專利名稱：抑制c-Met表達(dá)的siRNA及含有所述siRNA的抗癌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小干擾RNA(siRNA),其可以互補(bǔ)結(jié)合到c_Met轉(zhuǎn)錄本(mRNA轉(zhuǎn)錄本)的堿基序列上，從而抑制c-Met的表達(dá)且不引起免疫反應(yīng)，本發(fā)明還涉及所述siRNA用于預(yù)防和/或治療癌癥的用途。
背景技術(shù)：
c-Met是一種編碼被稱為肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR)的蛋白的原癌基因。1984年，c-Met首次在化學(xué)致癌物處理的人骨肉瘤中被發(fā)現(xiàn)。1986年，由于與tpr (易位啟動(dòng)子區(qū))基因整合，c-Met被發(fā)現(xiàn)是潛在的原癌基因，(Cooper etal.，Nature，311，29-33，1984; Dean et al.，Mol cell Biol.，7，921-924，1987; Park etal·，Cell，45，895-904，1986)。
一旦和被稱為c-Met的細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶(TK)結(jié)合，由間充質(zhì)細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞生長因子(HGF)就會(huì)刺激細(xì)胞生長、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胚胎發(fā)生、傷口愈合及血管生成。這些多能作用在發(fā)育、內(nèi)環(huán)境平衡和組織再生中起基礎(chǔ)性的重要作用。HGF信號(hào)傳遞還有助于幾種人癌癥中的癌發(fā)生和腫瘤發(fā)展，并且可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的攻擊性細(xì)胞侵襲力。(Nakamura et al. , J Clin Invest.，106，1511-9，2000;Comoglio et al. , Semin Cancer Biol，11，153-65，2001;Boccaccio, Nat Rev Cancer, 6，637-45，2006;Huh CF et al.，ProcNatl Acad Sci USA,101，4477-82，2004)。大多數(shù)的HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常來自于由HGF或c_Met過表達(dá)或突變導(dǎo)致的HGF或c-Met活性升高，并且已知這與多種癌癥患者的不利預(yù)后密切相關(guān)。由于發(fā)現(xiàn)c-Met蛋白活性和癌癥發(fā)生率/轉(zhuǎn)移之間密切關(guān)系以及其他受體酪氨酸激酶抑制劑在臨床上成功，對(duì)祀向c-Met的抗癌藥物的開發(fā)有積極進(jìn)展。但是，目前臨床階段的大多數(shù)候選藥物是基于蛋白質(zhì)或c-Met受體抗體的三級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的化學(xué)合成抑制劑，例如抑制c-Met信號(hào)途徑的酪氨酸激酶抑制劑。雖然低分子量的激酶抑制劑與靶向大量蛋白激酶的激酶抑制劑相比具有提高的對(duì)c-Met的選擇性，但仍然顧慮由于脫靶至其他與c-Met結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)而導(dǎo)致的副作用。雖然相比之下抗體藥物有著極好的選擇性，但仍然存在由復(fù)雜生產(chǎn)過程導(dǎo)致的生產(chǎn)率問題和儲(chǔ)存過程中不穩(wěn)定問題。因此，一直需求開發(fā)靶向c-Met功能的有效抑制劑。最近，人們發(fā)現(xiàn)核糖核酸介導(dǎo)的干擾(RNAi )可以通過引起甚至對(duì)現(xiàn)有技術(shù)來說還不是藥物靶點(diǎn)的序列特異性基因沉默來幫助開發(fā)首要候選藥物。因此，RNAi被認(rèn)為是一種能夠?qū)Π悬c(diǎn)有限和合成藥物非特異性問題提供解決方案且可以克服化學(xué)合成藥物局限的技術(shù)。因而，許多關(guān)于RNAi在開發(fā)現(xiàn)有技術(shù)很難治療的多種疾病尤其是癌癥的藥物中應(yīng)用的研究取得了積極的進(jìn)展。不過，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)siRNA (small interfering RNA)會(huì)引發(fā)固有的免疫反應(yīng),并且還會(huì)超預(yù)計(jì)地更頻繁引起非特異性RNAi作用。
有報(bào)道顯示，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，長的雙鏈SiRNA可以誘導(dǎo)有害的干擾素反應(yīng)；短的雙鏈siRNA也可以誘導(dǎo)對(duì)人身體或細(xì)胞有害的始初干擾素反應(yīng)；并且已經(jīng)知道，許多siRNA會(huì)引起比預(yù)計(jì)更高的非特異性RNAi作用(Kleirman etal. Nature, 452:591-7，2008)。雖然已經(jīng)嘗試開發(fā)靶向在癌癥發(fā)展中起重要作用的C-Met的siRNA抗癌藥物，但到目前為止尚未取得顯著成果。siRNA的個(gè)體序列的基因抑制效應(yīng)還未被提出，尤其是免疫活性還未被考慮。雖然，siRNA由于其高活性、極好靶特異性等優(yōu)點(diǎn)而顯示出了作為新藥的巨大前景，但是對(duì)于治療性開發(fā)仍然有一些障礙需要克服，例如由于其可能被血液中的核酸酶降解而血穩(wěn)定性低、由于帶負(fù)電荷而穿過細(xì)胞膜的能力較弱、由于快速被排泄而在血液中的半存留期較短，從而其組織分布有限、并且可誘導(dǎo)能夠作用于其他基因調(diào)節(jié)途徑的脫靶效
應(yīng)。 最近，為改善這些缺點(diǎn)并使之能應(yīng)用到臨床試驗(yàn)中，在siRNA中引入化學(xué)修飾的研究取得了一 定進(jìn)展(Davidson, Nat. Biotechnol. , 24:951-952，2006; Sioud andFurset, J. Biomed. Biotechnol. , 2006:23429, 2006)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，發(fā)明人開發(fā)了具有高序列特異性并因此可特異性結(jié)合到靶基因的轉(zhuǎn)錄本以增強(qiáng)RNAi活性且不會(huì)誘導(dǎo)任何免疫毒性的siRNA，并完成了本發(fā)明。—實(shí)施方案提供了可互補(bǔ)結(jié)合到c-Met mRNA轉(zhuǎn)錄本并因此可特異性抑制c-Met合成和/或表達(dá)的siRNA。另一實(shí)施方案提供了用于表達(dá)所述siRNA的表達(dá)載體。另一個(gè)實(shí)施方案提供了抑制C-Met合成和/或表達(dá)的藥物組合物，含有所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體作為活性成分。另一實(shí)施方案提供了含有所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體作為活性成分的抗癌組合物。另一實(shí)施方案提供了一種抑制C-Met合成和/或表達(dá)的方法,包括制備所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體；以及使所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體與表達(dá)c-Met的細(xì)胞相接觸，并將所述siRNA和/或所述siRNA表達(dá)載體用于在表達(dá)c-Met的細(xì)胞中抑制c-Met的合成和/或表達(dá)。又一實(shí)施方案提供了一種抑制癌細(xì)胞生長的方法，包括制備所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體；以及使所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體與表達(dá)c-Met的細(xì)胞相接觸，并將所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體用于在表達(dá)c-Met的癌細(xì)胞中抑制癌細(xì)胞生長。又一實(shí)施方案提供了一種預(yù)防和/或治療癌癥的方法，包括制備所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體；以及將所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體以有效治療劑量給予患者，并將所述siRNA或所述siRNA表達(dá)載體用于預(yù)防和/或治療癌癥。


圖Ia到圖Id顯示了 siRNA處理的細(xì)胞因子濃度變化，其中Ia表示α -干擾素的濃度，Ib表示γ -干擾素的濃度，Ic表示白介素-12的濃度，Id表示腫瘤壞死因子的濃度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了可互補(bǔ)結(jié)合到c-Met mRNA轉(zhuǎn)錄本的堿基序列并因此抑制所述細(xì)胞中c-Met合成和/或表達(dá)的siRNA、含有所述siRNA的藥物組合物以及其用途。本發(fā)明一方面提供了特異性抑制c-Met合成和/或表達(dá)的siRNA。另一方面提供了抑制c-Met合成和/或表達(dá)的藥物組合物，含有特異性抑制c-Met合成和/或表達(dá)的siRNA作為活性成分。另一方面提供了抑制癌細(xì)胞生長的藥劑或預(yù)防和/或治療癌癥的藥物組合物(抗癌組合物)，含有可特異性抑制c-Met合成和/或表達(dá)的siRNA作為活性成分。本發(fā)明涉及抑制哺乳動(dòng)物包括人體內(nèi)c-Met mRNA、其可變剪接形式或變體或者相同譜系c-Met基因的表達(dá)的技術(shù)，這可以通過給予患者某一量的本發(fā)明siRNA以減少靶mRNA來實(shí)現(xiàn)。以下將詳細(xì)描述本發(fā)明。 c-Met可以源自于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，或者它可以是與人相同譜系的c_Met或其突變體。術(shù)語“與人相同譜系”是指具有與人c-Met基因或源自其的mRNA有80%或更大序列同源性的基因或mRNA的哺乳動(dòng)物，具體地，它可以包括人、靈長類、嚙齒類等。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)應(yīng)于編碼c-Met的mRNA的正義鏈的cDNA序列可以是SEQID NO I。本發(fā)明的SiRNA可以靶向?qū)?yīng)于選自由以下序列組成的區(qū)域的至少一個(gè)堿基序列的mRNA或cDNA區(qū)域c_Met的mRNA或cDNA中的連續(xù)15_25bp，優(yōu)選連續(xù)18_22bp，優(yōu)選連續(xù)2-21bp。cDNA上優(yōu)選的靶點(diǎn)區(qū)域總結(jié)在下表I中。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了靶向?qū)?yīng)于選自SEQ ID NO: I的c-Met cDNA區(qū)域中SEQ ID NO. 2到21的至少一個(gè)堿基序列的mRNA或cDNA區(qū)域的siRNA。具體地，提供了靶向?qū)?yīng)于選自SEQ ID N0.3、18和21的堿基序列的mRNA區(qū)域的siRNA。表lc_Met cDNA 上的靶區(qū)域(SEQ ID NO: I) (20)
權(quán)利要求
1.一種15到30bp的雙鏈SiRNA (小干擾RNA)，其可靶向?qū)?yīng)于選自下表1_1中描述的c-Met cDNA區(qū)域的至少一個(gè)的mRNA區(qū)域
2.權(quán)利要求I的siRNA，其中所述siRNA可靶向?qū)?yīng)于選自SEQID NO 3、18和21的至少一個(gè)堿基序列的mRNA區(qū)域。
3.權(quán)利要求I的siRNA，其中所述siRNA在3’末端、5’末端或兩個(gè)末端包含由I到5個(gè)核苷酸組成的懸突。
4.權(quán)利要求2的siRNA，其中所述siRNA包括選自下表6中描述的siRNAI到23的核苷酸序列 表6
5.權(quán)利要求4的siRNA，其中所述siRNA選自 siRNA 2，其包含SEQ ID NO. 24的正義序列和SEQ ID NO. 25的反義序列； siRNA 17，其包含SEQ ID NO. 54的正義序列和SEQ ID NO. 55的反義序列； siRNA 20，其包含SEQ ID NO. 60的正義序列和SEQ ID NO. 61的反義序列； siRNA 21，其包含SEQ ID NO. 62的正義序列和SEQ ID NO. 25的反義序列； siRNA 22，其包含SEQ ID NO. 63的正義序列和SEQ ID NO. 55的反義序列；以及 siRNA 23，其包含SEQ ID NO. 64的正義序列和SEQ ID NO. 61的反義序列。
6.權(quán)利要求I的siRNA，其中至少一個(gè)核糖核苷酸的糖或堿基結(jié)構(gòu)或者核糖核苷酸之間的鍵被化學(xué)修飾。
7.權(quán)利要求6的siRNA，其中所述化學(xué)修飾是以硼烷磷酸鍵或磷硫酰鍵修飾3’末端、5’末端或兩末端的磷酸二酯鍵。
8.權(quán)利要求6的siRNA，其中所述化學(xué)修飾是在3’末端、5’末端或兩末端引入ENA(乙烯橋接核酸)。
9.權(quán)利要求6的siRNA，其中所述化學(xué)修飾是以選自_NH2(氨基)、-C-烯丙基、-F(氟基)和-O-Me (甲基)的至少一個(gè)取代核糖環(huán)的2’ -OH (羥基)。
10.權(quán)利要求6的siRNA，其中所述化學(xué)修飾siRNA包括選自下表11_1中描述的siRNA24-40中的核苷酸序列 表11-1
11.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的SiRNA。
12.權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體選自質(zhì)粒、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、痘苗病毒載體和溶瘤腺病毒載體。
13.一種抗癌組合物，其含有權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的siRNA作為活性成分。
14.權(quán)利要求13的抗癌組合物，其包括與核酸遞送系統(tǒng)的復(fù)合物形式的siRNA。
15.權(quán)利要求14的抗癌組合物，其中所述核酸遞送系統(tǒng)選自病毒載體、非病毒載體、月旨質(zhì)體、陽離子聚合物、微團(tuán)、乳劑和固態(tài)脂質(zhì)納米顆粒。
16.權(quán)利要求13的抗癌組合物，還包括抗癌化學(xué)治療物，或 抑制選自生長因子、生長因子受體、下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、病毒癌基因和抗癌劑抗性基因的一個(gè)的表達(dá)的siRNA。
17.一種抑制c-Met合成和/或表達(dá)的方法，包括制備權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的siRNA ；使所述siRNA與表達(dá)c-Met的細(xì)胞相接觸。
18.—種抑制癌細(xì)胞生長的方法，包括制備權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的siRNA ;使所述siRNA與表達(dá)c-Met的癌細(xì)胞相接觸。
19.一種預(yù)防和/或治療癌癥的方法，包括制備權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的siRNA ;將所述siRNA以治療有效量給予患者。
全文摘要
公開了一種可互補(bǔ)結(jié)合到c-Met轉(zhuǎn)錄本(mRNA轉(zhuǎn)錄本)從而抑制c-Met表達(dá)而不引起免疫應(yīng)答的小干擾RNA(siRNA)，以及所述siRNA用于預(yù)防和/或治療癌癥的用途?？苫パa(bǔ)結(jié)合到編碼c-Met的mRNA的該siRNA可以通過RNA干擾(RNAi)來抑制在幾乎所有癌細(xì)胞中共同過表達(dá)的c-Met的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，因此所述siRNA可以用作抗癌劑。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102782133SQ201080065020
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者印昌勛, 趙恩娥, 金善玉, 金詳熹 申請(qǐng)人:株式會(huì)社三養(yǎng)生物制藥