫苗還包括樹突狀細(xì)胞，其中該樹突狀細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)裝載了重組表達(dá)HCV融合蛋白的所述酵母媒介物。46.項I到45任一項的疫苗，還包括至少一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。47.項46的疫苗，其中所述生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑選自下組細(xì)胞因子、激素、脂質(zhì)衍生物和小分子藥物。48.項46的疫苗，其中所述生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑選自下組抗-CTLA-4、抗-⑶137、抗-CD28、抗-CD40、alemtuzumab、denileukindiftitox、抗-CD4、抗-CD25、抗-PD1>抗-PD-Ll、抗-PD-L2、F0XP3組滯劑、Flt_3配體、咪喹莫特、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、沙格斯廷、Toll樣受體(TLR)-7激動劑和TLR-9激動劑。49.項I到48任一項的疫苗在保護(hù)動物抗HCV感染的制劑中的用途。50.項I到48任一項的疫苗在引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的制劑中的用途。51.項I到48任一項的疫苗在治療或預(yù)防疾病或癥候的制劑中的用途。52.項I到48任一項的疫苗在用于免疫有感染HCV風(fēng)險的一群個體的制劑中的用途。53.項I到48任一項的疫苗在用于治療感染了HCV的一群個體的制劑中的用途。54.保護(hù)動物抗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括對已感染HCV或有感染HCV風(fēng)險的動物施用項I到48任一項的疫苗,其中對該動物施用所述疫苗減少或防止該動物中的HCV感染或HCV感染導(dǎo)致的至少一種癥狀。55.引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法，包括對動物使用項I到48任一項的疫苗。56.在已感染HCV的一群個體中引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法，包括對該群體的個體施用項I到48任一項的疫苗。57.對有感染HCV風(fēng)險的一群個體進(jìn)行抗HCV免疫的方法，包括對所述群體的個體施用項I到48任一項的疫苗。58.項53到57任一項的方法，其中所述疫苗作為對包含編碼HCV抗原的病毒載體的疫苗的加強(qiáng)劑來施用。59.項53到57任一項的方法，其中施用所述疫苗來對免疫系統(tǒng)進(jìn)行初次免疫，然后用不同的HCV抗原加強(qiáng)免疫。60.一種分離的HCV融合蛋白，包括相互連接的至少一部分HCVNS3蛋白酶和至少一部分HCVCore序列，其中該HCVNS3蛋白酶缺少天然HCVNS3蛋白酶的催化域。61.項60的分離的融合蛋白，其中所述HCVNS3蛋白酶基本上由全長NS3蛋白中最先的N端88個氨基酸之后的262個HCVNS3氨基酸(對于SEQIDNO:20為1115到1376位)構(gòu)成。62.項60的分離的融合蛋白，其中HCVCore的疏水C端序列被截短。63.項62的分離的融合蛋白，其中HCVCore基本上由全長HCVCore序列第2到140位氨基酸(對于SEQIDNO:20為2到140位)構(gòu)成。64.項60的分離的融合蛋白，其中HCVCore序列添加并包含了兩個氨基酸谷氨酸和天冬氨酸。65.項60的分離的融合蛋白，其中HCVCore序列添加并包含了氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H-H(SEQIDNO:10)。66.項60的分離的融合蛋白，其中所述HCVNS3蛋白酶在其N端與SEQIDNO9所示的氨基酸序列(MADEAP)連接。67.項60的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白基本上由SEQIDNO2組成。68.一種分離的融合蛋白，該蛋白被基本上由選自下組的核酸序列組成的核酸序列所編碼SEQIDNO4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO16和SEQIDNO:18。69.一種分離的核酸分子，其包含編碼項60到68任一項的融合蛋白的核酸序列。70.一種重組核酸分子，其包含項69的分離的核酸分子。71.項70的重組核酸分子,其是病毒載體。72.被項71的重組核酸分子轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞。73.項72的重組細(xì)胞，其中該細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。74.項72的重組細(xì)胞，其中該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。75.—種疫苗，其包括a)項60到68任一項的HCV融合蛋白；和b)藥學(xué)可接受的載體。76.一種疫苗，其包含編碼項60到68任一項的HCV融合蛋白的分離的核酸分子。77.項60到68任一項的疫苗在保護(hù)動物抗HCV感染的制劑中的用途。78.項60到68任一項的疫苗在引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的制劑中的用途。79.項60到68任一項的疫苗在用于免疫有感染HCV風(fēng)險的一群個體的制劑中的用途。80.項60到68任一項的疫苗在用于治療感染了HCV的一群個體的制劑中的用途。81.保護(hù)動物抗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，包括對已感染HCV或有感染HCV風(fēng)險的動物施用項60到68任一項的疫苗,其中對該動物施用所述疫苗減少或防止該動物中的HCV感染或HCV感染導(dǎo)致的至少一種癥狀。82.引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法，包括對動物施用項60到68任一項的疫苗。83.在已感染HCV的一群個體中引起針對HCV抗原的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法，包括對該群體的個體施用項60到68任一項的疫苗。84.對有感染HCV風(fēng)險的一群個體進(jìn)行抗HCV免疫的方法，包括對所述群體的個體施用項60到68任一項的疫苗。圖IA和IB是Western印跡(圖1A)和Coomassie染色(圖1B)的數(shù)字圖像，顯示截短的NS3-Core融合蛋白和失活的HCVNS3融合蛋白在本發(fā)明酵母媒介物中的表達(dá)。圖IC是Western印跡的數(shù)字圖像，顯示截短的HCVE1-E2融合蛋白在本發(fā)明的酵母媒介物中的表達(dá)。圖ID是Western印跡的數(shù)字圖像，顯示跨膜(TM)域缺失的HCVNS4b融合蛋白在本發(fā)明的酵母媒介物中的表達(dá)。圖2說明表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)NS3-和Core-特異性淋巴細(xì)胞增殖。圖3A-3C說明表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)NS3-特異性細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞。圖4顯示表達(dá)截短的NS3-C0re融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞，該細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞殺滅感染了編碼HCVNS3或Core的重組痘苗病毒的腫瘤細(xì)胞。圖5是顯示表達(dá)截短的NS3-Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子。圖6是顯示用表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗按每周一次進(jìn)行一次，兩次，或三次免疫所誘導(dǎo)的增殖的淋巴細(xì)胞。圖7A-7D顯示用表達(dá)截短的NS3-C0re融合蛋白的本發(fā)明的疫苗按每周一次進(jìn)行一次，兩次，或三次免疫所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性。圖8A和8B顯示用表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗按每周一次進(jìn)行一次，兩次，或三次免疫所誘導(dǎo)的酵母特異性促炎細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。圖9顯示從根據(jù)不同的免疫程序用表達(dá)截短的NS3-Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗免疫并加強(qiáng)免疫的BALB/c小鼠獲得的脾細(xì)胞中淋巴細(xì)胞增殖。圖10是顯示從根據(jù)不同的免疫程序用表達(dá)截短的NS3-Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗免疫并加強(qiáng)免疫的BALB/c小鼠獲得的脾效應(yīng)細(xì)胞中細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性的圖。圖IlA和IlB顯示用表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答的持續(xù)性。圖12A和12B顯示用表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的持續(xù)時間。圖13A-13D顯示用表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)的酵母和NS3特異性細(xì)胞因子分泌細(xì)胞持續(xù)時間。圖14A-14I顯示用表達(dá)不同量的截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性。圖15A-15C顯不用表達(dá)不同量的截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。圖16顯示用表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白或失活的HCVNS3蛋白酶融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)BALB/c小鼠中針對表達(dá)HCVNS3的同基因腫瘤細(xì)胞攻擊的保護(hù)性免疫。圖17顯示表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)C57BL/6小鼠中針對表達(dá)HCVNS3的同基因腫瘤細(xì)胞攻擊的保護(hù)性免疫。圖18顯示來自“被保護(hù)的”小鼠的脾細(xì)胞中淋巴細(xì)胞增殖活性。圖19顯示來自“被保護(hù)的”小鼠的脾細(xì)胞中細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性。圖20顯示表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗在從幼稚荷瘤小鼠分離的脾細(xì)胞中刺激細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性。圖21顯示表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗在攜帶表達(dá)HCVNS3的同基因B細(xì)胞淋巴瘤的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)治療性免疫。圖22A和22B顯示表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗在攜帶表達(dá)HCVNS3的同基因B細(xì)胞淋巴瘤的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)治療性免疫。圖23A和23B顯示表達(dá)截短的NS3_Core融合蛋白的本發(fā)明的疫苗在雄性和雌性新西蘭大白兔中誘導(dǎo)酵母特異性淋巴細(xì)胞增殖。發(fā)明詳述本發(fā)明一般性地涉及用于接種動物以抗丙型肝炎病毒(HCV)和用于治療或預(yù)防動物中丙型肝炎病毒感染的組合物和方法。本發(fā)明包括使用具體的基于酵母的疫苗，該疫苗包含酵母媒介物和HCV抗原融合蛋白，該蛋白被選出用于引起動物中針對HCV感染的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還包括本文所描述的HCV融合基因和蛋白在任何HCV疫苗和疫苗程序中的應(yīng)用。臨床證據(jù)提示，細(xì)胞介導(dǎo)免疫(cell-mediatedimmunity)促進(jìn)丙型肝炎病毒(HCV)的清除和感染的控制，而且增強(qiáng)慢性感染個體中的免疫可能在治療上是有益的。本發(fā)明人和其他人報道的先前研究顯示，完整的重組釀酒酵母(S.cerevisiae)具有作為疫苗和免疫療法的載體的潛力(例如，參見1998年11月3日授權(quán)的美國專利5，830，463，及2001年11月15日提交的美國專利申請序列號09/991，363，分別將其所有內(nèi)容通過引用并入本文)。本發(fā)明人的基于酵母的免疫治療產(chǎn)品已被證明在多種動物物種中引起能在體內(nèi)殺滅表達(dá)多種病毒和癌癥抗原的靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并且以抗原特異性的、由CD8+CTL介導(dǎo)的方式實現(xiàn)該作用(16-17)。本發(fā)明涉及對于1998年11月3日授權(quán)的美國專利5，830，463和2001年11月15日提交的美國專利申請序列號09/991，363所述基于酵母的免疫治療產(chǎn)品的相關(guān)平臺技術(shù)的改進(jìn)。本發(fā)明人先前已證實釀酒酵母被樹突狀細(xì)胞高親和力地吞噬并直接活化樹突狀細(xì)胞，隨后樹突狀細(xì)胞將酵母相關(guān)蛋白高效地呈遞給⑶4和⑶8T細(xì)胞(Stubbs等.NatureMed.5:625-629,2001;及美國專利申請序列號09/991，363，同上)。在自發(fā)性肺癌小鼠模型中已證實，表達(dá)突變Ras癌蛋白的釀酒酵母特異性地清除攜帶同源突變的腫瘤(Lu等，CancerResearch64:5084-5088,2004),該方法目前正在胰腺癌、肺癌和結(jié)腸直腸癌患者中進(jìn)行一期臨床試驗檢驗?；谠撈脚_技術(shù)的免疫治療產(chǎn)品可簡單直接地生產(chǎn)，不被宿主免疫應(yīng)答所中和，可以重復(fù)施用來加強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答，且不需要針對具體患者采用特異性的生產(chǎn)方法。更具體地說，舉例而言，本發(fā)明人開發(fā)了一種基于酵母的疫苗，其包含重組的熱滅活的釀酒酵母，該酵母表達(dá)新的HCV融合蛋白，該蛋白在一個實施方式中包含至少一部分NS3和Core蛋白序列。其它實施方式包括新的全長失活NS3HCV蛋白，新的截短的E1-E2融合蛋白，及新的TM域缺失的HCVNS4b融合蛋白。參考本文的公開，本發(fā)明的其它實施方式將是顯而易見的。HCVCore蛋白和NS3蛋白酶在HCV感染的細(xì)胞中豐富地表達(dá)，并且為病毒復(fù)制所必需；這些特性，加上高度的序列保守性，使得它們成為免疫療法的良好目標(biāo)。已經(jīng)證明本發(fā)明的疫苗在動物中針對表達(dá)NS3和Core抗原的病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異的增殖性T細(xì)胞應(yīng)答以及細(xì)胞毒性T(CTL)細(xì)胞應(yīng)答，并保護(hù)動物抵抗表達(dá)HCV抗原的腫瘤(見實施例和18)。施用該疫苗可望提高針對HCVNS3和Core蛋白的HCV特異性⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致病毒載量的減少，并最終導(dǎo)致HCV感染個體中病毒的清除。用作本發(fā)明的基于酵母的疫苗的組分的新HCV融合蛋白是使用在酵母中表達(dá)異源抗原的新型構(gòu)建體產(chǎn)生的，在該構(gòu)建體中所需抗原性蛋白或肽在其氨基末端與(a)本文描述的具體合成肽；或(b)內(nèi)源酵母蛋白的至少一部分相融合；其中任一融合配偶體(fusionpartner)均顯著地提高該蛋白在酵母中表達(dá)的穩(wěn)定性和/或防止酵母細(xì)胞對該蛋白進(jìn)行翻譯后修飾。而且，所述融合肽提供了可被設(shè)計為選擇劑例如抗體所識別的表位，并且不表現(xiàn)針對構(gòu)建體中接種抗原的免疫反應(yīng)的負(fù)面影響。這樣的制劑可用于鑒定、選擇和純化本發(fā)明中有用的蛋白。另外，本發(fā)明考慮使用融合到所述抗原構(gòu)建體C末端的肽，尤其是用于選擇和鑒定該蛋白質(zhì)。這樣的肽包括，但不限于，任何合成或天然的肽，例如肽標(biāo)簽(如6XHis)或任何其它短的表位標(biāo)簽。附加于本發(fā)明的抗原的C末端的肽可以在有或沒有添加上面討論的N末端肽的條件下使用。最后，本發(fā)明人在本文中描述了供基于酵母的疫苗中使用的數(shù)種不同的新型融合蛋白HCV抗原，它們提供來自同一構(gòu)建體中的一個或多個抗原的多個(兩個或更多)免疫原性域。包含多個免疫原性域的融合蛋白的一個例子是包含HCVNS3和Core蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白，其在本文中有描述。其它的例子也在下文描述。如上所述，NS3和Core在被感染的細(xì)胞中豐富地表達(dá)，為病毒復(fù)制所必需，并含有在急性和慢性感染中被⑶4+和⑶8+T細(xì)胞識別的表位。以這些蛋白為靶位，尤其是在單個疫苗中以上述兩種蛋白為靶位的另一個優(yōu)點在于氨基酸水平的高度保守性。Core和NS3蛋白在美國最普遍的兩種HCV株，即HCV基因型Ia和Ib中都是高度保守的(表I)。Core蛋白在Ia和Ib株中顯示98%的氨基酸同一性，發(fā)現(xiàn)其它5種基因型與HCVIa蛋白序列相比的同一性為86-95%。NS3蛋白在不同的HCV株中也是高度保守的——Ia和Ib株之間存在92%的氨基酸同一性，且其它HCV基因型與HCVIa蛋白序列相比的同一性為81-86%。各種HCV基因型之間Core和NS3蛋白的聞度保守性，提不有特定的蛋白域?qū)Σ《竟δ芏鴊是必需的。本發(fā)明的一種疫苗，雖然是單個產(chǎn)品，但被設(shè)計來靶向兩種病毒抗原，NS3蛋白酶和Core蛋白?？梢匀菀椎財U(kuò)展該方法，來包括其它必需和保守的HCV病毒蛋白的蛋白質(zhì)序列,產(chǎn)生更廣泛的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本文例舉了這樣的其它融合蛋白和疫苗。HCV多聚蛋白基因的核酸和氨基酸序列和其編碼的多聚蛋白是本領(lǐng)域已知的。例如，丙型肝炎病毒H77株多聚蛋白基因的核酸序列被記載在數(shù)據(jù)庫登錄號AF011753(gi2327074)中，在本文中由SEQIDN0:19表示。SEQIDN0:19編碼HCVH77株多聚蛋白，其具有本文中SEQIDNO20表示的氨基酸序列。在SEQIDNO20中，HCV蛋白包含下列位置HCVCore(SEQIDNO:20的I到191位)；HCVEl包膜糖蛋白(SEQIDNO20的192到383位);HCVE2包膜糖蛋白(SEQIDNO20的384到746位);HCVP7離子通道(SEQIDNO20的747到809位);HCVNS2金屬蛋白酶(SEQIDNO20的810到1026位);HCVNS3蛋白酶/解旋酶(SEQIDNO20的1027到1657位)；HCVNS4aNS3蛋白酶輔因子(SEQIDNO20的1658到1711位)；HCVNS4b(SEQIDNO:20的1712到1972位)；HCVNS5a(SEQIDNO:20的1973到2420位)JPHCVNS5bRNA依賴性RNA聚合酶(SEQIDNO:20的2421到3011位)。如上所述，HCV的各株顯示高度的氨基酸同一性(例如，見表I)。因此，使用本文提供的指導(dǎo)并參考示例HCV株，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能容易地于本發(fā)明的組合物和疫苗中使用源自任何HCV株的多種基于HCV的融合蛋白。顯然，HCV的控制和清除需要⑶4+和⑶8+T細(xì)胞二者，且缺少足夠的細(xì)胞免疫與慢性感染的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。因此，一種有吸引力的觀點是，刺激慢性HCV感染的個體中已有但不充分的HCV特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞將帶來治療上的益處。不受限于理論，本發(fā)明人相信，理想的HCV免疫療法由這樣的非病原性載體構(gòu)成，該載體可將抗原輸送進(jìn)入第I類和第II類MHC抗原呈遞途徑，以刺激強(qiáng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。與其它治療性產(chǎn)品相似，該載體也應(yīng)該能重復(fù)施用。本發(fā)明的疫苗和組合物理想地符合這些目標(biāo)的要求。本發(fā)明之前已知的一些免疫治療性疫苗制劑由純化的病毒蛋白組成，這些蛋白被樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(本文中一般又稱為抗原呈遞細(xì)胞或APC)內(nèi)吞。被吞入的物質(zhì)中的蛋白質(zhì)被消化成多肽(10-20個氨基酸)，這些多肽在APC中特化的內(nèi)體中與第II類MHC結(jié)合。然后該肽-第II類MHC分子復(fù)合物被表達(dá)在APC的表面上?？乖禺愋寓?+T輔助細(xì)胞(Th)與第II類MHC+肽的聯(lián)合體結(jié)合，變?yōu)榛罨癄顟B(tài)并產(chǎn)生淋巴因子。在沒有佐劑條件下細(xì)胞外施用的可溶性抗原傾向于刺激2型T輔助細(xì)胞(Th2)，該細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子，所述淋巴因子作用于B細(xì)胞，導(dǎo)致體液免疫應(yīng)答。TH2應(yīng)答傾向于抑制對于誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫而言重要的I型T輔助細(xì)胞(ThI)應(yīng)答。如果被靶定的病毒抗原在受感染細(xì)胞的膜上，那么產(chǎn)生抗體的方法可具有治療效果。但是，如果被靶定的病毒抗原出現(xiàn)在受感染細(xì)胞內(nèi)部，則抗體通常幾乎沒有效果。另外，由于對Th2應(yīng)答的傾向性，CD8+CTL—般不會響應(yīng)于外源引入的蛋白抗原而被活化。如果針對慢性病毒感染的保護(hù)需要CD8+CTL，似乎可以合理地推測，使用重組蛋白的手段可能不成功。與胞外抗原相反，⑶8+CTL響應(yīng)于任何被靶細(xì)胞合成的抗原而被誘導(dǎo)。這些抗原稱作內(nèi)源抗原。受感染細(xì)胞合成的病毒蛋白被胞漿蛋白酶體消化成肽(8-10個氨基酸)，隨后肽被輸送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在轉(zhuǎn)運到受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的表面之前，第I類MHC分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的正確折疊依賴于蛋白酶體產(chǎn)生的肽的結(jié)合。CD8+T細(xì)胞對MHCI受體-肽結(jié)合形成復(fù)合物起響應(yīng)，產(chǎn)生淋巴因子，包括IFN-Y，這些淋巴因子通常導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答，包括殺滅所述受感染細(xì)胞。CTL的有效活化表現(xiàn)為需要IL-2和IL-12。雖然CD8+CTL可產(chǎn)生一些IL_2，但一般承認(rèn)⑶4+Th1細(xì)胞是CTL介導(dǎo)型應(yīng)答的主要IL-2來源。IL-12由樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。另外還清楚，為最大程度活化CTL，需要樹突狀細(xì)胞呈遞抗原。因此，如同⑶4+THl細(xì)胞那樣，CTL也需要與抗原呈遞細(xì)胞(APC)相互作用，以最大程度地活化并對病毒感染的細(xì)胞起反應(yīng)。最初并不清楚，除了樹突狀細(xì)胞自身被感染以外，病毒感染的細(xì)胞合成的抗原如何得以進(jìn)入樹突狀細(xì)胞中的第I類MHC途徑。但是，新近的數(shù)據(jù)說明，樹突狀細(xì)胞可識別由于感染而發(fā)生凋亡的受感染細(xì)胞，而且可發(fā)生交叉致敏(cross-priming)(外源抗原輸送到內(nèi)源抗原呈遞途徑中)，使得被樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞入的細(xì)胞/顆粒所結(jié)合的一些蛋白得以進(jìn)入第I類MHC途徑(23)。另外，一些“危險”信號(下述)可增強(qiáng)該過程(25)。免疫應(yīng)答主要由從細(xì)胞外液(extracellularfluids)攝取外來(foreign)物質(zhì)的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所引發(fā)。增加這些細(xì)胞充分呈遞抗原的能力應(yīng)該會導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。就此而言，重組釀酒酵母顯示免疫刺激復(fù)合物(immunostimulatorycomplexes,ISC0M)的獨特特征(26),還具有這樣的優(yōu)點，即高度糖基化的酵母具有類似天然佐劑的性質(zhì)，且可以很容易地接受工程改造以表達(dá)多個抗原(16，27-29)。釀酒酵母被專職抗原呈遞細(xì)胞(professionalantigen-presentingcells),包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞高親和力地攝取。酵母相關(guān)蛋白通過第I類和第II類MHC被有效地呈遞，導(dǎo)致針對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性、抗原特異性CTL介導(dǎo)型免疫(16-17)。樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在其表面上具有多種受體，它們充當(dāng)微生物模式識別分子，即它們根據(jù)糖基化模式、脂蛋白和核酸組成的不同來識別病原體。因此，這樣的抗原呈遞細(xì)胞(APC)具有針對以下分子的受體微生物甘露糖蛋白(mannoproteins)、肽聚糖、葡聚糖、脂蛋白、雙鏈RNA和含CpG島的DNA(30-32)。這些受體被結(jié)合(engagement)則產(chǎn)生所謂“危險”信號，導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞成熟，活化，吞噬作用增強(qiáng)，以及與結(jié)合物質(zhì)相關(guān)聯(lián)的抗原的高效呈遞(33)。事實上，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有的識別酵母的受體可能多于任何其它的微生物。這些受體包括TLR-2、TLR-4、TLR-6、CD14、Dectin-UDectin-2、DEC-205及甘露糖受體家族(30，40)。攝取酵母聚糖(一種釀酒酵母細(xì)胞壁粗制備物)導(dǎo)致多種促炎性基因的上調(diào)(35)。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)顯示，小鼠和人樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞攝取整個酵母導(dǎo)致多種細(xì)胞表面分子的上調(diào)，包括黏附分子(ICAM-1，⑶54)、共刺激分子(B7-1，B7-2，⑶80，⑶86)以及第I類和第II類MHC分子，并促進(jìn)諸如TNF-a、GM_CSF、干擾素-Y,IL-2和IL-12等促炎性ThI型細(xì)胞因子的分泌。除了能直接與樹突狀細(xì)胞相互作用以外，酵母還具有使其成為理想的免疫療法平臺的多種其它性質(zhì)。首先，可以對多種抗原進(jìn)行工程改造以在單株酵母中表達(dá)(29)，這樣的制劑與DNA疫苗具有許多共同的優(yōu)點，包括容易構(gòu)建以及靶向多種抗原的能力。和DNA疫苗不同，基于酵母的免疫治療制劑不需要進(jìn)行大量純化來去除可能有毒的污染物。如下面將進(jìn)一步詳述的，重組酵母中表達(dá)的異源蛋白充當(dāng)體外和體內(nèi)強(qiáng)⑶8+CTL介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的抗原(16-17)。在作為預(yù)防性及治療性處理的動物試驗中，酵母制劑成功地保護(hù)了被免疫動物免于腫瘤生長，并治療了被免疫動物的腫瘤生長(16-17)。這些結(jié)果提示本發(fā)明的疫苗作為HCV免疫治療劑可引發(fā)廣譜的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，發(fā)明人創(chuàng)制了一種新的重組酵母免疫治療劑，本文中又稱為GI-5005，其表達(dá)誘導(dǎo)型啟動子的控制下的HCVNS3-Core融合蛋白。使用NS3-或Core-特異性抗體對GI-5005細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡分析，顯示了一種47kD的蛋白質(zhì)。GI-5005酵母每1000萬個細(xì)胞表達(dá)多于5μg的所述HCV融合蛋白。淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子釋放測定顯示，用GI-5005酵母注射C57BL/6和BALB/c小鼠誘發(fā)了強(qiáng)的NS3和Core抗原特異性T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞免疫應(yīng)答。接種GI-5000系列酵母的小鼠針對用表達(dá)HCV抗原的同基因腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的攻擊受到了保護(hù)。本文還給出了免疫原性和腫瘤保護(hù)的結(jié)果，以及療法的替代模型中的結(jié)果。最后，將描述慢性HCV感染患者中的I期試驗。本發(fā)明的疫苗和組合物本發(fā)明的一個實施方式涉及一種組合物(疫苗)，其可在保護(hù)動物免于HCV感染或HCV感染導(dǎo)致的疾病，或減輕HCV感染導(dǎo)致的至少一種癥狀的方法中使用。所述組合物或疫苗。所述疫苗包括(a)酵母媒介物；和(b)該酵母媒介物表達(dá)的異源融合蛋白。如上面討論的，本發(fā)明包括數(shù)種改進(jìn)的HCV融合蛋白，用作本發(fā)明的疫苗中的抗原，其中這樣的疫苗可包括酵母媒介物，但其它不包括酵母媒介物的疫苗也在本發(fā)明的考慮之內(nèi)(見下述)。具體地，本發(fā)明提供新的融合蛋白構(gòu)建體，其穩(wěn)定所述異源蛋白在酵母媒介物中的表達(dá)，防止表達(dá)的異源蛋白被翻譯后修飾，并且/或者可如本文所述地在沒有酵母媒介物的條件下(即，在常規(guī)的或其它非基于酵母的疫苗組合物中)用作接種抗原。這些新融合蛋白在一些實施方式中還通過在單個疫苗中使用多種經(jīng)過選擇的抗原而提供廣泛的細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些融合蛋白在和酵母媒介物一起時，最典型地作為重組蛋白被酵母媒介物表達(dá)(例如，被完整的酵母或酵母球芽表達(dá)，其中球芽任選地可被進(jìn)一步加工成酵母細(xì)胞形成核(cytoblast)，酵母空胞(ghost)，或酵母膜提取物或其級分)，但作為本發(fā)明的一個實施方式，可以如上所述將一種或多種這樣的融合蛋白裝載到酵母媒介物中或與酵母媒介物復(fù)合或混合，來形成本發(fā)明的疫苗?？捎糜诒景l(fā)明的一種這樣的融合構(gòu)建體是包括下列成分的融合蛋白(a)至少一種HCV抗原(包括全長抗原的免疫原性域和表位，以及本文中他處所述的多種融合蛋白和多種抗原構(gòu)建體)；和(b)合成肽。在一個實施方式中，合成肽與HCV抗原的N末端連接，該肽由至少兩個對該HCV抗原而言異源的氨基酸組成，其中該肽穩(wěn)定所述融合蛋白在酵母媒介物中的表達(dá)，或者防止表達(dá)的融合蛋白被翻譯后修飾。合成肽和抗原的N末端部分一起形成融合蛋白，其有如下的要求(1)該融合蛋白第I位的氨基酸殘基是甲硫氨酸(即，合成肽的第一個氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白的第二位的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸(即，合成肽的第二個氨基酸不是甘氨酸或脯氨酸)；(3)融合蛋白第2-6位的任何氨基酸殘基都不是甲硫氨酸(即，第2-6位的氨基酸都不包含甲硫氨酸，不管它們是所述合成肽的部分，還是所述蛋白的部分-當(dāng)合成肽短于六個氨基酸時)；及(4)融合蛋白第2-6位的任何氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸(即，第2-6位的氨基酸都不包含賴氨酸或精氨酸，不管它們是所述合成肽的部分，還是所述蛋白的部分-當(dāng)合成肽短于五個氨基酸時)；合成肽可以短達(dá)2個氨基酸，但更優(yōu)選為至少2-6個氨基酸(包括3、4、5個氨基酸)，且可長于6個氨基酸，以整數(shù)計，可長達(dá)約200個氨基酸。在一個實施方式中，所述肽包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6,其中M是甲硫氨酸，其中X2是除了甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X3是除了甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X4是除了甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X5是除了甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；且其中X6是除了甲硫酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸。在一個實施方式中，乂6殘基是脯氨酸。一種增強(qiáng)HCV抗原在酵母細(xì)胞中表達(dá)的穩(wěn)定性和/或防止該蛋白在酵母細(xì)胞中被翻譯后修飾的示例性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(SEQIDNO:9)。除了表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性增強(qiáng)之外，本發(fā)明人相信該融合配偶體不會負(fù)面影響針對構(gòu)建體中的接種抗原的免疫應(yīng)答。此外，可以在合成融合肽中設(shè)計出可為選擇劑例如抗體所識別的表位。在本發(fā)明的另一個實施方式中，編碼本發(fā)明中使用的合成肽的翻譯起始位點的核酸是A-C-C-A-T-G-G(SEQIDNO:21)，其遵循Kozak翻譯序列規(guī)則，該序列中的ATG是初始翻譯起始位點，并編碼M-A-D-E-A-P(SEQIDNO9)的甲硫氨酸。應(yīng)當(dāng)理解，本文中描述的本發(fā)明的多個實施方式也可以組合。例如，在本發(fā)明的一個方面中，當(dāng)合成肽是M-A-D-E-A-P(SEQIDNO9)時，編碼該肽的起始位點的核酸可以是如上所述的A-C-C-A-T-G-G(SEQIDN0:10)。本發(fā)明的多種實施方式的組合對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。本文的另一個具體實施方式與上面的實施方式相似，并可包含上述實施方式的限制(雖然這不是必須的)，其包括一種疫苗，該疫苗包含與HCV抗原的C末端連接的肽，該肽由至少2個對該HCV抗原而言異源的氨基酸殘基組成，其中該肽穩(wěn)定所述融合蛋白在酵母媒介物中的表達(dá)或防止表達(dá)的融合蛋白被翻譯后修飾。在本發(fā)明的一個示例性的方面中，所述肽包含氨基酸序列E-D(Glu-Asp)。這樣的序列起到抵消疏水性的作用。根據(jù)本發(fā)明，“異源氨基酸”是下述的氨基酸的序列所述氨基酸天然地不存在于(即，不存在于天然狀態(tài)下，體內(nèi))指定氨基酸序列側(cè)翼；或者所述氨基酸與指定的氨基酸序列的功能不相關(guān)；或者當(dāng)編碼指定氨基酸序列的天然核酸序列存在于基因中時，所述氨基酸不被該核酸序列側(cè)翼的核苷酸所編碼，如果所述核苷酸的天然序列是按照給定氨基酸序列的來源生物的標(biāo)準(zhǔn)密碼子用法翻譯的話。因此，對HCV抗原而言異源的至少2個氨基酸殘基，是天然地不存在于HCV抗原兩側(cè)的任何氨基酸殘基。本發(fā)明另一實施方式涉及可用于保護(hù)動物免受HCV感染或該感染導(dǎo)致的癥狀的組合物(疫苗)，其包含(a)酵母媒介物；及(b)酵母媒介物表達(dá)的異源蛋白。在一個實施方式中，所述融合蛋白包含(i)至少一種HCV抗原(包括全長抗原的免疫原性域和表位，以及本文中他處所述的多種融合蛋白和多種抗原構(gòu)建體)，其與(ii)連接于所述HCV抗原的N末端的酵母蛋白相融合，其中所述酵母蛋白由內(nèi)源酵母蛋白的約2個到約200個氨基酸構(gòu)成，其中所述酵母蛋白顯著地提高該融合蛋白在酵母媒介物中表達(dá)的穩(wěn)定性或者防止該融合蛋白被酵母細(xì)胞翻譯后修飾。另外，所述內(nèi)源酵母抗原，如所述合成肽一樣，該融合配偶體似乎不負(fù)面影響針對該構(gòu)建物中的接種抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的這個方面可以結(jié)合上述的本發(fā)明的其它實施方式使用。所述內(nèi)源酵母蛋白由內(nèi)源酵母蛋白的約2-200個氨基酸(或最多22kDa)構(gòu)成，其中所述酵母蛋白穩(wěn)定所述融合蛋白在酵母媒介物中的表達(dá)或防止表達(dá)的融合蛋白被翻譯后修飾。在該實施方式中可使用任何合適的內(nèi)源酵母蛋白，特別優(yōu)選的蛋白包括但不限于SUC2(酵母轉(zhuǎn)化酶；其在同一啟動子驅(qū)動下既能將蛋白表達(dá)在胞質(zhì)溶膠中又能將其導(dǎo)入分泌途徑，因此是良好的候選，但其依賴于培養(yǎng)基中的碳源)，α因子信號前導(dǎo)序列；SEC7;CPY;磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PCKl，磷酸甘油激酶PGK和丙糖磷酸異構(gòu)酶TPI基因產(chǎn)物，以利用其在葡萄糖中可被阻遏的表達(dá)及胞質(zhì)溶膠定位；Cwp2p，以利用其在細(xì)胞壁中的定位及滯留；熱休克蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSCl和KAR2，當(dāng)細(xì)胞被暴露于熱處理時它們被誘導(dǎo)表達(dá)，且它們的蛋白更加熱穩(wěn)定；線粒體蛋白CYC1，用于向線粒體的輸入；BUD基因，用于在形成子細(xì)胞的初始階段定位于酵母細(xì)胞芽；ACT1，用于錨定到肌動蛋白束上。在一個實施方式中，此處的融合蛋白中使用的內(nèi)源酵母蛋白/肽或合成肽包含用于鑒定和純化所述融合蛋白的抗體表位。選擇性結(jié)合內(nèi)源抗原的抗體可以是現(xiàn)成可得的，或者可以容易地產(chǎn)生。最后，如果希望將蛋白導(dǎo)向特定的細(xì)胞位置(例如，進(jìn)入分泌途徑，進(jìn)入線粒體，進(jìn)入細(xì)胞核)，則構(gòu)建體可使用所述酵母蛋白的內(nèi)源信號，以確保對該輸送系統(tǒng)而言細(xì)胞機(jī)制是最優(yōu)化的。優(yōu)選地，可以獲得或者生產(chǎn)了選擇性結(jié)合所述融合配偶體的抗體。根據(jù)本發(fā)明，短語“選擇性結(jié)合”指本發(fā)明的抗體、抗原結(jié)合片段或結(jié)合配偶體(bindingpartner)優(yōu)先結(jié)合指定蛋白質(zhì)的能力。更具體地，短語“選擇性結(jié)合”指一種蛋白對另一蛋白的選擇性結(jié)合(例如，抗體、其片段或結(jié)合配偶體對抗原)，其中以任何標(biāo)準(zhǔn)測定(例如免疫測定)所測得的結(jié)合水平統(tǒng)計學(xué)顯著地高于所述測定的背景對照。例如，當(dāng)進(jìn)行免疫測定時，對照通常包括只含有抗體或抗原結(jié)合片段(即沒有抗原)的反應(yīng)孔/管，其中將所述抗體或其抗原結(jié)合片段在沒有抗原條件下的反應(yīng)性(例如對孔的非特異性結(jié)合)的量看作背景?？梢允褂帽绢I(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的多種方法，包括酶免疫測定(例如ELISA)、免疫印跡測定等，來測量結(jié)合。在一個實施方式中，本發(fā)明的疫苗可包含連接于HCV抗原C末端的肽，其中所述肽使得該融合蛋白可被針對該肽的抗體識別。在一個方面中，所述肽包含氨基酸序列G-G-G-H-H-H-H-H-H(SEQIDN0:10)。該實施方式可以單獨使用或者與上述的融合蛋白的其它方面聯(lián)合使用。如上面所討論的，本發(fā)明的疫苗和組合物中使用的融合蛋白包含用于接種動物的至少一種HCV抗原。所述組合物或疫苗可包括一種，兩種，少數(shù)種，數(shù)種或多種HCV抗原，包括一種或多種HCV抗原的一種或多種免疫原性域，視需要而定。例如，本文所述的任何融合蛋白可包括選自下列的一種或多種HCV蛋白的至少一部分HCVEl包膜糖蛋白，HCVE2包膜糖蛋白，HCVP7離子通道，HCVNS2金屬蛋白酶，HCVNS3蛋白酶/解旋酶，HCVNS4aNS3蛋白酶輔因子，HCVNS4b,NCVNS5a,HCVNS5bRNA依賴性RNA聚合酶，及HCVCore序列。在優(yōu)選的實施方式中，至少一部分HCVCore序列與至少一部分不同于HCVCore序列的HCV蛋白連接。在另一個方面中，所述融合蛋白包含一種或多種HCV抗原的至少一種或多種免疫原性域。根據(jù)本發(fā)明，本文中術(shù)語“抗原”一般用于指蛋白質(zhì)(肽、部分蛋白質(zhì)、全長蛋白質(zhì))的任何部分，其中所述蛋白質(zhì)是天然的或合成而來的；細(xì)胞組合物(整個細(xì)胞，細(xì)胞裂解物或破碎的細(xì)胞)；生物體(整個生物體、裂解物或破碎的細(xì)胞)或糖或其它分子，或者其部分，其中所述抗原引起抗原特異性免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)，或為耐受原針對被施用該抗原的動物的細(xì)胞和組織中遇到的相同或相似的抗原。在本發(fā)明的一個實施方式中，如果刺激免疫應(yīng)答是有利的，術(shù)語“抗原”可以與術(shù)語“免疫原”互換使用，且在本文中用來描述這樣的蛋白、肽、細(xì)胞組合物、生物體或其它分子，其引發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答(即為抗原性)，以致于對動物施用該免疫原(例如通過本發(fā)明的疫苗)后，針對該動物的組織中遇到的相同或相似抗原產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答。因此，針對特定抗原免疫動物，在一個實施方式中意味著作為施用該抗原的結(jié)果，引發(fā)了針對該抗原或其免疫原性或耐受原性部分的免疫應(yīng)答。接種優(yōu)選地導(dǎo)致保護(hù)性或治療性效應(yīng)，其中接種之后暴露于抗原(或抗原源)將引發(fā)針對該抗原(或抗原源)的免疫應(yīng)答，減輕或預(yù)防該動物體內(nèi)的疾病或病癥。接種的概念在本領(lǐng)域是公知的。施用本發(fā)明的治療性組合物所引發(fā)的免疫應(yīng)答，可以是免疫應(yīng)答的任何方面(例如細(xì)胞免疫，體液免疫，細(xì)胞因子產(chǎn)生)相比于沒有施用該疫苗時發(fā)生的任何可檢測的改變。“接種抗原”(vaccinatingantigen)可以是免疫原或耐受原,但其是疫苗中使用的抗原，針對該接種抗原引發(fā)生物應(yīng)答(免疫應(yīng)答的引發(fā)，耐受)。給定抗原的免疫原性域(部分，片段，表位)可以是抗原的任何下述的部分(即，肽片段或亞單位或抗體表位或其它構(gòu)象表位)其含有至少一個施用于動物時充當(dāng)免疫原的表位。例如，單個蛋白可含有多個不同的免疫原性域。在體液免疫的情況下，免疫原性域并非必需是蛋白質(zhì)內(nèi)的線性序列。本文中表位定義為給定抗原內(nèi)足以引發(fā)免疫應(yīng)答的單個免疫原性位點，或者給定抗原內(nèi)足以抑制、缺失或失活免疫應(yīng)答的單個耐受原性位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，T細(xì)胞表位的大小和組成與B細(xì)胞表位不同，且通過第I類MHC途徑呈遞的表位與通過第II類途徑呈遞的表位不同。表位可以是線性序列或構(gòu)象表位(保守結(jié)合區(qū))，取決于免疫應(yīng)答的類型。抗原可以小到單個表位，或者更大，可以包含多個表位。就其本身而言，抗原的大小可以小到約5-12個氨基酸(例如，肽)，可以大到全長蛋白，包括多聚體和融合蛋白，嵌合蛋白，整個細(xì)胞，整個微生物，或其部分(例如，整個細(xì)胞的裂解物或微生物提取物)。另夕卜，抗原可包括糖類，其可加載到酵母媒介物中或本發(fā)明的組合物中。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實施方式中(即當(dāng)酵母媒介物從重組核酸分子表達(dá)該抗原時)，抗原是蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白，或其片段，而不是整個細(xì)胞或微生物。本文中描述了本發(fā)明優(yōu)選的HCV融合蛋白。在本文的另一個實施方式中，所述疫苗的HCV抗原部分作為包含兩個或多個抗原的融合蛋白產(chǎn)生。在一個方面中，所述融合蛋白可包括一種或多種抗原(例如本文所述的HCVNS3序列和HCVCore序列)的兩個或更多免疫原性域或兩個或多個表位。這樣的疫苗可在廣范圍的患者中提供抗原特異性免疫。例如，可用于本發(fā)明的多域融合蛋白可具有多個域，其中每個域由來自特定蛋白的肽組成，所述肽由至少4個氨基酸殘基組成，所述氨基酸殘基位于所述蛋白的任一側(cè)翼并包含該蛋白中的突變氨基酸，其中所述突變與特定的疾病或病癥(例如HCV感染)相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的一個實施方式中，產(chǎn)生的本文描述的任何氨基酸序列可帶有至少I個，多達(dá)約20個附加的異源氨基酸，這些氨基酸位于指定的氨基酸序列的C和/或N末端之一的側(cè)翼。所得的蛋白或多肽可稱為“基本上由”所指定的氨基酸序列構(gòu)成。如上面討論的，根據(jù)本發(fā)明，異源氨基酸是下述的氨基酸的序列所述氨基酸天然地不存在于(即，不存在于天然狀態(tài)下，體內(nèi))指定氨基酸序列的側(cè)翼；或者所述氨基酸與指定的氨基酸序列的功能不相關(guān)；或者當(dāng)編碼指定氨基酸序列的天然核酸序列存在于基因中時，所述氨基酸不被該核酸序列側(cè)翼的核苷酸所編碼，如果所述核苷酸的天然序列是按照給定氨基酸序列的來源生物的標(biāo)準(zhǔn)密碼子用法翻譯的話。類似地，短語“基本上由......組成”當(dāng)對本文中的核酸序列使用時，是指下述的編碼指定氨基酸序列的核酸序列，在該編碼指定氨基酸序列的核酸序列的5’和/或3’端之任一的側(cè)翼可具有至少一個，多達(dá)約60個附加異源核苷酸。異源核苷酸是這樣的核苷酸當(dāng)編碼指定的氨基酸序列的核酸序列存在于天然基因中時，它們天然不存在于(即不存在于天然狀態(tài)下，體內(nèi))該序列的側(cè)翼；或者它們不編碼賦予具有指定的氨基酸序列的蛋白質(zhì)以任何其它功能，或改變其功能的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面中，HCV抗原是由HCVNS3蛋白酶和Core序列組成的HCV蛋白。在另一個方面中，HCV抗原由相互連接的HCVNS3蛋白和HCVCore序列構(gòu)成，其中HCVNS3蛋白缺少天然NS3蛋白的催化域。在另一個方面中，HCV抗原由天然NS3蛋白中最先的N端88個氨基酸之后的262個HCVNS3氨基酸(即HCVNS3的89-350位；SEQIDNO:20)構(gòu)成。在一個方面中，所述HCVCore序列缺少疏水性C末端序列。在另一個方面中，HCVCore序列缺少C末端的兩個氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸。在一個優(yōu)選的方面中，HCVCore序列由天然HCVCore序列的2到140位氨基酸構(gòu)成。實施例I描述了這樣的疫苗的一個例子。在這個實施方式中，酵母(例如釀酒酵母)經(jīng)過工程改造，在銅誘導(dǎo)型啟動子CUPl的控制下表達(dá)HCVNS3-Core融合蛋白。該融合蛋白是單個多肽，其中下列序列元件從N末端到C末端共閱讀框地融合(括號中為HCV多蛋白(SEQIDNO20)的編號，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示為SEQIDNO2)(1)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO2的I到6位)；(2)HCVNS3蛋白酶蛋白的氨基酸89到350(SEQIDNO:20的1115到1376)(SEQIDNO2的6到268位)；(3)克隆過程中導(dǎo)入的單個蘇氨酸殘基(SEQIDNO2的269位)；(4)HCVCore蛋白的氨基酸2到140(SEQIDNO:20的2到140)(SEQIDNO:2的270到408位)；和(5)增加Core變體親水性的E-D序列(SEQIDNO2的409到410位)。本文中SEQIDNO1表示編碼SEQIDNO2的融合蛋白的核酸序列。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的方面中，HCV抗原是失活的全長HCVNS3，其構(gòu)成本發(fā)明的融合蛋白的一部分。實施例2描述了這樣的疫苗的一個例子。在這個實施方式中，酵母(例如釀酒酵母)經(jīng)過工程改造，在銅誘導(dǎo)型啟動子CUPl的控制下表達(dá)失活的全長HCVNS3融合蛋白。包含該全長HCVNS3的融合蛋白是單個多肽，其中下列序列元件從N末端到C末端共閱讀框地融合(括號中為HCV多蛋白的編號，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示為SEQIDNO4)(1)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO4的I到6位);和(2)HCVNS3蛋白酶蛋白的氨基酸I到631(SEQIDNO20的1027到1657)(SEQIDNO4的7到637位)(注意，為了使蛋白水解活性失活，HCV多肽1165位殘基的氨基酸已經(jīng)從絲氨酸改變?yōu)楸彼?。本文中SEQIDNO:3表示編碼SEQIDNO:4的融合蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的另一個方面中，酵母疫苗包含截短的HCVE1-E2融合蛋白。實施例3描述了這樣的疫苗的一個例子。在這個實施方式中，經(jīng)過工程改造的酵母(例如釀酒酵母)表達(dá)E1-E2融合蛋白，該蛋白是單個多肽，具有從N末端到C末端共閱讀框融合的下列序列元件(括號中為HCV多蛋白的編號，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示為SEQIDNO6)(I)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO6的I到6位)；(2)HCV蛋白El的氨基酸I到156(SEQIDNO20的192到347)(SEQIDNO6的7到162位);和(3)HCV蛋白E2的氨基酸I到334(SEQIDNO20的384到717)(SEQIDNO6的163到446位)。應(yīng)注意，在該融合蛋白中省去了El的36個C末端疏水性氨基酸和E2的29個疏水性氨基酸，以促進(jìn)在酵母細(xì)胞質(zhì)中的積累。本文中SEQIDNO5表示編碼SEQIDNO6的融合蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的另一個方面中，所述酵母疫苗包含缺失跨膜(TM)域的HCVNS4b融合蛋白。實施例4描述了這樣的疫苗的一個例子。該融合蛋白是單個多肽，其中以下序列元件從N末端到C末端共閱讀框地串聯(lián)排列(括號中為多蛋白的編號，該融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示為SEQIDNO8):(I)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO8的I到6位)；(2)HCV蛋白NS4b的氨基酸I到69(SEQIDNO20的1712到1780)(SEQIDNO8的7到75位);和(3)HCV蛋白NS4b的氨基酸177到261(SEQIDNO20的1888到1972)(SEQIDNO8的76到160位)。省去了對應(yīng)于NS4b氨基酸70到176(SEQIDNO20的1781到1887)、含多個跨膜域的107個氨基酸的區(qū)域，以促進(jìn)在酵母細(xì)胞質(zhì)中的積累。本文中SEQIDNO7表示編碼SEQIDNO8的融合蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面中，酵母疫苗包含Core-El_E2融合蛋白。該融合蛋白為單個多肽，其中以下序列元件從N末端到C末端共閱讀框地串聯(lián)排列(括號中為多蛋白的編號，該融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示為SEQIDNO12)(I)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO:12的I到6位)；及(2)編碼全長Core、El和E2蛋白的未修飾HCV多蛋白(SEQIDNO:12的7到751位從7到196位為Core，197位到387位為El，388到751位為E2)的氨基酸I到746(SEQIDNO20的2到746)。本文中SEQIDNO:11表示編碼SEQIDNO12的融合蛋白的核酸序列。本發(fā)明另一優(yōu)選方面中，酵母疫苗包含缺失跨膜域的Core-El-E2融合蛋白。該融合蛋白是單個多肽，其中下列序列元件從C末端到N末端共閱讀框地融合(括號中為多蛋白的編號，該融合蛋白的氨基酸序列在本文中表示為SEQIDNO14)(I)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性；(2)氨基酸2到140(SEQIDNO:20的2到140)HCVCore蛋白(SEQIDNO14的7到145位)；(3)氨基酸I到156(SEQIDNO20的192到347)HCV蛋白El(SEQIDNO14的146到301位);及(4)氨基酸I到334(SEQIDNO20的384到717)HCV蛋白E2(SEQIDNO14的302到635位)。省去了Core蛋白的51個C末端疏水性氨基酸、El的36個C末端疏水性氨基酸和E2的29個C末端疏水性氨基酸，以促進(jìn)在酵母細(xì)胞質(zhì)中的積累。本文中SEQIDN0:13表示編碼SEQIDN0:14的融合蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面中，酵母疫苗包含NS3-NS4a_NS4b融合蛋白，其中NS3蛋白酶失活且NS4b缺少跨膜域。所述NS3-NS4a-NS4b融合蛋白是單個多肽，其中以下序列元件從N末端到C末端共閱讀框地融合(括號中為多蛋白的編號，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中用SEQIDN0:16表示)(I)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO:16的I到6位)；⑵對應(yīng)于全長HCVNS3蛋白的氨基酸I到631(SEQIDNO:20的1027到1657)(注意，絲氨酸139UtSEQIDNO:20而言為1165位)被改變?yōu)楸彼?，以使NS3蛋白水解潛力失活)(SEQIDNO:16的7到634位);(3)NS4a蛋白的氨基酸I到54(SEQIDNO20的1658到1711)(SEQIDNO16的635到691位)；(4)HCV蛋白NS4b的氨基酸I到69(SEQIDNO20的1712到1780)(SEQIDNO16的692到776位);和(5)HCV蛋白NS4b的氨基酸177到261(SEQIDNO20的1888到1972)(SEQIDNO16的777到845位)。省去了對應(yīng)于NS4b氨基酸70到176(SEQIDNO20的1781至IJ1887)的、含多個跨膜域的107個氨基酸的區(qū)域，以促進(jìn)在酵母細(xì)胞質(zhì)中的積累。本文中SEQIDNO15表示編碼SEQIDNO16的融合蛋白的核酸序列。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面中，酵母疫苗包含NS5a_NS5b融合蛋白，其中NS5b的C末端帶有失活性缺失。該NS5a-NS5b融合蛋白是單個多肽，其中以下序列元件從N末端到C末端共閱讀框地融合(括號中為多蛋白的編號，所述融合蛋白的氨基酸序列在本文中由SEQIDN0:18表示)(I)序列MADEAP(SEQIDNO:9)，賦予對蛋白酶體降解的抗性(SEQIDNO:18的I到6位)；⑵整個NS5a蛋白，對應(yīng)于氨基酸I到488(SEQIDNO20的1973到2420)(SEQIDNO:18的7到454位);和(3)氨基酸I到539(SEQIDNO20的2421到2959)NS5b的(SEQIDNO18的455到993位)。缺失了NS5b在HCV復(fù)制中的活性所需要的52個C末端氨基酸殘基，以使該蛋白失活。本文中SEQIDN0:17表示編碼SEQIDNO18的融合蛋白的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，任何本文所述的融合蛋白可包含與該融合蛋白N末端連接的肽，該肽由至少2-6個對所述HCV抗原而言異源的氨基酸殘基組成。在一個方面中，所述肽包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6，其中是X2除了甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X3是除了甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸-J4是除了甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X5是除了甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸以外的任何氨基酸；X6是除了甲硫氨酸以外的任何氨基酸。在一個方面中，X6是脯氨酸。在另一個方面中，所述肽包含氨基酸序列M-A-D-E-A-P(SEQIDNO9)。在本文的一個具體方面中，上述融合蛋白在兩個HCV蛋白(例如HCVNS3序列和HCVCore序列)之間含有異源接頭序列。在一個優(yōu)選的實施方式中，所述異源接頭序列由單個異源氨基酸殘基組成。在一個更優(yōu)選的實施方式中，異源接頭序列由單個蘇氨酸殘基組成。在任何上述的本發(fā)明的組合物(例如疫苗)中，下面與酵母媒介物有關(guān)的方面包括在本發(fā)明中。在一個實施方式中，酵母媒介物選自完整酵母、酵母原生質(zhì)球、酵母胞質(zhì)體、酵母空胞，以及亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分。在一個方面中，用編碼抗原的重組核酸分子轉(zhuǎn)化用于制備酵母媒介物的酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球，使得該抗原被該酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球重組表達(dá)。在這個方面中，重組表達(dá)所述抗原的酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球被用來產(chǎn)生包含酵母胞質(zhì)體、酵母空胞或亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分的酵母媒介物。在一個方面中，所述酵母媒介物來自非病原性酵母。在另一個方面中，所述酵母媒介物來自從以下組選擇的酵母酵母屬酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母屬酵母(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬酵母(Kluveromyces)、漢遜酵母屬酵母(Hansenula)、假絲酵母屬酵母(Candida)和畢赤酵母屬酵母(Pichia)。在一個方面中，所述酵母屬酵母是釀酒酵母。一般而言，可以用本文描述的任何技術(shù)將酵母媒介物和抗原結(jié)合起來。在一個方面中，HCV抗原加載到酵母媒介物細(xì)胞內(nèi)。在另一個方面中，HCV抗原共價或非共價地附著于酵母媒介物。在另一個方面中，通過混合將酵母媒介物和HCV抗原結(jié)合起來。在另一個方面中，抗原被酵母媒介物，或者被酵母媒介物所來源的酵母細(xì)胞或酵母原生質(zhì)球重組表達(dá)。更具體地，根據(jù)本發(fā)明，酵母媒介物是可以與抗原共同用于本發(fā)明的疫苗或治療組合物中，或者用作佐劑的任何酵母細(xì)胞(例如整個或完整的細(xì)胞)或其衍生物(見下述)。因此，酵母媒介物可包括，但不限于，活的完整酵母類微生物(即，具備其所有組分，包括細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞)、死的(死亡的)完整酵母類微生物，或其衍生物，包括酵母原生質(zhì)球(即缺少細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞)、酵母胞質(zhì)體(即缺少細(xì)胞壁和細(xì)胞核的酵母細(xì)胞)、酵母空胞(即缺少細(xì)胞壁、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的酵母細(xì)胞)，或亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分(以前又稱亞細(xì)胞酵母顆粒(subcelluaryeastparticle))。酵母原生質(zhì)球通常通過酶消化酵母細(xì)胞壁而產(chǎn)生。這樣的方法在例如FranzusofT等，1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述，在此將其全部內(nèi)容引用并入本文。酵母胞質(zhì)體通常通過將酵母細(xì)胞去核而產(chǎn)生。這樣的方法在例如Coon,1978,Natl.CancerInst.Monogr.48，45-55中有描述，在此將其全部內(nèi)容引用并入本文。酵母空胞通常通過將透化處理或裂解后的細(xì)胞重接(reseal)而產(chǎn)生，并可能，但不一定含有該細(xì)胞的至少一些細(xì)胞器。這樣的方法在例如Franzusoff等，1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614和Bussey等，1979，Biochim.Biophys.Acta553，185-196中有描述，在此分別將其全部內(nèi)容引用并入本文。亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分是指缺少天然細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的酵母膜。該顆?？梢詾槿魏未笮?，包括從天然的酵母膜的大小，到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的超聲處理或其它膜破碎方法處理后重接而產(chǎn)生的微顆粒的大小的范圍。產(chǎn)生亞細(xì)胞酵母膜提取物的方法在例如Franzusoff等，1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述。還可以使用酵母膜提取物的級分，它們含有酵母膜部分，而且，當(dāng)制備所述酵母膜提取物之前酵母重組表達(dá)所述抗原時，它們還含有目標(biāo)抗原?？梢允褂萌魏谓湍妇陙懋a(chǎn)生本發(fā)明的酵母媒介物。酵母是屬于下述三類之一的單細(xì)胞微生物子囊菌(Ascomycetes)、擔(dān)子菌(Basidiomycetes)和半知菌(FungiImperfecti)。雖然根據(jù)本發(fā)明可以使用病原性酵母菌株或其非病原性突變體，非病原性酵母菌株是優(yōu)選的。優(yōu)選的酵母菌株的屬包括酵母屬、假絲酵母屬(其可能是病原性的)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬和西洋蓍霉屬(Yarrowia),其中更優(yōu)選酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬和裂殖酵母屬，尤其優(yōu)選酵母屬。優(yōu)選的酵母菌株的物種包括釀酒酵母、卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、白色假絲酵母(Candidaalbicans)、乳酒假絲酵母(Candidakefyr)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、羅侖氏隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)、馬科斯克魯維酵母乳酸變種(Kluyveromycesmarxianusvar.lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、深紅酵母(Rhodotorularubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和YarrowiaIipolytica0應(yīng)當(dāng)理解,這些物種中有多數(shù)包含多種亞種、類型、亞型、等等，都包括在上述的物種中。更優(yōu)選的酵母物種包括釀酒酵母、白色假絲酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母和粟酒裂殖酵母。釀酒酵母是尤其優(yōu)選的，因為它們相對易于操作，并且用作食品添加劑是“通常認(rèn)為安全的”(“GenerallyRecognizedAsSafe”，或“GRAS”)(GRAS,FDAproposedRule62FR18938,April17,1997)。本發(fā)明的一個實施方式是能復(fù)制質(zhì)粒到特別高的拷貝數(shù)的酵母菌株，例如釀酒酵母cir°株。在一個實施方式中，本發(fā)明的優(yōu)選的酵母媒介物能與該酵母媒介物和抗原被投送到的細(xì)胞類型，例如樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞相融合，從而得以特別高效地將所述酵母媒介物(在許多實施方式中還有抗原)投送給該細(xì)胞類型。如本文中使用的，酵母媒介物與靶標(biāo)細(xì)胞類型的融合，是借助酵母細(xì)胞膜或其顆粒與靶標(biāo)細(xì)胞類型(例如樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的膜融合，導(dǎo)致合胞體形成的能力。如本文中使用的，合胞體是細(xì)胞合并而產(chǎn)生的多核的原生質(zhì)體團(tuán)。已證明多種病毒表面蛋白(包括免疫缺陷病毒例如HIV、流感病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和腺病毒的那些)和其它融合劑(包括卵子和精子融合中涉及的那些)能導(dǎo)致兩種膜之間(例如病毒膜和哺乳動物細(xì)胞膜之間，或哺乳動物細(xì)胞膜之間)發(fā)生融合。例如，在其表面上產(chǎn)生HIVgpl20/gp41異源抗原的酵母媒介物能與⑶4+T淋巴細(xì)胞融合。但是應(yīng)該注意，雖然某些情況下將靶標(biāo)部分并入酵母媒介物中是理想的，但并不必須這樣做。本發(fā)明人先前已證明，本發(fā)明的酵母媒介物被樹突狀細(xì)胞(以及其它細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞)容易地攝取。可以使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將酵母媒介物配制為本發(fā)明的組合物，包括直接施用于患者的制備物或首先裝載于載體例如樹突狀細(xì)胞中的制備物。例如，可以通過冷凍干燥來干燥酵母媒介物。還可以通過將酵母包裝在塊(cake)或片(tablet)中來制備包含酵母媒介物的制劑，例如焙烤或釀造工作中所做的那樣。另外，在將帶有抗原的酵母媒介物裝載到樹突狀細(xì)胞中或以其它方式施用以前，還可以將酵母媒介物與藥學(xué)可接受的賦形劑，例如宿主細(xì)胞可容忍的等滲緩沖劑混合。這樣的賦形劑的例子包括水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液、及其它生理平衡鹽水溶液。還可以使用非水性媒介物物，例如非揮發(fā)油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其它有用的制劑包括含有粘度加強(qiáng)劑(viscosity-enhancingagents),例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、甘油或葡聚糖的懸液。賦形劑還可含有次要量的添加劑，例如增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖劑的例子包括磷酸鹽緩沖劑、碳酸氫鹽緩沖劑和Tris緩沖劑，而防腐劑的例子包括硫柳汞、間-或鄰-苯甲酹，福爾馬林和苯甲醇。標(biāo)準(zhǔn)的制劑可以是注射液(liquidinjectables),或者是可在合適的液體中作為注射懸液或溶液被攝取的固體。因此，在非液體制劑中，所述賦形劑可包含，例如，葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐劑，施用前可以向其加入無菌水或鹽水。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“酵母媒介物-抗原復(fù)合物”或“酵母-抗原復(fù)合物”用來一般性地描述酵母媒介物和抗原的任何結(jié)合(association)。這樣的結(jié)合包括酵母表達(dá)抗原(重組酵母)；抗原導(dǎo)入酵母；抗原物理地附著于酵母，以及將酵母和抗原混合到一起，例如在緩沖液或其它溶液或制劑中。下面詳細(xì)描述了這些類型的復(fù)合物。在一個實施方式中，用編碼抗原的異源核酸分子轉(zhuǎn)化用于制備酵母媒介物的酵母細(xì)胞，從而使該酵母細(xì)胞表達(dá)該抗原。這樣的酵母在本文中又稱為重組酵母或重組酵母媒介物。然后可以將該酵母細(xì)胞作為完整細(xì)胞裝載到樹突狀細(xì)胞中，或者可以殺滅該酵母細(xì)胞，或者將其衍生化(derivatize),例如通過形成酵母原生質(zhì)球、胞質(zhì)球、空胞或亞細(xì)胞顆粒，然后將上述任一衍生物裝載到樹突狀細(xì)胞中。也可以用重組核酸分子直接轉(zhuǎn)染酵母原生質(zhì)球(例如，從整個酵母產(chǎn)生原生質(zhì)球，然后將其轉(zhuǎn)染)，以產(chǎn)生表達(dá)抗原的重組原生質(zhì)球。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子或核酸序列，是已經(jīng)從其自然環(huán)境分離的核酸分子或序列。就其本身而言，“分離”并不一定反映該核酸分子被純化的程度?？捎糜谵D(zhuǎn)染酵母媒介物的分離的核酸分子包括DNA、RNA,或DNA或RNA中任一種的衍生物。分離的核酸分子可以是雙鏈或單鏈的。可用于本發(fā)明的分離的核酸分子包括編碼蛋白質(zhì)或其片段的核酸分子，只要該片段含有至少一個在本發(fā)明的組合物中有用的表位。轉(zhuǎn)化到本發(fā)明的酵母媒介物中的核酸分子可包括編碼一種或多種蛋白質(zhì)或其部分(片段、域、構(gòu)象表位)的核酸序列。這樣的核酸分子可包含部分或整個編碼區(qū)、調(diào)控區(qū)、或其組合。酵母菌株的優(yōu)點之一在于它們能攜帶多個核酸分子并且能產(chǎn)生多種異源蛋白。本發(fā)明的酵母媒介物產(chǎn)生的抗原的優(yōu)選數(shù)目是酵母媒介物可合理地產(chǎn)生的抗原的任何數(shù)目，通常為至少I個到至少5個或更多，其中更優(yōu)選約2個到約5個異源抗原。酵母媒介物中的核酸分子編碼的肽或蛋白質(zhì)可以是全長蛋白質(zhì)，或者可以是功能上等同的蛋白質(zhì)，其中氨基酸已被缺失(例如該蛋白質(zhì)截短的形式)、插入、倒位(invert)、取代和/或衍生化(例如乙酰化、糖基化、磷酸化、被磷脂酰肌醇(GPI)錨鉤牽著(tether))，使得被修飾的蛋白質(zhì)的生物功能基本與天然蛋白質(zhì)相似(或者，如果需要，其生物功能與天然蛋白相比增強(qiáng)或被抑制)。修飾可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)實現(xiàn)，這些技術(shù)包括但不限于使用例如經(jīng)典技術(shù)或重組DNA技術(shù)實現(xiàn)隨機(jī)或靶向的誘變，來直接修飾蛋白或修飾編碼該蛋白的核酸。功能上等同的蛋白質(zhì)可以使用測量蛋白質(zhì)生物活性的測定來選擇。優(yōu)選的HCV抗原如上所述。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)實現(xiàn)抗原在本發(fā)明的酵母媒介物中的表達(dá)。簡單地說，將編碼至少一種目標(biāo)抗原的核酸分子以這樣的方式插入表達(dá)載體，使得該核酸分子與轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接，以使其在被轉(zhuǎn)化入宿主酵母細(xì)胞后，能實現(xiàn)該核酸分子的組成性或受調(diào)控表達(dá)。編碼一種或多種抗原的核酸分子可以在一個或多個載體上，與一個或多個轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接。在本發(fā)明的重組分子中，核酸分子可操作性連接于含有調(diào)控序列的表達(dá)載體，所述調(diào)控序列有例如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點，以及與酵母細(xì)胞相容且控制核酸分子表達(dá)的其它調(diào)控序列。特別地，本發(fā)明的重組分子包括與一種或多種轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接的核酸分子。短語“可操作性連接”指核酸分子和轉(zhuǎn)錄控制序列以這樣的方式連接，使得該分子轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)到宿主細(xì)胞中后能被表達(dá)。轉(zhuǎn)錄控制序列可控制所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量，它們包括控制轉(zhuǎn)錄的起始、延伸和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是那些控制轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄控制序列，例如啟動子和上游激活序列。任何合適的酵母啟動子均可用于本發(fā)明，且本領(lǐng)域已經(jīng)知道了多種這樣的啟動子。用于在釀酒酵母中表達(dá)的優(yōu)選啟動子包括但不限于編碼下列酵母蛋白的基因的啟動子醇脫氫酶I(ADHl)或II(ADH2)，CUP1，磷酸甘油酸激酶(PGK)，丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，又稱TDH3，代表丙糖磷酸脫氫酶)，半乳糖激酶(GALl)，半乳糖-I-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(GAL7)，UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶(GALlO)，細(xì)胞色素C1(CYCl),Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PH05)，更優(yōu)選雜合啟動子例如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10啟動子，尤其更優(yōu)選ADH2/GAPDH啟動子，其在細(xì)胞中葡萄糖濃度低(例如，約百分之O.I到O.2)時被誘導(dǎo)。類似地，還知道多種上游激活序列(UASs)，又稱增強(qiáng)子。釀酒酵母中表達(dá)優(yōu)選的上游活化序列包括，但不限于，編碼下列蛋白質(zhì)的基因的UASs=PCKUTPI、TDH3、CYCl、ADHl、ADH2、SUC2、GALl、GAL7和GAL10，以及其它被GAL4基因產(chǎn)物激活的UASs，其中特別優(yōu)選ADH2UAS0由于ADH2UAS被ADRl基因產(chǎn)物激活，當(dāng)異源基因與ADH2UAS可操作性連接時，優(yōu)選過表達(dá)ADRl基因。釀酒酵母中表達(dá)優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止序列包括α-因子、GAPDH和CYCl基因的終止序列。甲基營養(yǎng)(methyltiOphic)酵母中表達(dá)基因的優(yōu)選轉(zhuǎn)錄控制序列包括編碼醇氧化酶和甲酸脫氫酶的基因的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)染核酸分子到酵母細(xì)胞中可利用任何將核酸分子投入到細(xì)胞內(nèi)的方法來實現(xiàn)，包括，但不限于，擴(kuò)散、主動運輸、浴超聲處理(bathsonication)、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、吸附和原生質(zhì)體融合。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，轉(zhuǎn)染的核酸分子可以整合到酵母染色體中，或維持在染色體外載體上。攜帶這樣的核酸分子的酵母媒介物的例子在本文中有詳細(xì)的公開。如上面討論的，酵母胞質(zhì)體、酵母空胞和亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分也可以通過下述方法重組產(chǎn)生用所需的核酸分子轉(zhuǎn)染完整的酵母微生物或酵母原生質(zhì)球，在其中產(chǎn)生所述抗原，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)一步處理該微生物或原生質(zhì)球以產(chǎn)生含有所需抗原的胞質(zhì)體、空胞或亞細(xì)胞酵母膜提取物或其級分。生產(chǎn)重組酵母媒介物和酵母媒介物表達(dá)抗原的有效條件包括可在其中培養(yǎng)酵母菌株的有效的培養(yǎng)基。有效的培養(yǎng)基通常是包含下列成分的水性培養(yǎng)基可同化的糖、氮和磷酸源，以及合適的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其它營養(yǎng)物，例如維生素和生長因子。所述培養(yǎng)基可包含復(fù)合營養(yǎng)物，或者可以是確定成分的基本培養(yǎng)基。本發(fā)明的酵母菌株可以在多種容器中培養(yǎng)，包括，但不限于，生物反應(yīng)器、錐形瓶、試管、微量滴定盤和培養(yǎng)平皿。在適合于所述酵母菌株的溫度、PH和含氧量條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這樣的培養(yǎng)條件完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的專業(yè)知識范圍內(nèi)(見例如Guthrie等(eds.),1991,MethodsinEnzymology,vol.194,AcademicPress,SanDiego)。在本發(fā)明的一個實施方式中，作為在酵母媒介物中重組表達(dá)抗原之外的選擇，將蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)抗原，或充當(dāng)抗原的糖或其它分子裝載到酵母媒介物細(xì)胞內(nèi)。然后，可以將在細(xì)胞內(nèi)含有抗原的酵母媒介物施用于患者，或裝載到載體例如樹突狀細(xì)胞(下述)中。如本文所用的，肽包含少于或等于約30-50個氨基酸的氨基酸序列，而蛋白質(zhì)包含多于約30-50個氨基酸的氨基酸序列；蛋白質(zhì)可以是多聚體。作為抗原有用的蛋白質(zhì)或肽可以小到如一個T細(xì)胞表位(即，長度大于5個氨基酸)，并且可以是該大于此大小的任何合適的大小，包括多個表位、蛋白片段、全長蛋白、嵌合蛋白或融合蛋白。肽和蛋白可以天然地或合成地衍生化，這樣的修飾可包括，但不限于，糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蘧?；?、異戊二烯化、棕櫚?；Ⅴ０坊?或甘油磷脂酰肌醇的添加?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將肽和蛋白質(zhì)直接插入本發(fā)明的酵母媒介物，例如通過擴(kuò)散、主動運輸、脂質(zhì)體融合、電穿孔、吞曬、凍融循環(huán)(freeze-thawcycles)和浴超聲處理。可以直接裝載肽、蛋白質(zhì)、糖或其它分子的酵母媒介物包括完整酵母，以及原生質(zhì)球、空胞或胞質(zhì)體，可以在這些酵母媒介物產(chǎn)生后，裝載到樹突狀細(xì)胞中之前，將抗原裝載到其中?；蛘撸梢詫⒖乖b載到完整酵母中，然后從其制備出原生質(zhì)球、空胞、胞質(zhì)體或亞細(xì)胞顆粒。在本實施方式中，酵母媒介物中可以裝入任何數(shù)目的抗原，從至少1，2，3，4個或高達(dá)數(shù)千或數(shù)萬的任何整數(shù)個抗原，例如，通過裝載微生物，裝載哺乳動物細(xì)胞，或其部分，可能提供這樣的數(shù)目。在本發(fā)明的另一個實施方式中，抗原物理地附著于酵母媒介物?？乖瓕湍该浇槲锏奈锢砀街梢杂帽绢I(lǐng)域中適合地任何方法來實現(xiàn)，包括共價和非共價的結(jié)合方法，這些方法包括，但不限于，將抗原化學(xué)交聯(lián)到酵母媒介物的外表面，或抗原生物地連接到酵母媒介物的外表面，例如通過使用抗體或其它結(jié)合配偶體?；瘜W(xué)交聯(lián)可以通過包括下列的方法實現(xiàn)戍二醒連接、光親和標(biāo)記、用碳二亞胺(carbodiimides)處理、用能連接二硫鍵的化學(xué)品處理、及用本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的其它交聯(lián)化學(xué)品處理?；蛘?，可以使酵母媒介物接觸這樣的化學(xué)品，其改變酵母膜脂雙層的電荷或細(xì)胞壁組成，使得酵母的外表面更易于融合或結(jié)合具有特定電荷特性的抗原。祀向劑(targetingagents),例如抗體、結(jié)合肽(bindingpeptides)、也可以將可溶性受體以及其它配體并入抗原中作為融合蛋白，或以其它方式與抗原結(jié)合，以供抗原結(jié)合酵母媒介物。在另一實施方式中，酵母媒介物和抗原通過一種更為被動的非特異性或非共價結(jié)合機(jī)制相互結(jié)合，例如通過在緩沖液或其它合適的制劑中將酵母媒介物和抗原輕柔地混合。在本發(fā)明的一個實施方式中，將酵母媒介物和抗原都裝載到載體，例如樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)，以形成本發(fā)明的治療組合物或疫苗。或者，可以在沒有酵母媒介物的存在下將本發(fā)明的抗原(即本發(fā)明的新HCV融合蛋白)裝載到樹突狀細(xì)胞中。下面詳細(xì)討論了可實現(xiàn)兩種組分的裝載的多種形式。如本文所用的，術(shù)語“裝載”(loaded)及其衍生語是指組分(例如所述酵母媒介物和/或抗原)插入(insertion)、導(dǎo)入(introduction)或進(jìn)入(entry)細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞)。“將組分裝載到細(xì)胞內(nèi)”涉及將組分插入或?qū)爰?xì)胞的胞內(nèi)區(qū)室(intracellularcompartment)(例如,通過質(zhì)膜并至少進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、吞曬體、溶酶體或細(xì)胞的某些胞內(nèi)空間)?！把b載組分到細(xì)胞中”借助任何下述的技術(shù)通過該技術(shù)，組分或者被迫使進(jìn)入細(xì)胞(例如通過電穿孔)，或者被置于該組分相當(dāng)有可能通過某種過程(例如吞噬作用)進(jìn)入細(xì)胞的環(huán)境中。裝載技術(shù)包括，但不限于擴(kuò)散，主動運輸，脂質(zhì)體融合，電穿孔，吞噬和浴超聲處理。在一個優(yōu)選的實施方式中，使用將酵母媒介物和/或抗原裝載到樹突狀細(xì)胞中的被動機(jī)制，這樣的被動機(jī)制包括該酵母媒介物和/或抗原被樹突狀細(xì)胞所吞噬。應(yīng)當(dāng)理解，疫苗中提供的上述任何HCV融合蛋白可以不具有一種或多種對該蛋白在酵母中的表達(dá)特別有利的N末端和/或C末端修飾。這樣的HCV融合蛋白可用于其它非基于酵母的疫苗中，例如通過將所述融合蛋白與常規(guī)的佐劑組合，用該融合蛋白沖擊(pulse)樹突狀細(xì)胞，提供包含編碼該融合蛋白的核酸分子的DNA或核酸或病毒載體，或構(gòu)建由本發(fā)明的特定HCV融合蛋白構(gòu)成的假病毒體(例如，本發(fā)明的E1-E2融合蛋白)。由此，本發(fā)明的另一個實施方式涉及保護(hù)動物免于HCV感染或該感染導(dǎo)致的癥狀的組合物，該組合物(其可以是疫苗)包括(a)任意一種或多種如上所述的HCV融合蛋白(有或沒有本文所述的多種N-和C-末端修飾)；和(b)藥學(xué)可接受的遞送媒介物(其可包括藥學(xué)可接受的賦形劑或佐劑)。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種基于核酸的疫苗，例如DNA疫苗或病毒載體疫苗，其包含編碼如本文所述的HCV融合蛋白(有或沒有本文所述的多種N-和C-末端修飾)的核酸構(gòu)建體(例如病毒載體或其它重組核酸分子)。所述疫苗還可包括任何藥學(xué)可接受的遞送媒介物(其可包括藥學(xué)可接受的賦形劑或佐劑)。本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種假病毒體，其由多種本發(fā)明的HCV融合蛋白，特別是如本文所述的E1-E2融合蛋白構(gòu)成。同樣，可包含或不包含對于本發(fā)明的基于酵母的疫苗特別有用的N末端和/或C末端修飾。本發(fā)明一個實施方式中，組合物或疫苗還可以包括生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑化合物(biologicalresponsemodifiercompounds),或產(chǎn)生這些調(diào)節(jié)劑的能力(例如通過用編碼這些調(diào)節(jié)劑的核酸分子轉(zhuǎn)染)，盡管根據(jù)本發(fā)明這些調(diào)節(jié)劑對于實現(xiàn)強(qiáng)的免疫應(yīng)答不是必須的。例如，可以用至少一種抗原和至少一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑化合物轉(zhuǎn)染或裝載酵母媒介物，或者可以將本發(fā)明的疫苗或組合物與至少一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑一起施用。生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的化合物，它們可稱為免疫調(diào)節(jié)性化合物(immunomodulatorycompounds)。某些生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑能刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答，而其它的能抑制有害的免疫應(yīng)答。某些生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑優(yōu)先增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答，而其它的優(yōu)先增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答(即，能激發(fā)細(xì)胞免疫水平較之體液免疫升高的免疫應(yīng)答，或反之)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多種測量免疫應(yīng)答的激發(fā)或抑制的方法，以及區(qū)分細(xì)胞免疫和體液免疫的方法。合適的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子、激素、脂類衍生物(Iipidicderivatives)、小分子藥物和其它生長調(diào)節(jié)劑(growthmodulators),包括,但不限于，白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL_10)、白介素12(IL_12)、干擾素y(IFNY)、胰島素樣生長因子I(IGF-I)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、類固醇、前列腺素和白三烯。酵母媒介物表達(dá)(即產(chǎn)生)以及可能分泌IL-2、L-12和/或IFN-Y的能力優(yōu)先增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫，而酵母媒介物表達(dá)并可能分泌IL-4、IL-5和/或IL-10的能力優(yōu)先增強(qiáng)體液免疫。其它合適的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑包括，但不限于，抗-CTLA-4抗體(例如，用以釋放無反應(yīng)性(anergic)T細(xì)胞)；T細(xì)胞共刺激物(例如抗-0)137,抗-0)28,抗-0)40);alemtuzumab(例如CamPath);地尼白介素2(denileukindiftitox)(例如ONTAK)、抗-CD4、抗-CD25、抗-PD-1、抗-PD-Ll、抗-PD-L2或阻滯F0XP3(例如，以殺滅/消除CD4+/CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性)的劑、Flt3配體、咪喹莫特(imiquimod)(Aldara)，GM-CSF,沙格司亭(sargramostim)(Leukine)，Toll樣受體(TLR)-7激動劑，或TLR-9激動劑(例如，增加樹突狀細(xì)胞或其它專職抗原呈遞細(xì)胞的數(shù)目或其活化狀態(tài)的劑)。這樣的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑是本領(lǐng)域公知并可公開獲得的。本發(fā)明的組合物和治療性疫苗可進(jìn)一步包括可用于保護(hù)受試者免于HCV感染，或治療或減輕該感染的任何癥狀的任何其他化合物。如上所述，本發(fā)明還包括本文所述的任何HCV融合蛋白或編碼這些HCV融合蛋白的核酸分子在沒有本發(fā)明的酵母媒介物存在的組合物或疫苗中的用途，例如在任何常規(guī)的或非基于酵母的組合物或疫苗中的用途。除了所述HCV融合蛋白外，這樣的組合物可包括藥學(xué)可接受的載體，例如佐劑。另外，本發(fā)明的基于酵母的疫苗可以與藥學(xué)可接受的載體一起提供。本文中，“藥學(xué)可接受的載體”指適合遞送本發(fā)明的方法中有用的HCV融合蛋白到合適的體內(nèi)或體外位點的任何物質(zhì)或媒介物。這樣的載體可包括，但不限于，佐劑、賦形劑或其它任何類型的遞送媒介物或載體。本文在，“佐劑”通常是一般性地增強(qiáng)動物對特定抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。合適的佐劑包括，但不限于，弗氏佐劑；其他細(xì)菌細(xì)胞壁組分；招基鹽(aluminum-basedsalts)；I丐基鹽(calcium-basedsalts);二氧化娃；多核苷酸；類毒素；血清蛋白；病毒外殼蛋白；其他細(xì)菌來源的制備物；Y干擾素；嵌段共聚物佐劑，例如Hunter'sTitermax佐劑(CytRx,Inc.Norcross,GA)；Ribi佐劑(可從RibiImmunoChemResearch,Inc.,Hamilton,MT獲得);以及阜苷及其衍生物,例如QuilA(可從SuperfosBiosectorA/S,Denmark獲得)。“載體”(carriers)通常是增加治療性組合物在接受治療的動物中的半衰期的化合物。合適的載體包括，但不限于，聚合控釋制劑(polymericcontrolledreleaseformulations)、生物可降解植入物、脂質(zhì)體、油、酯和二醇。本發(fā)明的治療性組合物還可以含有一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受的賦形劑”是指適于遞送本發(fā)明的方法中有用的治療性組合物到合適的體內(nèi)或體外位點的任何物質(zhì)。優(yōu)選的藥學(xué)可接受的賦形劑能使組合物(或酵母媒介物，或包含所述酵母媒介物的樹突狀細(xì)胞)維持這樣的形式，使得該組合物到達(dá)體內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞、組織或位點時，該組合物能在所述目標(biāo)位點引發(fā)免疫應(yīng)答(注意，目標(biāo)位點可以是全身性的)。本發(fā)明的合適的賦形劑包括將疫苗運送到某位點，但并不特異性地使疫苗靶向該位點的賦形劑或制劑(formularies)(本文中又稱為非祀向性載體)。藥學(xué)可接受的賦形劑的例子包括，但不限于，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、含血清的溶液、Hank’s溶液、其他生理平衡的水溶液、油、酯和二醇。水性載體可含有合適的輔助物質(zhì)(auxiliarysubstances),這些物質(zhì)是模擬接受者的生理條件(例如通過增強(qiáng)化學(xué)穩(wěn)定性和等滲性)所需要的。合適的輔助物質(zhì)包括，例如，乙酸鈉，氯化鈉，乳酸鈉，氯化鉀，氯化鈣，和其它用于制備磷酸鹽緩沖劑、Tris緩沖劑，及碳酸氫鹽緩沖劑的物質(zhì)。輔助物質(zhì)還可包括防腐劑，例如硫柳汞，間-或鄰-苯甲酚，福爾馬林和苯甲醇。本發(fā)明的方法本發(fā)明的另一個實施方式涉及保護(hù)動物免于HCV感染或由其導(dǎo)致的疾病的方法。該方法包括下述步驟對具有HCV感染或者有發(fā)生HCV感染的危險性的動物施用本文所述的本發(fā)明的疫苗或組合物，以減輕或防止該動物中的HCV感染或HCV感染導(dǎo)致的至少一種癥狀。本發(fā)明的另一個實施方式涉及在動物中引發(fā)抗原特異性體液免疫應(yīng)答和/或抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對動物施用如本文所述的本發(fā)明的疫苗或組合物。本發(fā)明的方法優(yōu)先引發(fā)動物中抗原特異性的細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答。在上述的實施方式中，所述疫苗或組合物可包括[I]組合物，其包含(a)酵母媒介物和(b)任意一種或多種上述的HCV融合蛋白；和/或[2](a)任意一種或多種上述的HCV融合蛋白及(b)藥學(xué)可接受的媒介物(可包含藥學(xué)可接受的賦形劑或佐劑，或由其構(gòu)成)；和/或[3](a)編碼任意一種或多種上述的HCV融合蛋白的分離的核酸分子(例如，DNA構(gòu)建體，載體，病毒載體)；和/或[4]分離的樹突狀細(xì)胞(例如自體樹突狀細(xì)胞)，其含有(a)酵母載體和/或(b)任意一種或多種上述的HCV融合蛋白(被(a)和/或(b)沖擊)；和/或[5]HCV假病毒體，其由本文所述的任何含E1-E2的HCV融合蛋白構(gòu)成。在本發(fā)明的一個實施方式中，如本文所述的本發(fā)明的疫苗或組合物可以在這樣的規(guī)程中施用，該規(guī)程包括使用一種或多種其它的疫苗或免疫療法組合物，包括任何常規(guī)的疫苗或組合物。例如，所述其它疫苗或免疫療法組合物可包括任何其它含有抗原，編碼抗原，或表達(dá)抗原的組合物，例如編碼HCV抗原的DNA疫苗或包含HCV抗原的其它病毒載體。用于疫苗的病毒載體是本領(lǐng)域已知的，包括，但不限于，痘病毒(牛痘(vaccinia)，金絲雀禽痘(canary),禽痘(avipox)),腺病毒,腺相關(guān)病毒，α病毒(辛德畢斯病毒,VEE)。其它類型的疫苗，包括基于蛋白的疫苗，也被本發(fā)明涵蓋。在一個方面中，可以首先對受試者施用這樣的常規(guī)疫苗，或者不是本發(fā)明的一部分的疫苗，或者不包括酵母媒介物的本發(fā)明的疫苗(例如包含與藥學(xué)可接受的載體組合的本發(fā)明的新HCV融合蛋白的疫苗，或編碼本發(fā)明的新HCV融合蛋白的DNA疫苗)以致敏受試者針對HCV抗原的免疫應(yīng)答。然后，可對受試者施用本發(fā)明的疫苗或組合物，尤其是本發(fā)明的基于酵母的疫苗，以加強(qiáng)免疫應(yīng)答?；蛘撸梢詫κ茉囌呤┯帽景l(fā)明的疫苗或組合物以致敏免疫應(yīng)答，特別地包括本發(fā)明的基于酵母的疫苗，并可以使用常規(guī)的或其它疫苗或組合物(例如包含本發(fā)明的新HCV融合蛋白的、非基于酵母的疫苗，或編碼本發(fā)明的新融合蛋白的DNA疫苗)來加強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的治療性組合物或疫苗的使用方法優(yōu)選地引發(fā)動物中的免疫應(yīng)答，使得該動物被保護(hù)免于HCV感染或HCV感染導(dǎo)致的疾病狀況或癥狀。如本文中使用的，短語“被保護(hù)免于疾病”涉及減少疾病的癥狀，減少疾病的發(fā)生，和/或減輕疾病的嚴(yán)重性?！氨Ｗo(hù)動物”可借助本發(fā)明的治療性組合物被施用于動物時防止疾病發(fā)生和/或治愈或減輕疾病癥狀、征候或原因的能力。就其本身而言，“保護(hù)動物免于疾病”包括防止疾病發(fā)生(預(yù)防性處理或預(yù)防性疫苗)及處理患有疾病或正在經(jīng)歷疾病的初始癥狀的動物(治療性處理或治療性疫苗)。特別地，保護(hù)動物免于疾病是通過誘導(dǎo)有益的或保護(hù)性的免疫應(yīng)答，從而在動物中引發(fā)免疫應(yīng)答而實現(xiàn)的，其中所述有益的或保護(hù)性的免疫應(yīng)答在某些情況下還抑制(例如，降低，抑制或阻滯)過度反應(yīng)性或有害的免疫應(yīng)答。術(shù)語“疾病”指相對動物正常健康狀態(tài)的任何偏離，包括存在疾病癥狀的狀態(tài)，和已經(jīng)發(fā)生了偏離(例如感染，基因突變，遺傳缺陷，等等)但尚未表現(xiàn)出癥狀的情形。在一個實施方式中，將本發(fā)明的任何疫苗施用于被HCV感染的個體或個體群。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的任何疫苗施用于有感染HCV風(fēng)險的個體或個體群。這些個體可包括被確認(rèn)為感染HCV的風(fēng)險高于，例如，正常個體群或全體個體群的群體。這樣的群體可用任何合適的參數(shù)來定義。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的任何疫苗施用于任何個體或任何個體群，不考慮他們已知或預(yù)測的感染狀態(tài)或感染HCV的易感性。更具體地，如本文所述的疫苗，當(dāng)通過本發(fā)明的方法施用于動物時,優(yōu)選產(chǎn)生可包括下列的效果減輕疾病(例如減少所述疾病的至少一種癥狀或臨床表現(xiàn))，消除疾病，防止或減輕原發(fā)疾病的發(fā)生所導(dǎo)致的繼發(fā)疾病，預(yù)防疾病，和激發(fā)針對該疾病的效應(yīng)細(xì)胞免疫。本發(fā)明包括本發(fā)明的組合物或疫苗對動物的遞送。施用過程可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。體外施用涉及在患者之外進(jìn)行部分調(diào)節(jié)步驟，例如在一定條件下將本發(fā)明的組合物施用于從患者分離的細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞)群體，使得酵母媒介物和抗原被裝載到細(xì)胞中，并將這些細(xì)胞返回給患者。本發(fā)明的治療性組合物可以用任何合適的施用模式返回給患者，或施用于患者。根據(jù)本發(fā)明，疫苗或組合物，包括裝載有酵母媒介物和抗原的樹突狀細(xì)胞、單獨的酵母媒介物、或包含單獨或與載體組合的新HCV融合蛋白的組合物的施用，可以施用于全身、粘膜和/或目標(biāo)位點的位置附近(例如，腫瘤附近)。優(yōu)選的施用途徑對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯然的，取決于要預(yù)防或治療的病癥，所用的抗原，和/或目標(biāo)細(xì)胞群體或組織。優(yōu)選的施用方法包括，但不限于，靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、結(jié)內(nèi)施用、冠狀動脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用(例如到頸動脈中)、皮下施用、經(jīng)皮遞送、氣管內(nèi)施用、皮下施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、腦室內(nèi)(intraventricular)施用、吸入(例如氣溶膠)、盧頁內(nèi)、脊柱內(nèi)、眼內(nèi)、耳、鼻內(nèi)、口服、肺施用、導(dǎo)管浸潰(impregnation)及直接注射入組織。特別優(yōu)選的施用途徑包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、結(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、吸入、鼻內(nèi)、口服、眼內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)和脊柱內(nèi)。胃腸外遞送可包括皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、心房導(dǎo)管和靜脈導(dǎo)管途徑。耳遞送可包括滴耳劑，鼻內(nèi)遞送可包括滴鼻劑(nosedrops)或鼻內(nèi)注射，眼內(nèi)遞送可包括滴眼劑(eyedrops)。氣溶膠(吸入)遞送也可以施用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見例如Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA189:11277-11281，1992，將其全部內(nèi)容引用并入本文)進(jìn)行。例如，在一個實施方式中，可將本發(fā)明的組合物或疫苗配制成適于用合適的吸入裝置或噴霧器進(jìn)行霧化遞送的組合物?？诜f送可包括能通過口攝取的固體和液體，并可用于產(chǎn)生粘膜免疫；而且因為包含酵母媒介物的組合物可容易地制備以供口服遞送，例如制成片或膠囊，及配制成食品和飲料產(chǎn)品。其它調(diào)節(jié)粘膜免疫的遞送途徑在病毒感染的治療中是有用的。這樣的途徑包括支氣管、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、其它吸入、直腸、皮下、表面、經(jīng)皮、陰道和尿道途徑。在上述任意方法的一個實施方式中，疫苗施用于呼吸道。在另一個實施方式中，通過胃腸外施用途徑施用疫苗。在另一個實施方式中，疫苗還包含樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，其中將表達(dá)所述融合蛋白的酵母媒介物體外遞送給樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，并將所述含有表達(dá)HCV抗原的酵母媒介物的樹突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞遞送給動物。在該實施方案的一個方面中，所述樹突狀細(xì)胞或酵母載體還裝載了游離的抗原。在一個方面中，所述疫苗作為治療性疫苗施用。在另一方面中，所述疫苗作為預(yù)防性疫苗施用。根據(jù)本發(fā)明，有效的施用規(guī)程(S卩，以有效的方式施用疫苗或治療性組合物)包括這樣的合適劑量參數(shù)和施用模式，導(dǎo)致患有疾病或病癥的，或有感染疾病或病癥風(fēng)險的動物中的免疫應(yīng)答被引發(fā)，優(yōu)選地，使得該動物被保護(hù)免于疾病。有效的劑量參數(shù)可以用針對特定疾病的本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來測定。這樣的方法包括，例如，測定存活率、副作用(即毒性)和疾病的進(jìn)展或消退。根據(jù)本發(fā)明，合適的單個劑量是在一個合適的時間段內(nèi)施用一次或多次時，能引發(fā)動物中抗原特異性免疫應(yīng)答的劑量。劑量可隨所治疾病或病癥變化。例如，在一個實施方式中，本發(fā)明的酵母媒介物的單個劑量是約IxlO5到約5xl07個酵母細(xì)胞當(dāng)量每千克施用該組合物的生物的體重。在優(yōu)選的實施方式中，每個劑量的酵母細(xì)胞不相對生物體重調(diào)整。在該實施方式中，本發(fā)明的酵母媒介物的單個劑量是約IxlO4到約IxlO9個酵母細(xì)胞每個劑量。更優(yōu)選地，本發(fā)明的酵母媒介物的單個劑量是約O.IY.U.(IxlO6個細(xì)胞)到約100Y.U.(IxlO9個細(xì)胞)每個劑量(即每個生物)，并包括任何中間的劑量，按O.IxlO6個細(xì)胞的增量遞增(即，I.IxlO6,1.2xl06,1.3χ106.··)。該劑量范圍可有效地用于任何大小的生物中，包括小鼠、猴、人等。當(dāng)通過將酵母媒介物和抗體裝載到樹突狀細(xì)胞中來施用疫苗時，本發(fā)明的疫苗的優(yōu)選的單個劑量為約O.5xl06到約40xl06個樹突狀細(xì)胞每個體每次施用。優(yōu)選地，單個劑量是約IxlO6到約20xl06個樹突狀細(xì)胞每個體，更優(yōu)選約IxlO6到約IOxIO6個樹突狀細(xì)胞每個體。當(dāng)疫苗包含本發(fā)明的融合蛋白和載體時，優(yōu)選的單個劑量為約O.01微克X千克―1動物體重到約10毫克X千克η動物體重。更優(yōu)選的藥物的單個劑量包括約I微克X千克―1動物體重到約10毫克X千克η動物體重。更優(yōu)選的藥物的單個劑量包括約5微克X千克―1動物體重到約7毫克X千克η動物體重。更優(yōu)選的藥物的單個劑量包括約10微克X千克―1動物體重到約5毫克X千克η動物體重。尤其優(yōu)選的藥物的單個劑量包括約O.I毫克X千克―1動物體重到約5毫克X千克―1動物體重，如果該藥物是通過氣溶膠遞送的。另一個優(yōu)選的藥物的單個劑量包括約O.I毫克X千克η動物體重到約10毫克X千克η動物體重，如果該藥物是胃腸外遞送的。治療性組合物的“加強(qiáng)劑”(booster或boost)優(yōu)選地在針對抗原的免疫應(yīng)答已減弱時施用或按需要施用，以提供免疫應(yīng)答或誘發(fā)針對特定的一種或多種抗原的記憶應(yīng)答。加強(qiáng)劑可以在初始施用后約2周到數(shù)年后施用。在一個實施方式中，施用計劃包括在約I個月到約6個月的時間段內(nèi)，施用約IxlO5到約5xl07個酵母細(xì)胞當(dāng)量每千克生物體重的組合物I到4次。在本發(fā)明的方法中，疫苗和治療性組合物可施用于動物，包括任何脊椎動物，特別是脊椎動物類哺乳綱(Ma_alia)的任何成員，包括而不限于，靈長類(primates)、嚙齒類(rodents)、家畜(livestock)和家養(yǎng)寵物(domesticpets)。家畜包括供食用的或產(chǎn)生有用產(chǎn)品的哺乳動物(例如產(chǎn)羊毛的綿羊)。優(yōu)選要保護(hù)的哺乳動物包括人、犬、貓、小鼠、山羊、綿羊、牛、馬和豬，尤其優(yōu)選人。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“患者”或“受試者”可用來描述作為本文所述的診斷性、預(yù)防性或治療性處理的對象的任何動物。分離的融合蛋白、核酸分子和細(xì)胞本發(fā)明的另一個實施方式包括分離的蛋白，其包括任何包含本文所描述的HCV抗原的分離的融合蛋白。本發(fā)明還包括編碼任何這樣的蛋白的分離的核酸分子，包含編碼這樣的蛋白的核酸序列的重組核酸分子，以及含有這樣的核酸分子或重組核酸分子，或被其轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和載體，包括病毒載體。如本文所用的，本發(fā)明中提到分離的蛋白或多肽時，包括了全長蛋白，融合蛋白，或這樣的蛋白的任何片段、域、構(gòu)象表位或同源物。更具體地，分離的蛋白，根據(jù)本發(fā)明，是已經(jīng)從其天然環(huán)境中分離(即已經(jīng)經(jīng)過人類的操作)的蛋白(包括多肽或肽)，其可包括例如純化的蛋白，部分純化的蛋白，重組產(chǎn)生的蛋白，和合成產(chǎn)生的蛋白。就其本身而言，“分離的“并不反映該蛋白被純化的程度。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)是重組產(chǎn)生的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“修飾”和“突變”可互換使用，特別是就針對本文所述的蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)的修飾/突變而言。如本文中使用的，術(shù)語“同源物”用來指這樣的蛋白或肽，其由于對天然的蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的次要修飾而不同于天然的蛋白或肽，但維持天然形式的基本蛋白質(zhì)和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。這樣的變化包括，但不限于，一個或數(shù)個氨基酸側(cè)鏈的變化，一個或數(shù)個氨基酸的變化，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)插入和/或取代；一個或數(shù)個原子的立體化學(xué)的變化；和/或次要的衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙?；?、肉豆蘧酰化、異戊二烯化、棕櫚酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。同源物與天然的蛋白或肽相比可具有增加的、減少的，或基本相似的性質(zhì)。同源物可包含蛋白質(zhì)的激動劑或蛋白質(zhì)的拮抗劑。同源物可以用本領(lǐng)域已知的制備蛋白的方法來制備，包括，但不限于，直接對分離的天然蛋白進(jìn)行修飾，直接合成蛋白，或?qū)幋a該蛋白質(zhì)的核酸序列進(jìn)行修飾，使用例如經(jīng)典技術(shù)或重組DNA技術(shù)以產(chǎn)生隨機(jī)或定向誘變。本發(fā)明的蛋白和/或其同源物或片段或其它部分的最小大小，在一個方面中，是足以具有所需的生物活性的大小，例如足以充當(dāng)本發(fā)明的融合蛋白或其它組合物中的抗原或免疫原，或作為體外測定的靶標(biāo)。在一個實施方式中，本發(fā)明的蛋白至少約8個氨基酸長，或至少約25個氨基酸長，或至少約30個氨基酸長，或至少約40個氨基酸長，或至少約50個氨基酸長，或至少約75個氨基酸長，或至少約100個氨基酸長，或至少約125個氨基酸長，或至少約150個氨基酸長，或至少約175個氨基酸長，或至少約200個氨基酸長，或至少約250個氨基酸長，或至少約300個氨基酸長，或至少約350個氨基酸長，或至少約400個氨基酸長，或至少約450個氨基酸長，或至少約500個氨基酸長，或至少約550個氨基酸長，或至少約600個氨基酸長，諸如此類，從8個氨基酸直到本發(fā)明的蛋白的全長，蛋白或其部分的組合的全長之間的任何長度，或更長的長度，以整數(shù)計(例如，8，9，10，...25，26,...102，103，···)。除了實際條件的限制外，這樣的蛋白的最大大小沒有限制，因為該蛋白可包括蛋白質(zhì)的一部分、功能域、或其生物活性的或有用的片段，或者全長的蛋白，加上附加的序列(例如融合蛋白序列)，如果需要的話。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的融合蛋白包括本文所述的任何融合蛋白。本發(fā)明所涵蓋的示例性的融合蛋白包括那些包含選自下組的氨基酸序列，基本上由選自下組的氨基酸序列構(gòu)成，或由選自下組的氨基酸序列構(gòu)成的融合蛋白SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO16和SEQIDNO:18。本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮了本文提供的知道后將清楚其它融合蛋白序列，因為多種HCV蛋白序列是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明還包括任何包含編碼本文所述的任何融合蛋白的核酸序列，基本由編碼本文所述的任何融合蛋白的核酸序列構(gòu)成，或由編碼本文所述的任何融合蛋白的核酸序列構(gòu)成的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，“分離的核酸分子”是已經(jīng)與其天然環(huán)境分離(即，已經(jīng)經(jīng)過人的操作)的核酸分子，其“天然環(huán)境”是該核酸分子天然處于其中的基因組或染色體。就其本身而言，“分離的”并不反映該核酸分子被純化的程度，而是表明所述分子不包含該核酸分子天然處于其中的整個基因組或整個基因組。分離的核酸分子可包括基因。包含某基因的分離的核酸分子并不是包含該基因的染色體的片段，而是包含該基因相關(guān)的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)，但不包含天然存在于同一染色體上的其它基因。分離的核酸分子還可包含指定的核酸序列，該序列的側(cè)翼(即該序列的5’和/或3’端)存在其它核酸，這些其它核酸在天然條件下通常不位于該指定的核酸序列的側(cè)翼(即為異源序列)。分離的核酸分子可包含DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。盡管短語“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短語“核酸序列”主要指核酸分子上核苷酸的序列，但這兩個短語可以互換使用，尤其是對于能編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的域的核酸分子或核酸序列而言。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的核酸分子用重組DNA技術(shù)(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生。分離的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然等位變體以及修飾的核酸分子，所述修飾噬插入、缺失、取代核苷酸和/或進(jìn)行核苷酸倒位致使產(chǎn)生所需的效果。蛋白同源物(例如核酸同源物編碼的蛋白)已在上文詳細(xì)描述過?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法生產(chǎn)核酸分子同源物(見，例如，Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLabsPress(1989))0例如，可以用多種技術(shù)修飾核酸分子，包括，但不限于，經(jīng)典誘變技術(shù)和重組DNA技術(shù)，例如定點誘變、化學(xué)處理核酸分子以誘發(fā)突變、限制酶切割核酸片段、連接核酸片段、PCR擴(kuò)增和/或核酸序列的選擇區(qū)域的誘變、合成寡核苷酸混合物并連接混合物組以“構(gòu)建”核酸分子的混合物，及其組合。通過篩選核酸所編碼的蛋白的功能和/或與野生型基因雜交，可以從經(jīng)修飾的核酸的混合物中選擇出核酸分子同源物。表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的重組核酸分子是這樣的分子，其可包括可操作性連接的至少任意一個核酸序列和至少任意一個轉(zhuǎn)錄控制序列，其中所述核酸序列編碼任意一個或多個本文所述的融合蛋白，所述轉(zhuǎn)錄控制序列能有效地調(diào)控該核酸序列在要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)。雖然短語“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短語“核酸序列”主要指核酸分子上核苷酸的序列，但這兩個短語可以互換使用，尤其是對于能編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的域的核酸分子或核酸序列而言。另外，短語“重組分子”主要指可操作性地與轉(zhuǎn)錄控制序列連接的核酸分子，但其可以與施用于動物的短語“核酸分子”互換使用。重組核酸分子包括重組載體，重組載體是與編碼本發(fā)明融合蛋白的分離的核酸分子可操作性地連接的任何核酸序列，通常是異源序列，其能使所述融合蛋白得以重組產(chǎn)生，并能將所述核酸分子遞送到根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中。這樣的載體可含有在天然狀態(tài)下不出現(xiàn)在要插入該載體的分離的核酸分子附近的核酸序列。載體可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本發(fā)明中優(yōu)選為病毒或質(zhì)粒。重組載體可用在克隆，測序，和/或其它核酸分子操作中，并可以用于遞送這樣的分子(例如，象DNA疫苗或基于病毒的疫苗中那樣)。重組載體優(yōu)選在核酸分子的表達(dá)中使用，并還可稱為表達(dá)載體。優(yōu)選的重組載體能在被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的重組分子中，核酸分子可操作性地與重組載體連接，其中重組載體含有調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點和其它與宿主細(xì)胞相容并控制本發(fā)明的核酸分子表達(dá)的調(diào)控序列。特別地，本發(fā)明的重組分子包括與一種或多種轉(zhuǎn)錄控制序列可操作性連接的核酸分子。短語“可操作性連接”指核酸分子和轉(zhuǎn)錄控制序列以這樣的方式連接，使得該分子轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)到宿主細(xì)胞中后被表達(dá)。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的起始、延伸和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄起始的那些，例如啟動子、增強(qiáng)子、操縱基因和阻抑蛋白序列。合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括能在根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中起作用的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多種合適的轉(zhuǎn)錄控制序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”用來指可將外源核酸分子(即重組核酸分子)插入細(xì)胞中的任何方法。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”當(dāng)用來指將核酸分子導(dǎo)入微生物細(xì)胞，例如藻類、細(xì)菌和酵母，或植物細(xì)胞中時，可與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”互換使用。在微生物系統(tǒng)和植物系統(tǒng)中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”用于描述由于微生物或植物獲取了外源核酸而承襲(inherit)的變化，并且基本上與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”同義。因此，轉(zhuǎn)染技術(shù)包括但不限于，轉(zhuǎn)化、細(xì)胞化學(xué)處理、粒子轟擊、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、吸附、感染和原生質(zhì)體融合。一類在本發(fā)明的重組核酸分子中有用的重組載體是重組病毒載體。該載體包括包裝在病毒外殼中的編碼本發(fā)明的融合蛋白的重組核酸序列，其在施用后可在動物體內(nèi)或體外的宿主細(xì)胞中表達(dá)?？梢允褂枚喾N重組病毒載體，包括但不限于基于α病毒、痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的那些重組病毒載體。特別優(yōu)選的是那些基于腺病毒和腺相關(guān)病毒的病毒載體。適于基因遞送的病毒載體在本領(lǐng)域是公知的，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇用于本發(fā)明?！禡olecularBiotechnology》,第二版，Glick和Pasternak著，ASMPress,WashingtonD.C.，1998,pp.555-590提供了現(xiàn)有病毒載體的詳細(xì)討論，在此將其全部內(nèi)容引用并入本文。適于用根據(jù)本發(fā)明的重組核酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞包括任何可以被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括任何動物、昆蟲、細(xì)菌、真菌(包括酵母)細(xì)胞。在一個實施方式中，宿主細(xì)胞是已被轉(zhuǎn)染并表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的動物細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞。在“實施例”部分例舉了這樣的細(xì)胞，它們可用于，例如，評估由本發(fā)明的疫苗或組合物誘發(fā)的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。用這些轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞還可以測試其它針對HCV抗原的疫苗或組合物。以下實驗結(jié)果是為說明目的而提供的，并不意在限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例I以下實施例描述對本發(fā)明截短的NS3_Core融合蛋白酵母疫苗GI-5005的改造。GI-5005釀酒酵母被工程改造以在銅誘導(dǎo)型啟動子CUPl控制下表達(dá)HCVNS3-Core融合蛋白。用PCR擴(kuò)增HCV基因組(基因型la，H77株，cDNA由NIH提供)的兩個區(qū)域以生成所述產(chǎn)物。NS3-Core融合蛋白是單個多肽(本文中用SEQIDNO:2表示)，其中下列序列元件按照從N末端到C末端的順序融合在同一讀框內(nèi)(括號中為HCV多蛋白中的編號)⑴序列MADEAP，賦予對蛋白酶體降解的抗性；(2)HCVNS3蛋白酶蛋白的氨基酸89到350(1115到1376)；(3)克隆過程中導(dǎo)入的單個蘇氨酸氨基酸殘基；(4)HCVCore蛋白的氨基酸2到140(2到140);和(5)增加Core變體親水性的ED序列。通過對銅誘導(dǎo)、熱滅活的GI-5005酵母的裂解產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析,確認(rèn)HCVNS3-Core融合蛋白的表達(dá)。蛋白檢測使用HCVNS3特異性的單克隆抗體(Virostat)或HCVCore蛋白特異性的單克隆抗體(Anogen)(見圖IA和圖1B)。實施例2以下實施例描述對本發(fā)明失活的HCVNS3酵母疫苗GI-5003的工程改造。GI-5003釀酒酵母被工程改造以在銅誘導(dǎo)型啟動子CUPl控制下表達(dá)失活的全長HCVNS3蛋白。用PCR擴(kuò)增HCV基因組(基因型la，H77株，cDNA由NIH提供)的單個區(qū)域以生成產(chǎn)物。失活的NS3蛋白是單個多肽(本文中用SEQIDNO:4表示)，其中下列序列元件按從N末端到C末端的順序融合在同一讀框內(nèi)(括號中為HCV多蛋白中的編號)(1)序列MADEAP，賦予對蛋白酶體降解的抗性；和(2)HCVNS3蛋白酶蛋白的氨基酸I到631(1027到1657)(注意，為了使蛋白水解活性失活，HCV多肽1165位的氨基酸已經(jīng)從絲氨酸改變?yōu)楸彼?。通過對銅誘導(dǎo)、熱滅活的GI-5003酵母的裂解產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析確認(rèn)了HCVNS3蛋白的表達(dá)。蛋白檢測使用HCVNS3特異性的單克隆抗體(Virostat)(見圖IA和圖1B)。實施例3以下實施例描述本發(fā)明GI-5000系列的截短的HCVE1-E2融合蛋白酵母疫苗的工程改造。E1-E2融合蛋白是單個多肽(本文中用SEQIDNO:6表示)，其中下列序列元件按從N末端到C末端的順序融合在同一讀框內(nèi)(括號中為HCV多蛋白中的編號)(1)序列MADEAP，賦予對蛋白酶體降解的抗性；(2)HCV蛋白El的氨基酸I到156(192到347)；(3)HCV蛋白E2的氨基酸I到334(384到717)。該融合蛋白省去了El的36個C末端疏水氨基酸和E2的29個C末端疏水氨基酸，以促進(jìn)在酵母細(xì)胞質(zhì)中的積累。通過對銅誘導(dǎo)、熱滅活的酵母的裂解產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析確認(rèn)了HCVEl/E2融合蛋白的表達(dá)(見圖1C)。實施例4以下實施例描述本發(fā)明GI-5000系列的TM域缺失的HCVNS4b融合蛋白酵母媒介物的工程改造。NS4b融合蛋白是單個多肽(在本文中由SEQIDNO:8表示)，其中以下序列元件按從N末端到C末端的順序串聯(lián)排列在同一閱讀框內(nèi)(括號中為多蛋白的編號)(1)序列MADEAP，賦予對蛋白酶體降解的抗性；(2)HCV蛋白NS4b的氨基酸I到69(1712到1780)；(3)HCV蛋白NS4b的氨基酸177到261(1888到1972)。省去了對應(yīng)于NS4b氨基酸70到176(1781到1887)的、含多個跨膜域的107個氨基酸的區(qū)域，以促進(jìn)在酵母細(xì)胞質(zhì)中的積累。通過對銅誘導(dǎo)、熱滅活的酵母的裂解產(chǎn)物進(jìn)行Western印跡分析確認(rèn)了HCVNS4b融合蛋白的表達(dá)(見圖1D)。實施例5以下實施例描述使用表達(dá)HCV抗原的GI-5005酵母媒介物(本文中又稱為Tarmogen)在小鼠中進(jìn)行的非臨床藥理學(xué)研究免疫原性研究。GI-5005由穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)了酵母表達(dá)質(zhì)粒的釀酒酵母(獲自ATCC的W303株)組成，其中所述質(zhì)粒編碼在酵母銅誘導(dǎo)型(CUPl)啟動子控制下的HCV基因型Ia來源的截短NS3與core基因產(chǎn)物的融合蛋白(SEQIDNO:2)，如實施例I中所述。在以下研究中，對C57BL/6(H-2b)和BALB/cBy(H_2d)小鼠皮下注射GI-5005酵母。使用檢測GI-5005對抗原特異性淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)的體外和體內(nèi)測定，包括淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞因子分泌和針對腫瘤攻擊(challenge)的保護(hù)。為了支持上述研究，生成并維持下述酵母菌株、細(xì)胞系和重組病毒GI-5003:表達(dá)HCV-NS3蛋白的酵母菌株。GI-5003表達(dá)全長NS3，其中催化域已通過單個點突變而失活。GI-5005-L:GI_5005酵母菌株，HCV-NS3_Core融合蛋白表達(dá)量少于50ng/YU。GI-5005-M:GI_5005酵母菌株，HCV-NS3_Core融合蛋白表達(dá)量約500ng/YUGI-5005-HGI-5005酵母菌株，HCV-NS3_Core融合蛋白表達(dá)量約1400ng/YU。EL4-NS3C57BL/6來源的EL4淋巴瘤細(xì)胞(H_2b)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了編碼HCVNS3的DNA。A20-NS3BALB/c來源的A20淋巴瘤細(xì)胞(H_2d)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了編碼HCVNS3的DNA。P815-NS3:DBA/2來源的P815白血病細(xì)胞(H_2d)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了編碼HCVNS3的DNA。編碼下述蛋白的重組痘苗病毒(rVV):β-半乳糖苷酶(rVV-lac)、HIV-IGag(rW-Gag)、HCVNS3(rVV-NS3)和HCVCore(rW-Core)。在下述的研究中，而且如果在具體的實驗中沒有另外說明，每周一次對雌性BALB/c和/或C57BL/6小鼠(每組5只，6-10周齡)皮下注射5YU(5千萬個)GI-5005或GI-5003，最后一次注射的7天后處死小鼠。用添加了10%的熱滅活胎牛血清、L-谷胺酰胺、HEPES和2-巰基乙醇的RPMI-1640組織培養(yǎng)基制備脾細(xì)胞懸液，將每個組的脾細(xì)胞懸液合并，并將其置于使用指定的HCV抗原特異性(通常為rVV-NS3和/或rVV-Core)和酵母抗原特異性(通常為GI-5005)刺激物的體外刺激(IVS)條件下。利用標(biāo)準(zhǔn)試驗來評估通過施用GI-5005誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述試驗包括通過3H-胸苷摻入進(jìn)行評定的淋巴細(xì)胞增殖，使用51Cr標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗，細(xì)胞因子分泌的定量，和針對腫瘤攻擊的保護(hù)。(a)GI-5005誘導(dǎo)抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖在評估GI-5005的免疫原性的預(yù)實驗中，每周一次共三周給C57BL/6小鼠注射5YU(5千萬個)的熱滅活GI-5005酵母細(xì)胞。小鼠未顯示由于免疫所致的明顯不良反應(yīng)。最后一次免疫的7天后獲得脾細(xì)胞，在不用任何刺激物，或分別用EL4淋巴瘤細(xì)胞、EL4-NS3(急定表達(dá)HCVNS3的EL4)、rVV_NS3(編碼HCVNS3的重組痘苗病毒)或rVV-Core的情況下對單細(xì)胞懸液進(jìn)行體外刺激。培養(yǎng)5天后用標(biāo)準(zhǔn)的胸苷摻入試驗評估淋巴細(xì)胞增殖。更具體地說，C57BL/6小鼠注射5YUGI-5005,取其脾細(xì)胞置于96孔U形底組織培養(yǎng)板的單獨的孔中(400，000細(xì)胞/孔)，進(jìn)行體外刺激不用任何刺激物，或用絲裂霉素C處理過的EL4(10，000細(xì)胞/孔)、絲裂霉素C處理過的EL4-NS3(10，000細(xì)胞/孔)、rVV-NS3(400，OOOpfu/孔)或rVV-Core(400，OOOpfu/孔)。第5天加入3HTdR,再18小時后收獲培養(yǎng)板。結(jié)果表示為一式三份樣品的平均CPM+/-S.D.。圖2中所示的結(jié)果顯示GI-5005誘導(dǎo)NS3-和Core-特異性淋巴細(xì)胞增殖。(b)GI-5005誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答GI-5005誘導(dǎo)能殺滅穩(wěn)定表達(dá)HCVNS3的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞圖3A-3C顯示，用GI-5005免疫可誘導(dǎo)能殺滅表達(dá)HCVNS3的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞。具體地，C57BL/6小鼠每周一次注射5YU的GI-5005共三周，取其脾細(xì)胞以30xl06細(xì)胞/瓶置入25cm2組織培養(yǎng)瓶(圖3A-3B)、或以6xIO6/孔置入24孔平底組織培養(yǎng)板(圖3C)的單獨的孔中。分別用IYU(IO7個酵母細(xì)胞)的GI-5005/瓶(圖3A);IYU/瓶的GI-1001或IYU/瓶的GI-5005(圖3B);或6xl06pfu/孔的rVV-lac或rVV_NS3(圖3C)，或不用任何刺激物，體外刺激(IVS)脾細(xì)胞6天。將與rVV-lac或rVV_NS3—起培養(yǎng)的脾細(xì)胞在作為T細(xì)胞生長因子源的10%T-stim存在下再擴(kuò)增3天。在6天(圖3A，3B)或9天(圖3C)的IVS培養(yǎng)期結(jié)束時，將這些脾細(xì)胞培養(yǎng)物的二倍稀釋物(doublingdilutions)與10000個51Cr標(biāo)記的EL4或EL4-NS3細(xì)胞混合，如標(biāo)明的那樣。ET比值是指基于IVS培養(yǎng)期開始時脾效應(yīng)細(xì)胞濃度的效祀比(effectortargetratio)。結(jié)果表示為一式三份樣品的平均百分比特異性裂解+/-S.D.，所述樣品是在96孔V形底培養(yǎng)板中共培養(yǎng)6小時后分離的。自發(fā)鉻釋放值百分比EL-4為19%(圖3A)，EL4-NS3的值為40%(圖3A，3B)，EL4-NS3的值為29%(圖3C)。在圖3A所示的結(jié)果中，用GI-5005酵母對來源于GI-5005免疫的C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激，其中酵母對脾細(xì)胞的比值為I:3，刺激6天，然后在51Cr標(biāo)記的未轉(zhuǎn)染的EL4淋巴瘤細(xì)胞或穩(wěn)定表達(dá)HCV-NS3的EL4細(xì)胞(EL4-NS3)上進(jìn)行測試。經(jīng)過刺激的脾細(xì)胞以劑量依賴的方式殺滅EL4-NS3靶細(xì)胞。與之對照的是，對未轉(zhuǎn)染的EL4細(xì)胞，觀察到的殺滅顯著較少。除了提供證據(jù)表明用GI-5005免疫誘導(dǎo)了NS3特異性細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞外，這些數(shù)據(jù)還表明GI-5005酵母可用來在體外重刺激(re-stimulate)NS3特異性細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞。圖3B所示的結(jié)果為該發(fā)現(xiàn)提供了進(jìn)一步的確證，并且顯示，用GI-5005體外刺激(IVS)來自GI-5005免疫的小鼠的脾細(xì)胞，與不用任何刺激物(nil)或用載體對照酵母(GI-1001)進(jìn)行IVS相比，可使細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞增強(qiáng)對EL4-NS3的細(xì)胞毒活性。對于在所述IVS期間需要暴露于一種形式的HCVNS3抗原以激活細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性這一點，通過使用編碼NS3的重組痘苗病毒(rVV-NS3)刺激作了進(jìn)一步研究(圖3C)。這些數(shù)據(jù)顯示，與用編碼無關(guān)抗原β-半乳糖苷酶的重組病毒rVV-lac進(jìn)行IVS相比，用rVV_NS3進(jìn)行IVS刺激了存在于被免疫小鼠的脾臟中的NS3特異性細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞。GI-5005誘導(dǎo)能殺滅感染了編碼HCVNS3或Core的重組痘苗病毒的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞上面所示的結(jié)果顯示，用GI-5005免疫可導(dǎo)致對能殺滅表達(dá)NS3的同基因腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)。但是，GI-5005還表達(dá)HCVCore抗原。獲得表達(dá)HCVCore蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系的嘗試沒有成功。為了克服缺乏表達(dá)Core的靶細(xì)胞的問題，進(jìn)行了如圖4所示的研究。簡單地說，用編碼HCVNS3或HCVCore的重組痘苗病毒過夜感染帶有H-2l^P815白血病細(xì)胞，然后將它們用于標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放測定；鉻釋放測定使用的脾細(xì)胞來自用GI-5005或GI-5003(—種表達(dá)全長HCV-NS3而非Core的Tarmogen)免疫的BALB/c小鼠，該小鼠還在GI-5005存在下體外刺激了5天。更具體地，BALB/c小鼠每周一次注射5YU的GI-5005(GI-5005)或5YU的GI-5003(GI-5003)共三周，取其脾細(xì)胞置于24孔平底組織培養(yǎng)板的單獨的孔中(8xIO6/孔)，并用GI-5005(IxlO6/孔)體外刺激5天。在IVS培養(yǎng)期結(jié)束時，將這些脾細(xì)胞培養(yǎng)物的二倍稀釋物與10000個51Cr標(biāo)記的P815白血病細(xì)胞混合，其中所述P815白血病細(xì)胞已用編碼HCVNS3(圖4左邊小圖)或HCVCore(圖4右邊小圖)的重組痘苗病毒感染過夜。ET比值是指基于IVS培養(yǎng)期開始時脾效應(yīng)細(xì)胞濃度的效靶細(xì)胞比。結(jié)果表示為一式三份樣品的平均百分比特異性裂解+/-S.D.，所述樣品是在96孔V形底培養(yǎng)板中共培養(yǎng)6小時后分離的。P815-rVV-NS3的百分比自發(fā)鉻釋放值為21%，而P815-rVV-Core的值為40%。圖4顯示，GI-5005可誘導(dǎo)能殺滅感染了rVV-NS3(圖4左邊小圖)或rVV-Core(圖4右邊小圖)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒細(xì)胞，而GI-5003誘導(dǎo)的殺滅僅限于NS3。總之，圖3A-3C和圖4所示的結(jié)果表明，用GI-5005免疫可誘導(dǎo)NS-3和Core-特異性的細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞活性。(c)GI-5005誘導(dǎo)能分泌促炎細(xì)胞因子的細(xì)胞圖5顯示，將來自幼稚的或用GI-5005免疫的C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞與GI-5005酵母一起進(jìn)行組織培養(yǎng)時，細(xì)胞因子被分泌。培養(yǎng)開始48小時后收集無細(xì)胞上清，并用基于流式細(xì)胞儀的Luminex測定法(Biosource)測定細(xì)胞因子濃度。更具體地，將來自幼稚C57BL/6小鼠或來自接受了每周I次5YUGI-5005注射共3次的小鼠的脾細(xì)胞置于24孔平底組織培養(yǎng)板的單獨孔中(IOxlO6/孔)。用GI-5005(lxl06酵母細(xì)胞/孔)或PMA(15ng/mL)加離子霉素(750ng/mL)刺激脾細(xì)胞。培養(yǎng)開始48小時后收集無細(xì)胞上清，由科羅拉多大學(xué)癌癥中心流式細(xì)胞儀室(UniversityofColoradoCancerCenterFlowCytometerFacility)用流式細(xì)胞儀Luminex測定法(Biosource)對細(xì)胞因子進(jìn)行定量。IFN_g=IFN-y；TNF-a=TNF-α。這些結(jié)果顯示，施用GI-5005可激發(fā)分泌IL-2和IL-5，以及促炎細(xì)胞因子IL-6、GM-CSF,的T細(xì)胞。重要地，應(yīng)當(dāng)指出，來自免疫小鼠的脾細(xì)胞體外暴露于酵母時的細(xì)胞因子應(yīng)答，與來自幼稚C57BL/6小鼠的T細(xì)胞被PMA加離子霉素多克隆刺激時觀察到的細(xì)胞因子應(yīng)答程度相當(dāng)。另外，圖5還顯示了幼稚C57BL/6脾細(xì)胞對酵母的細(xì)胞因子應(yīng)答，并說明針對酵母的天然應(yīng)答包括IL-6、IL-12和TNF-α的分泌，它們可能來源于群體中的單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。用幼稚的和免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果(見圖8A和8B和圖IlA和11B)。(d)重復(fù)施用對由GI-5005誘發(fā)的免疫應(yīng)答的影響圖6、圖7A-7D和圖8A和8B顯示的是對C57BL/6和BALB/c小鼠進(jìn)行I次，2次或3次每周I次的GI-5005免疫的比較實驗結(jié)果。圖6考察了NS3和Core特異性淋巴細(xì)胞增殖，圖7A-7D顯示了NS3和Core特異性細(xì)胞毒細(xì)胞活性的誘導(dǎo)，圖8A和8B顯示了細(xì)胞因子分泌譜。總的來說，這些結(jié)果表明，單次GI-5005注射可誘發(fā)弱的免疫應(yīng)答，通過增加施用顯著地增強(qiáng)了該免疫應(yīng)答。圖6顯示對來自接受了I次、2次或3次每周I次的GI-5005免疫的C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖測定的結(jié)果。具體地，將來自接受了I次、2次或3次每周I次的5YUGI-5005注射的C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞置于96孔U形底組織培養(yǎng)板的單獨孔中(400，000細(xì)胞/孔)，并不用任何刺激物，或用rVV-NS3、rVV-Core或rVV-rastafar(100,OOOpfu/孔)體外刺激。第5天加入3HTdR，再18小時后收獲培養(yǎng)板。結(jié)果表示為一式三份樣品的平均CPM+/-S.D.。HCVNS3應(yīng)答和Core特異性淋巴細(xì)胞相對于免疫次數(shù)成正比地增加，而且3次免疫相對于I次免疫而言計算得到的針對rVV-NS3的刺激指數(shù)(stimulationindex)從I.8提高到2.8,針對rVV-Core的刺激指數(shù)從6.5提高到8.6。沒有發(fā)現(xiàn)針對rVV-rastafar(編碼人Ras)的刺激，這證實了GI-5005誘導(dǎo)的應(yīng)答的抗原特異性。圖7A-7D顯示用來源于接受了I次、2次或3次GI-5005免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行的鉻釋放測定的結(jié)果。具體地，將來自接受了I次、2次或3次每周一次的5YUGI-5005注射的C57BL/6小鼠(圖7A和7B)或BALB/c小鼠(圖7C和7D)的脾細(xì)胞置于24孔平底組織培養(yǎng)板的單獨孔中(IOxlO6/孔)，并用GI-5005(1X106/孔)體外刺激5天。在IVS培養(yǎng)期結(jié)束時，將脾細(xì)胞培養(yǎng)物的二倍稀釋物與10000個51Cr標(biāo)記的EL4淋巴瘤細(xì)胞(圖7A和7B)或P815白血病細(xì)胞(圖7C和7D)混合，其中所述EL4細(xì)胞或P815細(xì)胞已用表達(dá)HCVNS3(圖7A和7C)或HCVCore(圖7B和7D)的重組痘苗病毒感染過夜。ET比值是指基于IVS培養(yǎng)期開始時脾效應(yīng)細(xì)胞濃度的效靶細(xì)胞比。結(jié)果表示為一式三份樣品的平均百分比特異性裂解+/-S.D.，所述樣品是在96孔V形底培養(yǎng)板中共培養(yǎng)6小時后分離的。EL-4-rVV-NS3的百分比自發(fā)51Cr釋放值為10%，EL4-rVV-Core為10%,P815-rVV-NS3為12%,P815-rVV-Core為11%。圖7A-7D所示的結(jié)果證實了圖4的發(fā)現(xiàn)，并對感染了rVV-NS3或rVV-Core的同基因腫瘤細(xì)胞目標(biāo)顯示劑量依賴性的殺滅作用，且該殺滅作用相對于免疫次數(shù)成正比增加。圖8A和8B的結(jié)果顯示來源于接受了I次、2次或3次GI-5005免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾細(xì)胞對GI-5005體外刺激應(yīng)答的細(xì)胞因子分泌譜。具體地，來自接受了I次、2次或3次每周一次的5YUGI-5005注射的C57BL/6小鼠(圖8A)或BALB/c小鼠(圖8B)的脾細(xì)胞置于24孔平底組織培養(yǎng)平板的單獨的孔中(10X106/孔)，用GI-5005(IxlO6/孔)體外刺激。培養(yǎng)開始48小時后收集無細(xì)胞上清液，由科羅拉多大學(xué)癌癥中心流式細(xì)胞儀室用流式細(xì)胞儀Luminex測定法(Biosource)對細(xì)胞因子進(jìn)行定量。IFN_g=IFN-Y；TNF-a=TNF-α。這些結(jié)果顯示，來自被免疫小鼠的細(xì)胞針對酵母抗原的細(xì)胞因子應(yīng)答主要是Th-I類促炎型的，要出現(xiàn)所有類型的應(yīng)答需要多于I次的免疫。需要指出的重要一點是，總體上沒有檢測到TH2細(xì)胞因子IL-4和IL-10，這提示本發(fā)明的酵母媒介物主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫而非體液免疫。上面所示的數(shù)據(jù)說明，通過重復(fù)每周一次的施用增強(qiáng)了GI-5005誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。為了探討用GI-5005加強(qiáng)免疫應(yīng)答，進(jìn)行了如表2概述的實驗。簡單地說，雌性BALB/c小鼠接受了5次每周一次的GI-5005注射，然后不進(jìn)行加強(qiáng)，或按每I周一次，2周一次，I月一次或2月一次的間隔進(jìn)行加強(qiáng)。最后一次加強(qiáng)的16天后處死小鼠。結(jié)果顯示了重要的一點，即重復(fù)每周I次的注射不會導(dǎo)致誘導(dǎo)出中和作用和/或耐受，因為即使在經(jīng)過12次每周I次的注射后，再次施用時仍然產(chǎn)生了加強(qiáng)作用，如淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒測定所測得的。表2GI-5005免疫和加強(qiáng)方案權(quán)利要求1.一種治療性組合物，其包括a)酵母媒介物；和b)由該酵母媒介物重組表達(dá)的HCV融合蛋白，該HCV融合蛋白包含相互融合的截短的HCVEl蛋白和截短的HCVE2蛋白。2.權(quán)利要求I的治療性組合物，其中所述HCVEl蛋白由HCVEl蛋白的氨基酸I到156組成。3.權(quán)利要求I或2的治療性組合物，其中所述HCVE2蛋白由HCVE2蛋白的氨基酸I到334組成。4.權(quán)利要求I至3任一項的治療性組合物，其中所述HCV融合蛋白是單個多肽，其中下列序列元件從N末端到C末端共閱讀框地融合(1)SEQIDNO9的序列；(2)HCVEl蛋白的氨基酸I到156;和(3)HCVE2蛋白的氨基酸I到334。5.前述權(quán)利要求任一項的治療性組合物，其中所述HCVEl蛋白由SEQIDN0:20第192至347位或SEQIDNO:6第7至162位組成。6.前述權(quán)利要求任一項的治療性組合物，其中所述HCVE2蛋白由SEQIDN0:20第384至717位或SEQIDNO6第163至496位組成。7.前述權(quán)利要求任一項的治療性組合物，其中所述HCV融合蛋白包含SEQIDNO:6的氨基酸序列、基本上由SEQIDNO:6的氨基酸序列組成或由SEQIDNO:6的氨基酸序列組成。8.前述權(quán)利要求任一項的治療性組合物，其中所述酵母媒介物來自釀酒酵母。9.前述權(quán)利要求任一項的治療性組合物，其中所述酵母媒介物是死的完整酵母。10.用于治療HCV感染的權(quán)利要求I至9任一項的治療性組合物。11.用于引起針對HCV的抗原特異性細(xì)胞介導(dǎo)型免疫應(yīng)答的權(quán)利要求I至9任一項的治療性組合物。12.用于治療已感染HCV的一群個體或用于免疫有感染HCV風(fēng)險的一群個體的權(quán)利要求I至9任一項的治療性組合物。13.一種分離的融合蛋白，其包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。14.一種分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求13的融合蛋白的核酸序列。15.一種重組核酸分子，其包含權(quán)利要求14的分離的核酸分子。16.—種生成編碼由下述各項組成的HCV融合蛋白的核酸分子的方法a)全長NS3蛋白中最先的N端88個氨基酸之后的262個HCVNS3氨基酸(對于SEQIDNO20為1115到1376位);和b)全長HCVCore序列第2到140位氨基酸(對于SEQIDNO:20為2到140位)。全文摘要本發(fā)明涉及基于酵母的對慢性丙型肝炎感染的治療。本文公開了用于接種動物以抗丙型肝炎病毒(HCV)和治療或預(yù)防動物中丙型肝炎病毒感染的組合物，包括疫苗，以及方法。本發(fā)明包括多種新HCV融合蛋白，其可直接用作疫苗或者與基于酵母的疫苗媒介物聯(lián)合使用，來引起動物中針對HCV的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還包括本文所述的HCV融合基因和蛋白用于任何診斷或治療程序以供檢測和/或治療或預(yù)防HCV感染的用途。文檔編號C12N15/63GK102614510SQ201210105248公開日2012年8月1日申請日期2005年10月18日優(yōu)先權(quán)日2004年10月18日發(fā)明者亞歷克斯.弗蘭朱索夫,奧里莉亞.哈勒,托馬斯.H.金,理查德.C.杜克申請人:全球免疫股份有限公司