專利名稱：：半胱天冬蛋白酶成像探針的制作方法半胱天冬蛋白酶成像探針本發(fā)明涉及用于在體外分析、在細胞或多細胞有機體中觀察單個蛋白水解酶或蛋白水解酶組的催化活性的分子探針(底物)。本發(fā)明還涉及合成和設(shè)計這種探針(底物)的方法。
背景技術(shù)：
：蛋白水解酶(蛋白酶)在活細胞內(nèi)部或外部使其它酶或多肽裂解或降解。蛋白酶參與很多關(guān)鍵的過程，其中很多過程是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和組織穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵過程。蛋白酶活性異?；蚧钚栽鰪娕c多種疾病有關(guān)，包括癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、炎癥等等。由于在活系統(tǒng)中，必須對蛋白水解活性保持嚴格控制，因此很多蛋白酶被表達為非活性的前體蛋白(酶原)，然后在控制下被蛋白水解裂解之后被激活。對于蛋白水解活性的其它控制來自于內(nèi)源性抑制劑，所述內(nèi)源性抑制劑與蛋白水解酶的催化活性形式結(jié)合并使之滅活。由于存在這種嚴格的控制，因此在細胞或生理學(xué)事件中研究蛋白酶功能時需要監(jiān)測蛋白酶活性而不只是監(jiān)測蛋白酶的表達。因此，文獻中也出現(xiàn)了關(guān)于各種基于活性的化學(xué)探針的報道。一般的蛋白酶探針通過以下兩種途徑之一產(chǎn)生可檢測信號(i)通過酶切肽鍵使報告系統(tǒng)光譜性質(zhì)發(fā)生改變，或(ii)通過使機理性抑制劑與研究的蛋白酶對象共價連接。對于特定蛋白酶或一組蛋白酶的活性和抑制進行定位研究和定量研究(例如在細胞分析或全動物成像實驗中)要求研制成像探針，所述探針能夠(i)到達蛋白酶作用的生理學(xué)相關(guān)位點(例如細胞溶膠或全動物成像中的特定器官)且(ii)對于期望的蛋白酶或一組蛋白酶具有選擇性。制備蛋白酶選擇性探針對該領(lǐng)域提出了很大挑戰(zhàn)。本發(fā)明涉及(i)針對半胱氨酸蛋白酶、優(yōu)選針對半胱天冬蛋白酶亞家族的新型選擇性探針，(ii)這些探針在體外分析、在細胞或多細胞有機體中的應(yīng)用(例如通過分子成像)和(iii)合成和設(shè)計這種探針的方法。近年來，幾種分子成像技術(shù)(光學(xué)和非光學(xué)的)對于體內(nèi)特定分子靶點和路徑的非侵襲性可視化觀察已變得越來越重要。由于任何影像信號的信息內(nèi)容最初都是內(nèi)部對比度的函數(shù)，開發(fā)內(nèi)部淬滅的、在酶促反應(yīng)(例如肽鍵的裂解)中可被激活的成像探針已經(jīng)普遍應(yīng)用于催化活性的蛋白酶的成像和定位中。通過常規(guī)方法很少能夠獲得對于個別蛋白酶具有選擇性且能夠到達蛋白酶體內(nèi)作用位點的探針。制藥工業(yè)中的藥物化學(xué)家們在研制具有適當(dāng)藥代動力學(xué)特征和對于給定靶點具有適當(dāng)選擇性的藥物時也面臨相關(guān)的挑戰(zhàn)。在本發(fā)明中，我們發(fā)明了制備針對半胱氨酸蛋白酶具有選擇性活性的探針的新路線，我們已將該方法應(yīng)用于半胱天冬蛋白酶亞家族的蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的特征是在活性位點上具有半胱氨酸殘基，其在催化過程中作為親核基團。催化性半胱氨酸通常與適當(dāng)?shù)南噜徎鶊F通過氫鍵結(jié)合，以便能夠形成硫醇根離子。當(dāng)該蛋白酶識別底物時，易裂解的肽鍵被置于催化性半胱氨酸附近，所述催化性半胱氨酸攻擊羰基碳原子形成含氧陰離子中間體。然后酰胺鍵斷裂，釋放胺形式的C末端肽。易裂解的肽的N末端部分保留在共價的?；钢虚g體中，該中間體隨后被水裂解，使酶再生。底物的N末端裂解產(chǎn)物以羧酸的形式被釋放出來。半胱天冬蛋白酶是一族天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。人類基因組編碼11種半胱天冬蛋白酶。其中8種(半胱天冬蛋白酶-2、3、6、7、8、9、10和14)在細胞凋亡或程序性細胞死亡中發(fā)揮作用。它們通過高度調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)發(fā)揮作用。按照等級次序，一些半胱天冬蛋白酶啟動酶(半胱天冬蛋白酶-2、8、9和10)裂解并激活半胱天冬蛋白酶效應(yīng)酶(半胱天冬蛋白酶-3、6和7)。這些半胱天冬蛋白酶與癌癥、自身免疫病、退行性病癥和中風(fēng)有關(guān)。其它三種半胱天冬蛋白酶(半胱天冬蛋白酶-l、4和5)的功能完全不同通過激活一個亞組的炎性細胞因子介導(dǎo)炎癥。半胱天冬蛋白酶-1也叫白細胞介素-113-轉(zhuǎn)化酶(ICE)，主要存在于單核細胞中。該蛋白酶主要負責(zé)促炎性細胞因子白細胞介素-iP和白細胞介素-18的生成。已證實，在人類炎性疾病模型(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和哮喘)中抑制半胱天冬蛋白酶-1可產(chǎn)生有益作用。半胱天冬蛋白酶-3負責(zé)對各種基本蛋白質(zhì)包括細胞骨架蛋白、激酶和DNA修復(fù)酶進行蛋白水解性裂解。在神經(jīng)元中，半胱天冬蛋白酶-3是細胞凋亡的關(guān)鍵介導(dǎo)因子。已證實，在例如中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦脊髓損傷、缺氧性腦損傷、心肌缺血和再灌注損傷等模型中抑制半胱天冬蛋白酶_3具有有益效果。半胱天冬蛋白酶-8是一種細胞凋亡半胱天冬蛋白酶啟動酶，位于TNF超家族死亡受體下游。其底物包括與細胞凋亡有關(guān)的半胱天冬蛋白酶效應(yīng)酶和促凋亡因子Bcl-2的家族成員。已知癌癥對細胞凋亡的耐受與半胱天冬蛋白酶-8表達水平低有關(guān)，而且抑制半胱天冬蛋白酶_8可加強對細胞凋亡誘導(dǎo)性應(yīng)激因素例如化療和放療的耐受性。因此對于治療腫瘤和轉(zhuǎn)移性損傷而言半胱天冬蛋白酶_8是具有吸引力的靶點?；蚯贸芯窟€發(fā)現(xiàn)半胱天冬蛋白酶_8具有許多與細胞凋亡無關(guān)的其它潛在作用。例如敲除半胱天冬蛋白酶_8之后在白細胞分化、增殖和免疫應(yīng)答方面表現(xiàn)為缺陷。對于蛋白水解酶而言，決定其在細胞生理學(xué)和病理學(xué)中功能作用的是其活性而不只是表達水平。因此，抑制半胱天冬蛋白酶活性的分子可作為治療劑用于治療疾病和研制特異性成像生物標志，所述成像生物標志可使蛋白水解活性以及候選藥物對其的抑制情況可視化，這可加速靶點的確認、藥物開發(fā)甚至臨床試驗(H.Pien等，DrugDiscoveryToday,2005，10，259-266)。使用基于活性的成像試劑可以在復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物、完整細胞中甚至體內(nèi)容易地檢測特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)家族。此外，酶類別特異性探針可用于開發(fā)用于功能實驗的小分子抑制劑的篩選方法(D.A.Jeffery，M.BogyoCurr.0pp.Biotech.2003，14，87-95)。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)引入了肽底物的基于活性的成像探針，其用于在細胞分析中監(jiān)測和標記半胱天冬蛋白酶-l(W.Nishii等，F(xiàn)EBSLetters2002，518，149-153)或半胱天冬蛋白酶-3(S.Mizukami等，F(xiàn)EBSLetters1999，453，356-360)。此外，還報道了一種近紅外熒光探針，其可用于在活動物中檢測半胱天冬蛋白酶-l活性(S.Messerli等，Neoplasia2004，6，95-105)。對半胱天冬蛋白酶的酶促機理進行了比較透徹的研究，發(fā)現(xiàn)其具有高度保守性。根據(jù)可裂解肽的研究和篩選數(shù)據(jù)，開發(fā)了只與該保守性活性位點反應(yīng)的親電性底物類似物。這種探針中的親電中心通常是所謂的"彈頭"的一部分，所述"彈頭"是一種分子實體，其親電性能和幾何布置得到最優(yōu)化，使其能夠很好的與半胱天冬蛋白酶的活性位點契合，并在該位點與催化性半胱氨酸殘基反應(yīng)。已有很多種這樣的親電性底物作為機理性半胱21氨酸蛋白酶抑制劑的描述，其包括但不限于重氮甲基酮、氟甲基酮、酰氧基甲基酮、0-?；u基胺、乙烯基砜和環(huán)氧琥珀酸衍生物(S.Verhelst，M.BogyoQSARComb.Sci.2005，24，261-269)。另一種監(jiān)測蛋白酶活性的工具存在于生物發(fā)光分析中。該方法利用與蛋白酶底物連接的氨基修飾的蟲熒光素前體(beetlespro-luciferine)(Caged熒光素)或其羧基末端衍生物。第一次蛋白水解裂解釋放出熒光素，熒光素隨后被熒光素酶轉(zhuǎn)化，可檢測到發(fā)光信號。該二級分析法的應(yīng)用范圍與熒光探針相似，其額外優(yōu)點是信噪比高。蛋白酶抑制劑若要成為有效的生物學(xué)工具，則不僅要具有高效價，還必須對特定蛋白酶具有高度選擇性的結(jié)合力。開發(fā)針對特定蛋白酶的小分子抑制劑通常從肽底物開始。雖然肽具有多種生物學(xué)性質(zhì)，但其作為藥物的使用卻因為不穩(wěn)定性和口服生物利用度過低而受到限制。為使其成為有效的藥物，期望獲得的蛋白酶抑制劑的肽樣特征應(yīng)該弱化、對非選擇性蛋白水解降解作用應(yīng)具有高度穩(wěn)定性、對于給定的蛋白酶應(yīng)具有高度選擇性、在蛋白酶作用位點具有良好的生物利用度。根據(jù)這些要求，開發(fā)了半胱天冬蛋白酶抑制劑A-B，其中A是與親電性彈頭B共價連接的化學(xué)骨架。在半胱天冬蛋白酶存在下，B與催化性半胱氨酸(機理性抑制劑)發(fā)生共價反應(yīng)。在很多情況下，這種抑制劑的選擇性和藥代動力學(xué)性質(zhì)都在生物醫(yī)學(xué)研究中得以成功地最優(yōu)化。為了能夠針對催化性半胱氨酸發(fā)起有效的親電攻擊，這種抑制劑的親電中心必需在酶的活性位點內(nèi)部進行精確的定位。催化性半胱氨酸對彈頭中親電碳原子的特殊安排對應(yīng)于催化性半胱氨酸和易裂解肽底物中肽羰基的空間安排。在這種比較的指引下，我們想到將優(yōu)化的共價抑制劑(帶有化學(xué)骨架A和親電性彈頭B)"重新設(shè)計"為可裂解的底物應(yīng)該是可能的。由于化學(xué)骨架A可被認為是抑制劑選擇性的決定因素，因此我們的方法可使優(yōu)化抑制劑的選擇性或部分選擇性轉(zhuǎn)化到基于活性的化學(xué)探針內(nèi)。我們將這一過程稱為從選擇性半胱天冬蛋白酶抑制劑進行的基于活性的選擇性探針的"反向設(shè)計"。本發(fā)明涉及式(I)的針對半胱氨酸蛋白酶的分子探針{Ll-Rl-L}n-A-C0-NH-R2-L2(I)其中A是可被半胱天冬蛋白酶識別的基團；Rl是連接基團；R2是鍵或連接基團；L是鍵或能夠使Ll基團容易地結(jié)合的基團；Ll與L2彼此獨立地是任選與固體支持物結(jié)合的至少一個標記基團；且n是1;或者R2是鍵；L2是適合于偶聯(lián)生物發(fā)光分析的底物；且n是0。式(I)的化合物是針對半胱氨酸蛋白酶、優(yōu)選半胱天冬蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶的基于活性的探針(底物)。在其最基本的形式中，該化學(xué)探針由四個功能元素組成，S卩，a)作為反應(yīng)性基團的22酰胺基團-CO-NH-，其可被蛋白酶的作用裂解，b)骨架A，其定義針對給定蛋白酶靶的選擇性，c)將各亞基連接起來的連接基團Rl和R2，和d)用于檢測的一套標記基團LI和L2。優(yōu)選A基團是針對給定半胱天冬蛋白酶或一組半胱天冬蛋白酶、優(yōu)選半胱天冬蛋白酶-l、3和8的特異性的決定基團，例如表1、2、3中化合物1-43所示。本發(fā)明的基于活性的探針對于給定半胱天冬蛋白酶的選擇性因子為iooo:1、優(yōu)選i0:i，其中選擇性由優(yōu)選底物濃度下的相對轉(zhuǎn)換數(shù)(酶的轉(zhuǎn)換數(shù)1:酶2的轉(zhuǎn)換數(shù))定義。每一對酶的相對轉(zhuǎn)換數(shù)是通過用研究對象酶(酶1)的轉(zhuǎn)換數(shù)除以期望對其有選擇性的另一個酶(酶2)的轉(zhuǎn)換數(shù)來確定的。對于體內(nèi)應(yīng)用，期望在底物濃度較低(例如微摩爾或亞微摩爾)時具有高選擇性。方案1顯示了蛋白酶P與底物的反應(yīng)，其中A是特異性決定基團，P是蛋白酶，其反應(yīng)性半胱氨酸含有巰基S—:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>(方案1)反應(yīng)速率取決于底物結(jié)構(gòu)。連接基團Rl或R2優(yōu)選是分別與標記基團Ll或L2連接或者與多個相同或不同的標記基團L2或Ll連接的靈活性連接基團。根據(jù)設(shè)想的應(yīng)用進行連接基團的選擇，即根據(jù)針對特定蛋白酶的基于活性的成像探針進行選擇。連接基團也可能增加底物在適當(dāng)溶劑中的溶解度。使用的連接基團在實際應(yīng)用的條件下具有化學(xué)穩(wěn)定性。連接基團不干擾選定蛋白酶靶的反應(yīng)，也不干擾標記基團Ll和/或L2的檢測，但構(gòu)建時可考慮在某一時間點連接基團可被裂解。具體而言，連接基團Rl或R2是含有1至300個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，其中任選地，(a)—個或多個碳原子被氧替代，特別是其中每逢第三個碳原子被氧替代，例如含有1至100個氧乙烯單元的聚氧乙烯基團；和/或(b)—個或多個碳原子被帶有氫原子的氮替代，且相鄰的碳原子被氧代基團替代，形成酰胺官能團-NH-CO-;和/或(c)—個或多個碳原子被酯官能團-0-C0-替代；(d)兩個相鄰碳原子間的鍵是雙鍵或叁鍵；和/或(e)兩個相鄰的碳原子被二硫鍵替代。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)探針的應(yīng)用意圖選擇底物的標記基團Ll和L2。標記基團Ll和L2彼此獨立的是光譜探針例如熒光團；淬滅基團(quencher)或生色團；磁性探針；造影劑；能與配體特異性結(jié)合的作為特異性結(jié)合對的一部分的分子；作為酶底物的分子；與聚合物支持物、樹狀聚合物、載玻片、本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的微量滴定板共價連接的分子；或具有上述任何性質(zhì)的組合的分子。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是將修飾的氨基熒光素或其羧基末端保護的衍生物用作報告基團，當(dāng)其從中心骨架A上被裂解下來時可被熒光素酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生發(fā)光信號。因此，標記基團L2也可以是適合于偶聯(lián)生物發(fā)光分析的底物，其特征是具有修飾的氨基熒光素或其羧基末端保護的衍生物作為報告基團。US7148030公開了生物發(fā)光蛋白酶分析的實例，其包含肽作為半胱天冬蛋白酶底物，所述底物與修飾的氨基熒光素連接。優(yōu)選含有分子內(nèi)淬滅熒光探針的探針，其包含聚合物骨干(backbone)和多個熒光團，這些熒光團通過骨架A以足以導(dǎo)致熒光淬滅的密度與所述骨干共價連接。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案是使用樹狀大分子，有兩種或多種熒光團通過骨架A以足以導(dǎo)致熒光淬滅的密度與所述樹狀大分子共價連接。使用聚合物探針的優(yōu)點在于可局部遞送探針(靶向)、其在動物或人類的血液中循環(huán)時間延長。聚合物軛合使低分子量物質(zhì)的生物分布發(fā)生改變，使腫瘤特異性靶向作用成為可能(通過增強的滲透和潴留效應(yīng)(EPR效應(yīng))，使到達毒性位點的量減少，共軛聚合物與低分子量成像探針的結(jié)合是本發(fā)明進行多細胞有機體(包括哺乳動物例如小鼠、大鼠等)成像的最優(yōu)選實施方案。聚合物骨干可由任何生物相容性聚合物組成，可含有多肽、多糖、核酸或合成聚合物。關(guān)于本發(fā)明可用的聚合物的全面概述參見M.J.Vincent等，TrendsBiotech.2006，24，39-47禾口R.D皿can，NatureReviewsCancer,2006，688-701。W099/58161中公開了關(guān)于本發(fā)明可用的聚合物的進一步描述。所述的聚合物或樹狀聚合物探針可包含與骨干或樹狀分子共價連接的保護鏈。保護鏈包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇和乙二醇的其它共聚物。本發(fā)明的探針還可以含有靶向基團例如抗體、抗體片段、受體結(jié)合配體、肽片段或合成蛋白質(zhì)抑制劑。標記基團Ll和L2還可以是荷正電的直鏈或支鏈聚合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知所述聚合物可促進其中連接的分子跨活細胞膜的轉(zhuǎn)運。對于活細胞膜滲透力較差或者實際上無法透過活細胞膜的物質(zhì)而言更優(yōu)選所述聚合物。無法透過細胞的化學(xué)探針在與這樣的Ll或L2基團軛合后將能夠透過細胞膜。這種細胞膜轉(zhuǎn)運促進基團Ll和L2包括例如含有6-15個精氨酸殘基的D-和/或L-精氨酸的線性聚(精氨酸)、含有6-15個亞單位的線性聚合物(其中每個亞單位都攜帶胍基)、寡聚物或含有6至最多50個亞單位的短鏈聚合物(其中一部分攜帶胍基和/或HIV-tat蛋白序列的一部分，例如Tat49-Tat57亞單位(單字母氨基酸編碼為RKKRRQRRR)。如果Ll是兩個相互作用的光譜探針Ll/L2的一個成員且L2是其中的另一成員，例如在FRET對中的情況，那么優(yōu)選使用含有6-15個精氨酸殘基的D-和/或L-精氨酸的線性聚(精氨酸)作為聚合物標記。最優(yōu)選的Ll和/或L2標記基團是光譜探針。最優(yōu)選的L2標記基團是作為與Ll形成相互作用的光譜對的一部分的分子，以及能夠特異性結(jié)合與固體支持物共價連接的配體和分子的標記基團。特別優(yōu)選的標記基團中，Ll是兩個相互作用的光譜探針Ll/L2中的一個成員且L2是其中的另一成員，其中能量可以以非輻射方式通過動態(tài)或靜態(tài)淬滅而在供體和受體(淬滅基團)之間轉(zhuǎn)移。所述的這種標記對Ll/L2在經(jīng)過相應(yīng)的半胱天冬蛋白酶蛋白酶反應(yīng)/裂解之后光譜性質(zhì)會發(fā)生改變。這種標記對Li/L2的一個實例是FRET(F6rster共振能量轉(zhuǎn)移)對，例如熒光探針前體(pro-fluorescentprobe)，其在一端(例如Ll)用供體(報告基團)共價標記并且在另一端(L2)用受體(淬滅基團)共價標記，或反之亦然。具體而言，L1是供體(報告基團)且L2是受體(淬滅基團)，或者L1是淬滅基團24且L2是報告基團。使用該探針時，半胱氨酸蛋白酶與探針的反應(yīng)導(dǎo)致熒光的變化。與蛋白酶反應(yīng)時，雙標記底物內(nèi)部報告基團與淬滅基團之間的距離發(fā)生變化，導(dǎo)致報告基團與淬滅基團發(fā)生空間分離，從而發(fā)出熒光或使發(fā)射波長改變。多種報告基團都可以分別作為LI或L2標記基團，包括例如發(fā)射近紅外光的熒光團。在與蛋白酶反應(yīng)之前，含有報告基團和淬滅基團的底物一直保持暗色，當(dāng)反應(yīng)開始時，由于報告標記基團和淬滅標記基團發(fā)生空間分離，反應(yīng)混合物被"點亮"，熒光團發(fā)射被啟動。可通過淬滅基團或能量供應(yīng)標記基團這兩者之一的發(fā)射情況測量熒光淬滅和能量轉(zhuǎn)移。發(fā)生能量轉(zhuǎn)移時，接受能量的標記基團也發(fā)出熒光，也可以測量這一受體標記基團的熒光。這兩個相互作用的標記基團中，供體標記基團可以選自于化學(xué)發(fā)光供體探針，這樣便不需要激發(fā)燈，并降低了受體背景熒光水平。所述的使用這種雙標記底物的具體方法可用于根據(jù)熒光時間測量來測定反應(yīng)動力學(xué)，可在體內(nèi)或體外應(yīng)用?；蛘撸瑯擞浕鶊FL2可以是固體支持物、或另外連接在固體支持物上、或者連接或可連接在聚合物/固體支持物上。對于Ll/L2FRET對，優(yōu)選使用含有6_15個精氨酸殘基的D-和/或L-精氨酸的線性聚(精氨酸)作為聚合物標記。特別優(yōu)選的組合是兩個不同的親和標記基團，特別是一對互相作用的光譜標記基團Ll/L2，例如FRET對。親和標記基團的定義是指作為能夠與配體特異性結(jié)合的特異結(jié)合對的一部分的分子。特異結(jié)合對是指例如生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，此外還有甲氨蝶呤，其是二氫葉酸還原酶(DHFR)的緊密結(jié)合抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇適當(dāng)?shù)膱蟾婊鶊F和淬滅基團配對。通常，報告基團和淬滅基團是光譜重疊度很高的熒光染料，例如熒光素作為報告基團，羅丹明作為淬滅基團。其它淬滅基團有金團簇和金屬穴合物。本發(fā)明使用的第二類淬滅基團是"暗淬滅基團"，即本身沒有熒光的染料，其吸收光譜與普通報告染料的發(fā)射光譜重疊從而引發(fā)最大程度的FRET淬滅。此外，可選擇染料對以使得吸收帶重疊，以便于促進基態(tài)復(fù)合體中的共振偶極_偶極相互作用機制(靜態(tài)淬滅)。具體的熒光團和淬滅基團有Alexa染料，包括Alexa350、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa635和Alexa647(US5696157、US6130101、US6716979);二甲基氨基香豆素(例如7-二甲基氨基香豆素-4-乙酸琥珀酰亞胺酯，Invitrogen，CA92008，USA提供的產(chǎn)品D374);淬滅基團QSY35、QSY9和QSY21(Invitrogen，CA92008，USA);花青_3(Cy3)、花青5(Cy5)和花青5.5(Cy5.5)(Amersham-GEHealthcare,Solingen，Germany);BHQ-1、BHQ-2禾口BHQ-3(BiosearchTechnologies,Inc.，Novato，CA94949，USA公司的BlackHoleQuencher);熒光團ATTO488、ATT0532、ATTO600和ATTO655和淬滅基團ATTO540Q禾口ATT0612Q(Atto-Tec，D57076Siegen，Germany);熒光團DY-505、DY-547、DY-632和DY-647(Dyomics，Jena，Germany);5/6-羧基熒光素、四甲基羅丹明、4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基衍生物(Dabsyl)和4_二甲基氨基偶氮苯_4'_羰基衍生物(Dabcyl)。這些物質(zhì)可以有利地進行以下組合熒光團淬滅基團參Alexa350、二甲基氨基香豆素、5/6-參Dabsyl、Dabcyl、羧基熒光素、Alexa488、ATTO488、BHQ1、QSY35ATT0655、參5/6-羧基熒光素、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、ATT0488、ATT0532、四甲基羅丹明、Cy3、DY-505、DY-547Alexa635、Alexa647、ATT0600、ATTO540Q612Q、QSY21BHQ3、ATT0朋Q2、QSY9、DY-632、Cy5、DY-647Cy5.5與酶促反應(yīng)有關(guān)的生物發(fā)光分析產(chǎn)生的光與催化反應(yīng)的即時速率有關(guān)。該方法包含氨基修飾的氨基蟲熒光素或其羧基末端保護的衍生物，氨基熒光素中的氨基通過酰胺鍵與中心的骨架A連接，得到的底物被半胱天冬蛋白酶識別和裂解。半胱天冬蛋白酶的酶促活性使氨基熒光素與骨架A連接的肽鍵斷裂釋放熒光素酶的底物氨基熒光素。隨后熒光素酶與其底物的反應(yīng)產(chǎn)生可檢測的信號(發(fā)光)。這樣，該方法將半胱天冬蛋白酶活性與第二個酶促反應(yīng)關(guān)聯(lián)起來，產(chǎn)生可讀取的光信號。這類分析要求研制"熒光素前體"("Caged熒光素")，它只有被之前的酶促反應(yīng)例如蛋白水解裂解作用轉(zhuǎn)化為熒光素之后才被熒光素酶識別為底物。這樣，光信號直接取決于之前的酶促反應(yīng)。因此，本發(fā)明的另一實施方案旨在提供通過發(fā)光手段檢測半胱天冬蛋白酶的蛋白水解活性的探針。在一個具體實施方案中，該方法涉及一種底物，其中L2是固體支持物或者與攜帶報告基團/淬滅基團對成員之一的固體支持物連接，或者其中L2是固體支持物與報告基團/淬滅基團對成員之一的組合，且Ll是該對的另一成員。這樣，當(dāng)與適當(dāng)?shù)牡鞍酌阜磻?yīng)時暗的固體支持物會發(fā)出熒光。固體支持物可以是載玻片、微量滴定板或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何聚合物，例如功能化聚合物(優(yōu)選珠狀形式)、化學(xué)修飾的氧化表面例如二氧化硅、五氧化鉭或二氧化鈦，或者化學(xué)修飾的金屬表面例如貴金屬表面例如金或銀表面。固體支持物也可以是合適的傳感元件。優(yōu)選式(I)化合物含有作為半胱天冬蛋白酶-l抑制劑的A基團。具有半胱天冬蛋白酶-1抑制活性的骨架A的制備方法描述于例如US5670494;W09526958;W09722619;W09816504;W00190063;W003106460;W003104231;W003103677;W.G.Harter，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14,809-812;Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，2779-2782;Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.2002，10，31-40;M.C.Laufersweiler等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15,4322—4326;K.T.Chapman,Bioorg.Med.Chem.Lett.1992，2,613-618;Dolle等，J.Med.Chem.1997,40，1941—1946;D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4233-4236;D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.2006，14，7880-7892;D.J.Lauffer等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，12，1225-1227;和C.D.Ellis等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4728-4732中。更優(yōu)選式(I)化合物是針對半胱天冬蛋白酶_1的探針，其特征是含有以下的優(yōu)選骨架A的化合物(表l):表1-針對半胱天冬蛋白酶-1的選擇性探針(I)的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>其中n是l-4m是l或2，且R是甲基或甲氧基。其中n是l-4。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>其中1至28組中變量的定義如相應(yīng)化合物近旁的定義所述；X是-C0NH-R2-L2;Y是-L-Rl-Ll;且Rl、R2、L、Ll和L2如上所述。進一步優(yōu)選式(I)化合物含有作為半胱天冬蛋白酶-3抑制劑的A基團。具有半胱天冬蛋白酶-3抑制活性的骨架A的制備方法描述于例如W00032620;W00055127;W00105772;W003024955;W02008/008264;P.Tawa等，CellDeathandDifferentiation2004，11,439-447;Micale等，J.Med.Chem.2004，47，6455-6458;和Berger等，MolecularCell，2006，23，509-521中。更優(yōu)選式(I)化合物是針對半胱天冬蛋白酶_3的探針，其特征是含有以下的優(yōu)選骨架A的化合物(表2):表2-針對半胱天冬蛋白酶-3的選擇性探針(I)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>頁9)0-(d-Q)烷基-C02H,其任選被(d-C6)烷基或(CVC7)環(huán)烷基酯化，10)CH=CHC02H，11)C02H,12)(C廣Cs)烷基-C02H，13)C(0)NH2,其在氮原子上任選被1-2個(C廣C4)烷基取代，14)(d-Cs)烷基-C(0)NH2，其在氮原子上任選被1-2個(d畫C4)烷基取代，15)S(OVHC廣C4)烷基，16)(C廣C2)烷基-S(0)o-2-(CrC4)烷基，17)S(OV2-(C廣C6)烷基或S(0)o-2-苯基，其中所述烷基和苯基部分任選被l-3個選自于下組的基團取代由素、CN、(C,-C4)烷基和(C廣C4)烷fL^，所述烷基和烷氧基任選被l-3個鹵素取代，18)苯甲酰基，其任選被l-2個選自于下組的基團取代卣素、CN、(C廣C4)烷基和(C，-C4)烷氧基，所皿基和烷氧基任選被l-3個鹵素取代，19)苯基或萘基，其任選被l-2個選自于下組的基團取代鹵素、CN、(C廣d)烷基和(C廣C4)烷猛，所述烷基和烷氧基任選被l-3個鹵素取代，20)CN,21)(C廣Q)亞烷基-HET2，其中HET2是含有l(wèi)-4個選自于O、S、NH和N(d-C0的雜原子的5-7元芳環(huán)或非芳環(huán)，其任選含有l(wèi)-2個氧代基團，任選被l-3個(CrC0烷基、OH、鹵素或(CrQ)?；〈?；22)0-(C廣C4)烷基-HET3，其中HET3是含有1至3個選自于O、S和N的雜原子的5或6元芳環(huán)或非芳環(huán)，其任選被一個或I兩個選自于卣素和(d-Ct)烷基的基團取代，任選含有l(wèi)-2個38<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>14)(C廣Cs)烷基-C(0)NH2,其在氮原子上任選被1-2個(C,-C4)烷基取代，15)S(OV2-(C廣C4)烷基，16)((VC2)烷基-S(OVHd-C4)烷基，17)S(0)o-2-(C廣C6)烷基或S(OV2-苯基，其中所述烷基和苯基部分任選被1-3個選自于下組的基團取代離素、CN、(C廣C4)烷基和(d-C4)烷氧基，所述烷基和烷氧基任選被l-3個鹵素取代，18)苯甲酰基，其任選被l-2個選自于下組的基團取代卣素、CN、(C廣C4)烷基和(C廣C4)烷氧基，所述烷基和烷fU^任選被l-3個卣素取代，19)苯基或萘基，其任選被l-2個選自于下組的基團取代鹵素、CN、(CVC0烷基和(d-C4)烷氧基，所述烷基和烷氧基任選被l-3個卣素取代，20)CN,21)(d-Ci)亞烷基-HET2,其中HET2是含有l(wèi)-4個選自于O、S、NH和N(d-C4)的雜原子的5-7元芳環(huán)或非芳環(huán)，其任選含有l(wèi)-2個氧代基團，任選被1-3個(Q-C0烷基、OH、鹵素或(C廣C0^b^取代；22)0-(C廣C4)烷基-HET3，其中HET3是含有1至3個選自于O、S和N的雜原子的5或6元芳環(huán)或非芳環(huán)，其任選被一個或兩個選自于卣素和(C廣CO烷基的基團取代，任選含有l(wèi)-2個氧^m團，和23)HET4，其中HET4是5或6元芳環(huán)或非芳環(huán)及其苯并稠合類似物，含有1至4個選自于0、S和N的雜原子，且任選被一個或兩個選自于卣素、(d-C4)烷基和(d-C4)?；幕鶊F取|代，其中鹵素包括F、Cl、Br和I。_<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>其中29至42組中變量的定義如相應(yīng)化合物近旁的定義所述；X是_C0NH-R2_L2;Y是-L-R1-L1;且Rl、R2、L、LI和L2如上所述。此外還優(yōu)選式(I)化合物含有作為半胱天冬蛋白酶-8抑制劑的A基團。具有半胱天冬蛋白酶_8抑制活性的骨架A的制備方法描述于例如Berger等，MolecularCell,2006,23,509-521;和Garcia-Calvo，J.Biol.Chem.1998，273(49)，32608-32613。更優(yōu)選式(I)化合物是針對半胱天冬蛋白酶-8的探針，其特征是含有以下優(yōu)選的骨架A的化合物(表3):表3-針對半胱天冬蛋白酶_8的選擇性探針(I)實例<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>其中X是-C0NH-R2-L2;Y是-L-Rl-Ll;且Rl、R2、L、LI和L2如上所述。若非另外說明，則以下定義適用。烷基是指具有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烴基。(C「Ce)烷基的實例有甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁基、丁基、叔丁基、仲丁基、戊基和己基。?；亩x是_C(=0)烷基。芳基的定義是具有6至10個碳原子的芳烴。芳基的實例包括苯基和萘基。雜芳基的定義是其中一個或多個芳烴碳原子被雜原子替代的芳基，其中"雜原子"包括氧、氮、硫和磷。雜芳基包括呋喃、噻吩、苯并噻吩、吡咯、噻唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、苯并呋喃、噴哚、香豆素、喹啉、異喹啉和萘啶。環(huán)烷基是指具有3至10個碳原子的環(huán)狀烷基。環(huán)烷基的實例包括環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷和環(huán)己烷。雜環(huán)或雜環(huán)基是指其中一個或多個碳原子被雜原子替代的環(huán)烷基。雜環(huán)基的實例包括哌嗪、嗎啉和哌啶。所述芳基、雜芳基或環(huán)烷基可以被一個或多個相同或不同的取代基取代。合適取代基的實例包括烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羥基、鹵素、三氟甲基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、N02、CN、C02H、C02烷基、S03H、CHO、C(=0)烷基、CONH2、CONH-烷基、CONHRq、C(=0)N(烷基)2、(CH2)nNH2、0H、CF3、0(C「Ce)烷基、(CH2)nNH_烷基、NHRq、NHC0Rq、苯基，其中n是1至5且R,是氫或(C「C6)烷基。關(guān)于本發(fā)明的基于活性的探針的合成，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)谋Ｗo基化學(xué)構(gòu)建中心骨架A，并通過L基團和-C(O)-NH-基團使該骨架A與兩個連接基團之一和標記基團Ll或L2連接。適宜的構(gòu)建基本元件以及FRET對例如花青染料(例如Cy3B、Cy5.5、Cy7)可商購獲得(例如Sigma-Aldrich、GE-Healthcare)。對于本發(fā)明描述的探針亞組，固相合成方法特別有用(B.J.Merrifield，MethodsinEnzymology1997,289，3-13)。根據(jù)合成要求，連接基團、淬滅基團或熒光團的連接可以在固體支持物上完成或者通過溶液相化學(xué)完成。—般而言，中心骨架A上的反應(yīng)性側(cè)鏈基團和任選的L基團將被保護，然后依次被釋放，以分別進一步用L1R1和L2R2亞單位進行修飾。可根據(jù)化學(xué)合成領(lǐng)域的已知方法完成這些亞單位的結(jié)合。特別有用的是染料活性酯與骨架A的伯胺基團之間進行反應(yīng)使兩個單位通過酰胺鍵連接。中間體和終產(chǎn)物探針分子在用于標記和成像實驗之前可以經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)純化，并通過質(zhì)譜和分析HPLC進行鑒定。以下段落通過一些非限制性實例舉例說明本發(fā)明。在優(yōu)選的實施方案中，式(I)的探針含有衍生于四肽半胱天冬蛋白酶-l抑制劑的骨架A(表l，化合物2)，其在C末端和N末端攜帶發(fā)色團。對發(fā)色團進行適當(dāng)?shù)倪x擇，從而使其光譜性質(zhì)適合于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。發(fā)色團可以發(fā)射熒光也可以不發(fā)射熒光。原則上，本發(fā)明可以使用多種發(fā)色團，只要符合蛋白水解裂解肽鍵之后光譜會發(fā)生變化這一基本要求即可。這種互相作用的發(fā)色團與中心骨架的連接可任選通過連接單位進行。優(yōu)選熒光團選自于咕噸染料或花青染料。更優(yōu)選選自于碳花青類、硫雜花青類、氧雜花青類和氮雜花青類的花青染料。適用于本發(fā)明的花青染料公開于US5268468和US5627027中。包括商標名(Amersham，GEHealthcare)為Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和Cy7.5的染料。優(yōu)選淬滅單元是非熒光發(fā)色團，其包括2，4-二硝基苯基、4_(4-二甲基氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)、7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基和W09964519中公開的非熒光花青染料。在優(yōu)選的實施方案中，淬滅基團沒有顯著的發(fā)射，更優(yōu)選淬滅基團是非熒光發(fā)色團。在該實施方案中，成像試劑含有熒光團和非熒光(暗)受體發(fā)色團。更優(yōu)選的是基于四肽骨架的式(I)的探針(表1、化合物2)，其N末端攜帶QSY21-淬滅基團，C末端攜帶CY5.5熒光團(方案2):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>(方案2)。另一優(yōu)選實施方案包括相同骨架，其N末端攜帶暗淬滅基團BHQ3，C末端攜帶Cy7熒光團(方案3):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>(方案3)。在一個優(yōu)選實施方案中，選擇熒光素和四甲基羅丹明作為互相作用的FRET對，且四甲基羅丹明是位于骨架的N末端側(cè)，而熒光素與C末端連接，如(方案4)所示OHCI(方案4)。在另一優(yōu)選實施方案中，相互作用的FRET對的一個成員含有納米粒子。本發(fā)明更優(yōu)選的是CdSe納米粒子(例如量子點(Quantum-dots))、鑭系元素離子摻雜的氧化物納米粒子(例如Y。.6Eu。.4V04)和氧化鐵納米粒子(例如VisEnMedical,Inc.，MA01801，USA提供的AminoSPARK680和AminoSPARK750)。如果這種納米粒子在FRET對中作為供體，其激發(fā)波長遠遠短于受體吸收波長，因此直接受體激發(fā)可被降至最低。而且，供體發(fā)射波長范圍窄，不會與受體發(fā)射波段重疊。此外，已證明這種納米粒子比可發(fā)生快速光致褪色的有機染料的光學(xué)穩(wěn)定性好。用于化學(xué)共軛作用的活化量子點可商購獲得(Invitrogen，CA92008，USA)，其發(fā)射波長可以從多種產(chǎn)品中選擇。方案5和6顯示了基于量子點的對半胱天冬蛋白酶-l特異性的式(I)的探針。因此，在進一步優(yōu)選的式(I)的探針中，量子點(例如Invitrogen，CA92008,USA提供的QD605)可以通過適當(dāng)?shù)倪B接基團與半胱天冬蛋白酶-l探針的N末端連接(方案5)或與半胱天冬蛋白酶-1的C末端連接(方案6)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>(方案5);(方案6)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>量子點由黑色圓圈代表，合適的受體分子由花青染料CY7代表。在另一優(yōu)選實施方案中，式(I)的探針中的量子點通過蛋白水解可裂解的亞單位與金納米粒子連接(方案7):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>(方案7)。量子點和金納米粒子由黑色圓圈代表。已顯示金納米粒子(AuNP)對于有機熒光染料和量子點而言是有效的淬滅基團。量子點與AuNP的組合應(yīng)用公開于例如W02006126570中。在另一優(yōu)選實施方案中，式(I)的探針由多FRET系統(tǒng)組成，其中兩個特異性蛋白酶探針共價連接在一起(方案8):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>(方案8)。在這一構(gòu)型中，可以在單一波長下激發(fā)并使用不同的發(fā)射比作為獨特的FRET信號(K.ES即sford等，Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，4562-4588)。該探針在一個分子中合并了兩個獨特特殊結(jié)構(gòu)，即半胱天冬蛋白酶-1的骨架和半胱天冬蛋白酶_3的骨架。在另一優(yōu)選實施方案中，對式(I)的探針進行設(shè)計以使其循環(huán)時間長、腫瘤累積量高，并且含有在酶激活后可在近紅外光譜內(nèi)發(fā)出熒光的淬滅的熒光標記物。這些探針基于合成的接枝共聚物[部分用甲氧基聚(乙二醇)修飾的聚-L-賴氨酸]，其中有多個NIR熒光團連接在游離的聚賴氨酸殘基上。由于NIR發(fā)色團的密度高和距離近所導(dǎo)致的內(nèi)部淬滅，這些大分子的熒光被大大減弱。例如，方案9顯示了基于聚合物的半胱天冬蛋白酶-1探針，其中A與D-和/或L-賴氨酸的聚賴氨酸骨干的連接通過C末端的連接基團完成，而NIR發(fā)色團Cy5.5通過N末端的連接基團連接Cy5.5Cy5.5NHMPEGNHMPEG(方案9)。方案10給出了相反的情況，其中A與D-和/或L-賴氨酸的聚氨酸骨干的連接通過N末端的連接基團完成，而NIR發(fā)色團Cy5.5通過C末端的連接基團連接<formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula>(方案IO)。在另一優(yōu)選實施方案中，在設(shè)計式(I)的探針時，目標是將其用于同相酶聯(lián)發(fā)光分析。以下方案給出了上述作用機理的一般情況。熒光素是熒光素酶的底物，第二個酶促反應(yīng)會產(chǎn)生光信號[o"e]以下方案顯示了上述作用機理，其中熒光素被噠嗪并二氮雜革衍生物掩蔽，其通過所述半胱天冬蛋白酶-1的蛋白水解活性釋放<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>本發(fā)明還涉及設(shè)計用于在體外分析、在細胞或多細胞有機體中觀察單個蛋白水解酶或蛋白水解酶組的催化活性的分子探針的方法，其特征是將單個蛋白水解酶或一組蛋白水解酶的抑制劑轉(zhuǎn)化為針對所述的單個蛋白水解酶或一組蛋白水解酶、優(yōu)選半胱天冬蛋白51酶的選擇性成像探針。為此，我們用易裂解的酰胺鍵替代某些已知半胱天冬蛋白酶抑制劑中的親電基團。優(yōu)選化合物的合成方式是使特定靶點的酶促活性(例如蛋白水解活性)產(chǎn)生可檢測的信號。具體而言，優(yōu)選的探針含有內(nèi)部淬滅的熒光團(例如適當(dāng)?shù)腇RET對)，所述熒光團與(i)易裂解鍵N末端的特異性決定基團A和(ii)易裂解鍵的C末端連接。本發(fā)明可將已知抑制劑的期望性質(zhì)和先前最優(yōu)化的性質(zhì)轉(zhuǎn)化為新的基于活性的探針?，F(xiàn)有技術(shù)描述的半胱天冬蛋白酶抑制劑在P1位置使用親電性彈頭。本發(fā)明的基于活性的探針利用所述已知的骨架并進行兩處修飾，首先是親電彈頭轉(zhuǎn)化為易裂解的酰胺基團，其次是在易裂解的酰胺基團的兩側(cè)安置相互作用的標記對或性能調(diào)節(jié)劑。在體外，蛋白酶與本發(fā)明底物的反應(yīng)通常可在細胞提取物中進行或者用蛋白酶的純化形式或富集形式進行。對于體內(nèi)應(yīng)用，報告基團的發(fā)射波長優(yōu)選在近紅外(NIR)波段，因為該波段沒有生物熒光的干擾。符合這些要求的已知的花青NIR染料優(yōu)選被引入本發(fā)明的底物中。式(I)化合物的分子架構(gòu)由攜帶酰胺官能團的中心骨架A和兩個亞單位L1R1和L2R2組成。如式(I)所示，L2R2總是通過酰胺鍵與骨架A連接，因為酰胺鍵可被半胱天冬蛋白酶酶裂解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇用于將亞單位L1R1與骨架A連接的合適的官能團，以下給出一些實例。前體化合物中的特異性官能團L'可以位于骨架A上以便連接適宜的L1R1亞單位而在式(I)化合物內(nèi)形成L基團，只有合成策略的要求和這種底物作為基于活性的成像試劑的最終用途對其構(gòu)成限制。這些基團的選擇將取決于所選擇的用來構(gòu)建期望底物的具體試劑。在骨架A上將A與亞單位L1R1連接起來的官能團L'的實例包括氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、疊氮、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲?；?、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、醛基、羥基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳碳雙鍵、碳碳叁鍵等。最優(yōu)選的實例包括氨基、疊氮、羥基、氰基、羧基、氨基甲酰基、醛基、碳碳雙鍵或碳碳叁鍵。因此，L優(yōu)選是鍵或選自于義,j_(NRx)-、-0-、-C=N-、-C(=0)-、-C(=0)-NH-、-NH-C(=0)-、-C(=0)H、-CRx=CRy-、-C三C-和苯基的基團，其中Rx和Ry獨立的是H或院基。具體而言，式(I)化合物的優(yōu)選合成方法利用正交保護的官能團。這種保護基的選擇使得能夠獨立地脫保護，從而每個被釋放的官能團隨后能進一步被化學(xué)處理以將相應(yīng)的亞單元連接于骨架A。本領(lǐng)域技術(shù)人員可為設(shè)想的官能團選擇合適的保護基團，有關(guān)保護基團的概述參見例如T.W.Greene禾口P.G.M.Wuts，"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，，，JohnWiley&Sons，NewYork1991。式L'-A-C0-0H的化合物(骨架)可根據(jù)本領(lǐng)域的標準方法制備，例如國際專利申i青US5670494;W09526958;W09722619;W09816504;W00032620;W00055127;W00105772;W00190063;W003024955;W003106460;W003104231;W003103677;W.G.Harter，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14,809-812;Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001，11，2779-2782;Shahripour等，Bioorg.Med.Chem.2002，10，31-40;M.C.Laufersweiler等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005，15,4322—4326;K.T.Chapman,Bioorg.Med.Chem.Lett.1992，2,613-618;Dolle等，J.Med.Chem.1997,40，1941—1946;D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，4233-4236;D.L.Soper等，Bioorg.Med.Chem.2006，14，7880-7892;D.J.Lauffer等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，12，1225—1227;C.D.Ellis等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16,4728-4732;P.Tawa等，CellDeath和Differentiation2004,11，439-447;Micale等，J.Med.Chem.2004，47，6455-6458;Berger等，MolecularCell,2006，23，509-521;和Garcia-Calvo，J.Biol.Chem.1998，273(49)，32608-32613中所述的方法。本發(fā)明還涉及式(I)化合物的制備方法，其特征在于，如果n是1:(a)將式(II)的化合物L(fēng)，-A-C0-0H(II)其中A具有以上所述的一般含義和優(yōu)選含義中的定義，L'是氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、疊氮、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、醛基、羥基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳碳雙鍵、碳碳叁鍵，優(yōu)選氨基、疊氮、羥基、氰基、羧基、氨基甲?；?、醛基、碳碳雙鍵或碳碳叁鍵，更優(yōu)選氨基，在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下，與式L1-R1-H的化合物反應(yīng)，其中Ll具有以上所述的一般含義和優(yōu)選含義中的定義，得到式(III)化合物，L1-R1-L-A-C0-0H(III)(b)將式(III)化合物與化合物H2N-R2-L2反應(yīng)得到式(I)化合物。任選地，式(I)化合物的合成方法利用正交保護的官能團。這種保護基的選擇使得能夠獨立地脫保護，從而每個被釋放的官能團隨后能進一步被化學(xué)處理以與標記基團連接或在連接基團Rl和/或R2上進一步引入延伸基團。本領(lǐng)域技術(shù)人員可為設(shè)想的官能團選擇合適的保護基團，有關(guān)保護基團的概述參見例如T.W.Greene和P.G.M.Wutsin"ProtectiveGroupsin0rganicSynthesis，，，JohnWiley&Sons，NewYork1991。式(I)的探針的另一種制備方法中，n是l，其包括(al)將式(II)的化合物與式(IV)的化合物在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下反應(yīng)H2N-L2_PG2(IV)生成式(V)的化合物L(fēng)，-A-C0-NH-R2-PG2(V)(b)然后將式(V)的化合物與式(VI)的化合物PG1-R1-L"(VI)在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各基團所需的條件下反應(yīng)，生成化合物PG1-R1-L-A-C0-NH-R2-PG2(VI)其中PG1和PG2彼此獨立的是保護基團，優(yōu)選正交保護基團，L"是需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的針對L'的連接基團，或者是鍵(cl)將化合物(VI)的PG2基團裂解并將所得化合物與標記基團L2反應(yīng)，然后將保護基團PG1裂解并將所得化合物與標記基團Ll反應(yīng)得到式(I)化合物，或者(c2)將化合物(VI)的PG1基團裂解并將所得化合物與標記基團Ll反應(yīng)，然后將保護基團PG2裂解并將所得化合物與標記基團L2反應(yīng)得到式(I)化合物。在步驟(b)中，優(yōu)選的L'和L"組合和反應(yīng)類型(括號中)如下當(dāng)L'是氟、氯、溴、碘時，L"是氨基(R-NH2)、羥基(R-0H)、叁鍵(Sonogashira反53應(yīng))、雙鍵(Heck反應(yīng))、烷基硼烷(Suzuki反應(yīng))；是氰基時，L"是氨基(R-NH》、羥基(R-0H)、巰基(R-SH);是氨基時，L"是活化羧酸(NHS酯...)、醛、氟、氯、溴、碘；是疊氮時，L"是叁鍵、膦基團(Staudinger連接)；是羧基時，L"是氨基、羥基、酰肼；是烷氧基羰基時，L"是氨基、羥基、酰肼；是芳基氧基羰基時，L"是氨基、羥基、酰肼；是羥基時，L"是氟、氯、溴、碘、羥基(Mits皿obu反應(yīng))、羧基；是醛時，L"是氨基、肼；是碳碳雙鍵時，L"是溴、氯、碘(Heck反應(yīng))、烷基硼烷(Suzuki反應(yīng))；是碳碳叁鍵時，L"是溴、氯、碘(Sonogashira反應(yīng))、疊氮。n是0的式(I)化合物可通過使式A-C0-0H(IV)的化合物與化合物H2N_R2_L2反應(yīng)來制備得到式(I)的探針。優(yōu)選在固體支持物上合成用不同的標記基團功能化的半胱氨酸蛋白酶底物。對于具有模擬肽結(jié)構(gòu)的式(I)的半胱天冬蛋白酶探針的合成，可以在固相合成中使用非肽類構(gòu)建基本元件。實施例8中進一步描述了構(gòu)建基本元件的合成。構(gòu)建基本元件(VII)優(yōu)選用于合成半胱天冬蛋白酶-1探針，例如實施例1和2的化合物，當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'當(dāng)L'射(VII)。本發(fā)明的探針優(yōu)選是半胱天冬蛋白酶-l、半胱天冬蛋白酶-3或半胱天冬蛋白酶-8的探針。本發(fā)明的探針用于在體外、在細胞培養(yǎng)實驗、離體實驗或活有機體(體內(nèi))環(huán)境下的分子成像，包括篩選和全動物成像。最優(yōu)選的是成像應(yīng)用例如光學(xué)成像和磁共振成像(MRI)。本發(fā)明的探針旨在用于蛋白酶活性的診斷成像。最優(yōu)選的是提供監(jiān)測藥物或類藥物物質(zhì)對目標蛋白酶作用的方法的應(yīng)用。施用這種藥物或類藥物物質(zhì)對于本發(fā)明探針發(fā)出的信號應(yīng)該具有可測量的效果。本發(fā)明探針的另一最優(yōu)選方面是其作為成像試劑在指導(dǎo)手術(shù)和監(jiān)測藥物治療效果方面的用途。手術(shù)指導(dǎo)包括檢測腫瘤邊緣和檢測腫瘤轉(zhuǎn)移進展。因此，本發(fā)明的另一方面是活有機體成像的方法，其包括(a)向所述有機體施用式(I)的探針，(b)將所述有機體暴露于可激發(fā)非淬滅熒光團的電磁輻射以產(chǎn)生可檢測的信號，和(c)檢測所述信號，從而創(chuàng)建影像?；蛘撸钣袡C體成像的方法包括[oaoo](a)向所述有機體施用式(I)的探針，(b)將所述有機體暴露于可激發(fā)熒光團的電磁輻射以產(chǎn)生可檢測的信號，和(c)檢測所述信號，從而創(chuàng)建影像。"活有機體"可以是任何含有待檢測的半胱氨酸蛋白酶的活細胞或完整有機體，優(yōu)選的活有機體是哺乳動物，例如小鼠或大鼠。本發(fā)明的探針具有高選擇性，從而可避免假陽性的風(fēng)險。縮略語DMF二二甲基甲酰胺DMSO二二甲亞砜DCM二二氯甲烷equiv.=當(dāng)量sat.=飽和的THF二四氫呋喃DIPEA=二異丙基乙基胺HOAt=1-羥基-7-氮雜苯并三唑HATU=0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽NHS=N-羥基琥珀酰亞胺酯固相肽合成的一般方法根據(jù)標準固相肽合成法合成以下探針。用2-氯三苯甲基樹脂作為固體支持物。加載樹脂時，將2當(dāng)量的Fmoc保護的氨基酸和3當(dāng)量的DIPEA溶于DCM，將反應(yīng)混合物加至樹脂中(加載量1.4mmol/g)。將反應(yīng)混合物在室溫下振搖過夜。用DCM和DMF洗滌樹脂。進行Fmoc去保護時，將樹脂用30%哌啶/DMF溶液處理兩次15分鐘。進行固相肽合成時，使用標準實驗方案將4當(dāng)量的Fmoc保護的氨基酸、4當(dāng)量的HATU、4當(dāng)量的HOAt和8當(dāng)量的DIPEA溶于DCM/DMF(1/1)混合物中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20分鐘，然后加至樹脂中。將反應(yīng)混合物振搖2小時，如果Fmoc保護的氨基酸在立體化學(xué)上受到阻礙則振搖更長時間。從固相進行裂解時，用5XTFA在DCM中的溶液處理樹脂兩次15分鐘。減壓共同蒸除溶劑和甲苯，終產(chǎn)物經(jīng)制備HPLC純化(梯度H20+0.05%TFA;5至95%CH3CN)。實施例1:半胱天冬蛋白酶-l探針根據(jù)一般方法在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)。計算值:[M+H]+=1569.70，實測值:[M+H]+=1569.45。收率54%。實施例2:半胱天冬蛋白酶-1探針<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>根據(jù)一般方法在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)計算值[M+H]+=1583.73實測值[M+H]+=1583.2。收率72%。實施例3:半胱天冬蛋白酶-1探針根據(jù)一般方法在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)。計算值:[M+H]+=1517.66實測值:[M+H]+=1517.55。收率59%。實施例5:半胱天冬蛋白酶-3探針<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>根據(jù)一般方法在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)計算值[M+H]+=1591.19實測值[M+H]+=1591.50。收率66%。實施例4:半胱天冬蛋白酶-3探針<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>根據(jù)一般方法在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)計算值[M+H]+=1546.79實測值[M+H]+=1546.35。收率61%。實施例6:半胱天冬蛋白酶-8探針根據(jù)一般方法在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)計算值[M+H]+=1523.45實測值[M+H]+=1523.25。收率55%。實施例7O根據(jù)W09722619中所述的一般方法制備構(gòu)建基本元件(VII)。輔M8:判光砂舶ft-l物^"雄^60<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>根據(jù)一般方法，從6-Fmoc-氨基_D_熒光素開始在固體支持物上制備化合物，經(jīng)HPLC純化(H20+0.05%TFA;4-95%CH3CN)。計算值:[M+H]+=772.82，實測值:[M+H]+=773.15。收率13%。權(quán)利要求式(I)的針對半胱氨酸蛋白酶的分子探針{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2(I)其中A是可被半胱天冬蛋白酶識別的基團；R1是連接基團；R2是鍵或連接基團；L是鍵或能夠使L1基團容易地結(jié)合的基團；L1與L2彼此獨立地是任選與固體支持物結(jié)合的至少一個標記基團；且n是1；或者R2是鍵；L2是適合于偶聯(lián)生物發(fā)光分析的底物；且n是0。2.權(quán)利要求l的探針，其中半胱天冬蛋白酶是半胱天冬蛋白酶-l、半胱天冬蛋白酶-3或半胱天冬蛋白酶-8。3.權(quán)利要求1或2之任一項的探針，其中L是鍵或選自于_(NRx)-、-0-、-C=N-、-C(=0)-、-C(=0)-NH-、-NH-C(=0)-、_C(=0)H、_CRx=CRy-、_C三C_和苯基的基團，其中Rx和Ry獨立的是H或(C「Ce)烷基。4.權(quán)利要求1至3之任一項的探針，其中Rl或R2是含有1至300個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基，其中任選地，(a)—個或多個碳原子被氧替代，特別是其中每逢第三個碳原子被氧替代，例如含有1至100個氧乙烯單元的聚氧乙烯基團；和/或(b)—個或多個碳原子被帶有氫原子的氮替代，且相鄰的碳原子被氧代基團替代，形成酰胺官能團-NH-C0-;和/或(c)一個或多個碳原子被酯官能團-0-C0-替代；(d)兩個相鄰碳原子間的鍵是雙鍵或叁鍵；和/或(e)兩個相鄰的碳原子被二硫鍵替代。5.權(quán)利要求1至4之任一項的探針，其中標記基團LI和L2彼此獨立的是光譜探針例如熒光團；淬滅基團或發(fā)色團；磁性探針；造影劑；能與配體特異性結(jié)合的作為特異性結(jié)合對的一部分的分子；與固體支持物共價連接的分子，其中所述支持物可以是載玻片、微量滴定板或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何聚合物；具有期望的酶促性質(zhì)、化學(xué)或物理性質(zhì)的生物分子；或具有上述任何性質(zhì)的組合的分子；或荷正電的直鏈或支鏈聚合物。6.權(quán)利要求5的探針，其中標記基團LI和L2彼此獨立的與荷正電的直鏈或支鏈聚合物連接。7.權(quán)利要求6的探針，其中標記基團LI和L2之一是含有6-15個精氨酸殘基的D_和/或L-精氨酸的線性聚(精氨酸)。8.權(quán)利要求5至7之任一項的探針，其中LI是兩個相互作用的光譜探針Ll/L2的一個成員且L2是其中的另一成員。9.權(quán)利要求8的探針，其中Ll/L2是FRET對。10.權(quán)利要求9的探針，其中一個Ll/L2是熒光團，其選自于Alexa350、二甲基氨基香豆素、5/6-羧基熒光素、Alexa488、ATT0488、DY_505、5/6-羧基熒光素、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、ATTO488、ATTO532、四甲基羅丹明、Cy3、DY_505、DY_547、Alexa635、Alexa647、ATT0600、ATT0655、DY-632、Cy5、DY-647Cy5.5，另一個Ll/L2標記基團是淬滅基團，其選自于Dabsyl、Dabcyl、BHQ1、QSY35、BHQ2、QSY9、ATTO540Q、BHQ3、ATT0612Q、QSY21。11.權(quán)利要求1至4之任一項的探針，其中n是0，R2是鍵且L2是適合于偶聯(lián)生物發(fā)光分析的底物，其特征是將修飾的氨基熒光素或其羧基末端保護的衍生物用作報告基團，當(dāng)其從中心骨架A上被裂解下來時可被熒光素酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生發(fā)光信號。12.權(quán)利要求1至11之任一項的選擇性半胱天冬蛋白酶-1探針，其特征是下表的化合物1-28:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>優(yōu)選如下構(gòu)型:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>13.<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>14.權(quán)利要求1至11之任一項的選擇性半胱天冬蛋白酶-8探針，其特征是下表的化合物43-44:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>15.制備權(quán)利要求1至14的式(I)的探針的方法，其特征為如果n是1:(a)將式(II)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>與式Ll-Rl-H的化合物反應(yīng)，得到式(III)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(b)將式(III)化合物與化合物H2N-R2-L2反應(yīng)得到式(I)的探針，其中L'是氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、疊氮、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲?；⑼檠趸驶?、芳基氧基羰基、醛基、羥基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳碳雙鍵、碳碳叁鍵，優(yōu)選氨基、疊氮、羥基、氰基、羧基、氨基甲?；⑷┗?、碳碳雙鍵或碳碳叁鍵，更優(yōu)選氨基，且Rl和/或R2可以被合適的正交保護基團保護并在式(I)化合物的制備過程中先后被裂解；且若n是0:則使式A-C0-0H(IV)的化合物與化合物H2N-R2-L2反應(yīng)來制備得到式(I)的探針。16.權(quán)利要求1至14的式(I)的探針用于在體外、在細胞培養(yǎng)實驗、離體實驗或活有機體內(nèi)分子成像的用途。17.權(quán)利要求1至14的式(I)的探針用于活有機體分子成像的用途，其包括(a)向所述有機體施用式(I)的探針，(b)將所述有機體暴露于可激發(fā)非淬滅熒光團的電磁輻射以產(chǎn)生可檢測的信號，禾口(c)檢測所述信號，從而創(chuàng)建影像。權(quán)利要求1至14的式(I)的探針用于活有機體分子成像的用途，其包括(a)向所述有機體施用式(I)的探針，(b)將所述有機體暴露于可激發(fā)熒光團的電磁輻射以產(chǎn)生可檢測的信號，和(c)檢測所述信號，從而創(chuàng)建影像。全文摘要本發(fā)明涉及本文定義的式(I){L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2(I)的分子探針，其可用于在體外分析、在細胞或多細胞有機體中觀察所選半胱天冬蛋白酶的催化活性，本發(fā)明還涉及這種探針的制備方法和用途。{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2(I)。文檔編號C12Q1/37GK101772577SQ200880101733公開日2010年7月7日申請日期2008年7月17日優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日發(fā)明者C·米尼尤,K-U·文特,M·凱恩德曼申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司