專利名稱：具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因及其抗腫瘤應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域的基因治療，具體涉及基因工程方法構建具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因(我們把它命名為immunocaspase-6)、由所述基因編碼的多肽、含有所述基因的載體及上述物質(zhì)在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤是當今社會嚴重威脅人類健康的疾病之一，目前，臨床治療腫瘤仍局限于手術切除與放、化療結合的傳統(tǒng)治療手段，存在著特異性差、治療后易復發(fā)等缺點。目前的治療方法不能從根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此療效不盡如人意。尤其是很多研究表明HER2陽性的乳腺癌預后往往很差，還沒有行之有效的治療藥物和手段。
基因治療的出現(xiàn)給人們帶來了新的希望?；蛑委?，就是采用基因修飾的途徑，改變活細胞遺傳物質(zhì)，以達到徹底消除疾病目的的一種全新的治療手段。它在治療腫瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遺傳、代謝類疾病等的嘗試中都取得了令人鼓舞的成效，顯示出良好的應用前景。
目的基因和受體細胞的選擇是腫瘤基因治療的關鍵環(huán)節(jié)。目前用于腫瘤基因治療的基因包括細胞因子基因，腫瘤抑制基因，“自殺”基因，以及外源毒素基因等。將上述基因轉(zhuǎn)化腫瘤細胞并回輸患者，或通過基因修飾淋巴細胞等免疫功能細胞，以增強機體的抗腫瘤免疫反應，或者直接殺傷腫瘤細胞。隨著人們對細胞凋亡機理認識的深入，已有越來越多的研究者試圖通過誘導腫瘤細胞凋亡的途徑治療腫瘤。然而，目前尚缺乏可以應用于基因治療的，能夠高效、特異地殺傷腫瘤細胞且盡可能小地對系統(tǒng)帶來毒副作用的基因和治療手段。
天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)，亦稱半胱天冬酶，是一類細胞凋亡過程中起核心作用的蛋白酶，能夠特異性識別并切割Asp-X序列。目前發(fā)現(xiàn)的14個caspase家族的成員除caspase-1、4、5等被證實與炎癥細胞因子合成有關外，其余都直接參與介導細胞凋亡。參與凋亡的caspases又可以劃分為起始caspases和效應caspases兩類。
Caspase-6是效應caspase分子(Fernandes AT，et al.Cancer Res.1995；55(13)2737-42)，是除caspase-3和caspase-7外重要的凋亡執(zhí)行分子。Fernandes-Alnemri等人于1995年從人T淋巴瘤細胞系Jurkat通過PCR的方法首先分離得到了caspase-6基因，當時命名為MCH2。caspase-6基因也可以用CASP6表示，該基因編碼一種34kD的蛋白。
caspase-6在細胞中以酶原的形式合成和存在。在外界或自身凋亡信號的刺激時(Faleiro L，et al.EMBO-J.1997；16(9)2271-81)，上游caspases及粒酶B激活后于原結構域與大亞基之間及大小亞基之間被剪切，大小亞基游離并相互聚集形成有活性的二聚體形式，兩個二聚體還可以再聚合成活性更強的四聚體，作用于下游與凋亡相關的底物，如PARP和lamin A等，使細胞死亡。而當沒有凋亡信號刺激的時候，caspase-6不表現(xiàn)活性。
1998年Alnemri等(Srinivasula SM，et al.J Biol Chem.1998；27310107-10111.)將caspase-6基因的大小亞基進行重排后，得到一個與天然活性caspase-6分子晶體結構非常相似的分子。該分子無須凋亡信號刺激，便同樣具有天然caspase-6的活性，可以用作對腫瘤細胞進行高效殺傷的執(zhí)行者。然而，鑒于該活性caspase-6分子不具備特異性識別靶細胞的能力，所以在腫瘤治療的應用中存在很大的障礙。
近年來，caspase-6在細胞凋亡中的作用越來越被重視，人們公認它是一種細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路中的重要分子，也是哺乳動物細胞凋亡中的執(zhí)行分子之一。caspase-6基因不同于其他凋亡誘導分子之處在于caspase-6蛋白處于凋亡調(diào)節(jié)通路的下游(1)活性型的caspase-6可以直接作用于底物而使細胞凋亡；(2)還可以逃逸細胞內(nèi)龐大的調(diào)控網(wǎng)絡中多種凋亡調(diào)節(jié)因子的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因、由所述基因編碼的多肽、含有所述基因的載體及上述物質(zhì)在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。本發(fā)明構建一種特異性強、活性高、免疫原性低、能持續(xù)殺傷腫瘤細胞的新型分子——具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因，將其引入腫瘤，誘發(fā)腫瘤細胞內(nèi)凋亡通路的開放，以獲得一種高效、低毒地殺傷腫瘤細胞的新方法。
本發(fā)明的技術解決方案是一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因，其具有序列表<400>1-4之一的序列。
重組半胱天冬酶-6基因編碼的多肽，其具有序列表<400>5-8之一的序列。
一種表達載體，其含有重組半胱天冬酶-6基因。
重組半胱天冬酶-6基因編碼的多肽在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，將重組半胱天冬酶-6基因克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過包裝細胞包裝后，分離得到逆轉(zhuǎn)錄病毒。
重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
一種重組腺病毒，將重組半胱天冬酶-6基因克隆入腺病毒載體，通過包裝細胞包裝后，分離得到腺病毒。
重組腺病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
本發(fā)明應用了能特異性識別并結合HER2陽性腫瘤細胞的單鏈抗體e23sFv基因(Chen SY，et al.Nature 1997；38578-80)，與綠膿桿菌外毒素(PE)轉(zhuǎn)膜結構域和活性caspase-6基因融合，構建一種特異性強、活性高、免疫原性低、能持續(xù)殺傷腫瘤細胞的靶向活性半胱天冬酶-6基因。該基因可以通過下列途徑，達到治療HER2陽性腫瘤的目的(1)脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒直接進行肌肉或腫瘤組織局部注射；(2)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染患者外周血淋巴細胞，回輸患者；(3)腫瘤組織局部感染重組腺病毒；(4)純化靶向活性半胱天冬酶-6蛋白，進行肌肉、腫瘤或靜脈注射。本發(fā)明兼具細胞免疫和體液免疫特點，與其它治療策略相比具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明構建分泌型免疫靶向基因，表達分泌后產(chǎn)生能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞的效應分子，無論通過以上四種中的任何一種途徑進行應用時，均能在殺傷腫瘤細胞的同時產(chǎn)生免疫監(jiān)視作用。本發(fā)明所構建的靶向活性半胱天冬酶-6基因具有以下特點□安全性——由于在N端融合長的抗體和PE序列，因而推測這種融合蛋白在分泌后的轉(zhuǎn)移過程中和進入腫瘤細胞前，由于不能正確折疊而不具有caspase-6的活性。加之；靶向活性半胱天冬酶-6效應分子通過抗體特異性地識別腫瘤細胞，而對正常組織細胞沒有識別和殺傷作用。另外，靶向半胱天冬酶-6主要由人源化抗體和人自身蛋白構成，不會誘發(fā)體內(nèi)強烈的排異，而且細胞發(fā)生凋亡時不引起炎癥反應，所以治療的毒副作用較小。實驗中發(fā)現(xiàn)被修飾的淋巴細胞本身功能正常，回輸這種細胞將可以持續(xù)分泌效應蛋白。動物模型的抗腫瘤應用中也發(fā)現(xiàn)對除了HER2陽性腫瘤組織以外的其他組織沒有毒性；□高效性——半胱天冬酶-6是細胞凋亡的直接執(zhí)行者，向細胞中導入活性形式的caspase-6分子能夠逃逸細胞內(nèi)多種抑制因素，使其對腫瘤細胞的殺傷作用更直接，且效率更高；□持續(xù)性——靶向活性半胱天冬酶-6基因由細胞中表達后，不僅可以直接作用于鄰近的HER2陽性腫瘤細胞，而且可以進入血液循環(huán)系統(tǒng)，隨著血液流動對各種組織細胞進行長期的免疫監(jiān)視。本發(fā)明可望為HER2陽性腫瘤的靶向治療提供一種新手段。


圖1為Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細胞immunocaspase-6的分泌表達。
圖2為pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞的生長曲線。
圖3為轉(zhuǎn)染pCMV(左)或pCMV/immunocaspase-6(右)的Jurkat細胞的培養(yǎng)上清對細胞生長影響的柱狀圖。
圖4為Immunocaspase-6的殺傷活性與作用時間關系的柱狀圖。
圖5為效應細胞與靶細胞比例與殺傷效果關系的柱狀圖。
圖6為不同效應細胞對HER2陽性細胞殺傷的柱狀圖。
圖7為Jurkat-immunocaspase-6細胞對HER2陽性細胞的殺傷活性與作用時間關系的柱狀圖。
圖8為熒光顯微鏡觀察Annexin-V-FITC和PI染色后的被殺傷細胞的圖像。
圖9為陽離子脂質(zhì)體包裹pCMV/immunocaspase-6抑制腫瘤生長的柱狀圖。
圖10為陽離子脂質(zhì)體包裹pCMV/immunocaspase-6延長動物模型的生存期曲線。
圖11為回輸被Re-immunocaspase-6感染的外周血淋巴細胞的腫瘤生長抑制的柱狀圖。
圖12為TUNEL染色檢測腫瘤組織中的凋亡細胞的圖像。
圖13為回輸被Re-immunocaspase-6感染的外周血淋巴細胞的治療組動物存活期延長曲線。
圖14為Ad-immunocaspase-6治療組腫瘤生長的柱狀圖。
圖15為TUNEL染色檢測Ad-immunocaspase-6治療組的腫瘤組織中凋亡細胞的圖像。
圖16為Ad-immunocaspase-6治療組動物生存期延長曲線。
具體實施例方式
1.具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因的克隆，及其表達載體的構建本發(fā)明構建的具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因包括三部分，分別為抗腫瘤表面抗原HER2的單鏈抗體(e23sFv)，具有轉(zhuǎn)膜功能的綠膿桿菌外毒素(PE)的轉(zhuǎn)膜結構域和具有誘導細胞凋亡功能的活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)。
(1)活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因的克隆①野生型半胱天冬酶-6(caspase-6)基因的獲得提取人淋巴瘤Jurkat細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
設計擴增caspase-6基因的引物，引物合成后稀釋至終濃度20pmol/μL，進行PCR反應，獲得野生型半胱天冬酶-6(caspase-6)基因，并進行序列測定證實與文獻報道一致。
p1 5’ttt gaa ttc atg agc tcg gcc tcg ggg-3’P2 5’ttt gga tcc tta att aga ttt tgg aaa ga-3’在PCR專用的薄壁管中依次加入，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL、10×PCR buffer 5μL、50mM MgCl21.5μL、上下游引物各1μL、10mM dNTP 1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL和H2O 38μL，進行PGR反應。PGR反應條件為
96℃變性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸60秒；共進行20循環(huán)②活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因的克隆為了擴增出大小亞基次序顛倒的活性半胱天冬酶-6基因，應用overlap-PCR原理，設計引物，引物合成后稀釋至終濃度20pmol/μL，進行PCR反應。
引物序列為P35′cca aaa tct aat agc tcg gcc tcg ggg ctc cgc 3′P45′ttt tct aga tta atc tac tac atc caa agg aat 3′P55’cga ggc cga gct att aga ttt tgg aaa gaa atg 3’P65′ggc gcg gcc aac gca gcc tcc gtt tac acg ctg 3′P75′ggc gcg gcc aac gtt gaa att gat gca gcc tcc gtt tac acg ctg3′P85′agc acc cgc ggc gca gcc tcc gtt tac acg ctg 3′P95′agc acc cgc ggc gtt gaa att gat gca gcc tcc gtt tac acg ctg3′以P3和P4引物擴增caspase-6的大亞基基因片段(large subunit557bp)；分別以P5和P6、P7、P8、P9引物擴增caspase-6的小亞基基因片段(s(364)324bp，s(364；VEID)336bp，s(412)324bp，s(412；VEID)336bp)。分別表示融合PE轉(zhuǎn)膜結構域253-412位氨基酸和253-364位氨基酸序列，小亞基與轉(zhuǎn)膜結構域之間帶和不帶有自身識別并可能切割的氨基酸序列。以P4和P6、P7、P8、P9引物將大、小亞基的基因片段重組，獲得大、小亞基次序顛倒的活性caspase-6基因(rc6src6(364)857bp，rc6(364；VEID)869bp，rc6(412)857bp，rc6(412；VEID)869bp)；□克隆PE轉(zhuǎn)膜結構域基因和活性半胱天冬酶-6基因的重組體以pCMV-e23sFv-PE40為模板，以P10和P11、P12、P13、P14引物進行PCR，擴增獲得PE轉(zhuǎn)膜結構域(p(364)363bp，p(364；VEID)375bp，p(412)507bp，p(412； VEID)519bp)基因片段。
再分別用5’端引物P10和3’端引物P4，通過PCR反應將四種PE轉(zhuǎn)膜結構域基因序列與四種活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)基因序列相連，得到PE轉(zhuǎn)膜結構域基因和活性半胱天冬酶-6基因的重組體-pc6(364)1197bp，pc6(364；VEID)1209bp，pc6(412)1344bp和pc6(412；VEID)1356bp。
引物序列為P105′ttt gcg gcc gcg aaa ggc ggc agc ctg 3′P115′aac gga ggc tgc gtt ggc cgc gcc ggc ctc gtc 3′P125′aac gga ggc tgc atc aat ttc aac gtt ggc cgc gcc ggc ctc gtc3′P135′aac gga ggc tgc gcc gcg ggt gct gaa gct gac 3′P145′aac gga ggc tgc atc aat ttc aac gcc gcg ggt gct gaa gct gac3′PCR反應條件為

□靶向活性caspase-6基因(immunocaspase-6)的獲得及其真核表達載體的構建以Not I/Xba I酶切PE轉(zhuǎn)膜結構域與活性半胱天冬酶-6(rev-caspase-6)的重組體基因，克隆入真核表達載體pCMV/e23sFv相應位點，使4種融合蛋白基因位于前導肽和抗HER2抗體e23sFv基因下游，獲得插入有靶向活性caspase-6基因(immunocaspase-6(364)1965bp，immunocaspase-6(364；VEID)1977bp，immunocaspase-6(412)2112bp和immunocaspase-6(412；VEID)2124bp)的pCMV表達載體，并經(jīng)測序證實。
2.靶向活性半胱天冬酶-6基因(immunocaspase-6)的表達及其對HER2陽性腫瘤細胞的特異性殺傷應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將靶向活性半胱天冬酶-6基因?qū)塍w外培養(yǎng)的人淋巴瘤Jurkat細胞系中，轉(zhuǎn)染后48小時加入800μg/ml G418進行篩選，約2周后絕大部分細胞死亡，有陽性克隆長出，進行擴大培養(yǎng)，便得到了能夠穩(wěn)定表達并分泌目的蛋白的細胞株——Jurkat-immunocaspase-6。
□Western blot方法鑒定靶向活性半胱天冬酶-6蛋白的表達與分泌收集細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)過透析除鹽和凍干后，以小體積溶解備用。向樣品中加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10分鐘，離心取上清，電泳，再電轉(zhuǎn)化到PVDF膜上，封閉液封閉后，加入適當稀釋的caspase-6抗體，4℃孵育過夜，加入熒光素標記的二抗，37℃避光孵育1h，再加入抗熒光素的抗體，室溫避光孵育1h，以NBT/BCIP顯色。
參見附圖1，Western blot結果發(fā)現(xiàn)，靶向活性半胱天冬酶-6基因(immunocaspase-6)不僅能夠被表達，并且能夠按照預期分泌到細胞外。
□靶向活性半胱天冬酶-6(immunocaspase-6)分子對腫瘤細胞的殺傷作用1)穩(wěn)定表達靶向活性半胱天冬酶-6的細胞培養(yǎng)上清對細胞的殺傷□Jurkat-immunocaspase-6細胞培養(yǎng)上清對自身生長的影響pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞，在正常培養(yǎng)情況下，細胞生長良好，繪制的生長曲線與轉(zhuǎn)染空載體pCMV或沒有轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞相似，參見附圖2。結果表明，immunocaspase-6分子對Jurkat細胞本身沒有殺傷效應。
②Jurkat-immunocaspase-6培養(yǎng)上清對腫瘤細胞殺傷的特異性為了檢驗immunocaspase-6分子對腫瘤細胞的殺傷活性的靶向性，以pCMV和pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞的培養(yǎng)上清分別培養(yǎng)HER2陽性細胞—SKBr-3和SKOV-3細胞；HER2陰性細胞-HeLa和BT325細胞。結果，參見附圖3，Jurkat-immunocaspase-6細胞的培養(yǎng)上清對HER2陽性細胞的生長有明顯的影響，而轉(zhuǎn)染pCMV的Jurkat細胞的培養(yǎng)上清對所有細胞均沒有影響。表明，immunocaspase-6的殺傷活性是具有靶向性的，只對HER2陽性細胞有殺傷，而不影響HER2陰性細胞的生長。
③Jurkat-immunocaspase-6培養(yǎng)上清對腫瘤細胞殺傷與時間的關系收集pCMV/immunocaspase-6轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞的培養(yǎng)上清，用于培養(yǎng)SKBr-3細胞，分別于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天進行細胞計數(shù)，參見附圖4，結果表明殺傷時間越長，殺傷效果越好，說明immunocaspase-6的殺傷活性與時間呈正相關。
2)穩(wěn)定表達并分泌靶向活性半胱天冬酶-6的細胞對HER2陽性細胞的殺傷活性測定①細胞計數(shù)方法測定穩(wěn)定表達靶向活性半胱天冬酶-6的細胞對不同腫瘤細胞的殺傷率Jurkat-immunocaspase-6細胞與HER2陽性細胞(SKBr-3和SKOV-3細胞)分別以1∶1、2∶1、5∶1、10∶1于Transwell中共培養(yǎng)，5天后進行細胞計數(shù)，參見附圖5，發(fā)現(xiàn)“5∶1”的比例比較合適；Jurkat-immunocaspase-6細胞與HER2陽性細胞(SKBr-3和SKOV-3細胞)共培養(yǎng)(5∶1)于Transwell中，5天后進行細胞計數(shù)，有明顯的細胞死亡。參見附圖6，四種基因作用效果相當，其中immunocaspase-6(412；VEID)殺傷作用略強。
Jurkat-immunocaspase-6細胞與HER2陽性細胞(SKBr-3和SKOV-3細胞)和HER2陰性細胞(HeLa和BT325細胞)共培養(yǎng)(5∶1)，分別于1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天進行細胞計數(shù)。參見附圖7，結果顯示，Immunocaspase-6蛋白對HER2陽性細胞有殺傷活性，而不影響HER2陰性細胞的生長，殺傷活性隨著殺傷時間的延長而增強。
②被殺傷細胞的凋亡特征檢測Annexin V實驗——消化被殺傷腫瘤細胞成單細胞懸液，PBS洗滌，再以孵育緩沖液重懸，加入Annexin-V-FITC和PI熒光顯微鏡下觀察，并照相，參見附圖8。結果表明Immunocaspase-6對HER2陽性細胞的殺傷通過誘導凋亡實現(xiàn)。
3.動物實驗進行靶向活性半胱天冬酶-6(Immunocaspase-6)在體內(nèi)的抗腫瘤應用挑選6-8周BALB/c裸鼠，右后肢皮下注射HER2陽性腫瘤細胞——乳腺癌SKBr-3細胞(2×106個/只)，10天左右，形成明顯腫瘤后隨機分組，建立HER2陽性腫瘤細胞(乳腺癌SKBr-3細胞)的裸鼠實體瘤模型。
□陽離子脂質(zhì)體包裹pCMV/immunocaspase-6，對動物模型的抗腫瘤應用陽離子脂質(zhì)體(20μL/只)包裹質(zhì)粒pCMV/immunocaspase-6或pCMV(10μg/只)注射入荷瘤裸鼠的后肢肌肉中，每3天追加1次，同時記錄瘤體大小變化，2周后將裸鼠處死，取出瘤體及心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織。
另挑選6-8周的裸鼠，陽離子脂質(zhì)體(20μL/只)包裹質(zhì)粒pCMV/immunocaspase-6或pCMV(10μg/只)注射入荷瘤裸鼠的后肢肌肉中，每3天追加1次，2周后每1周追加1次，直至裸鼠全部死亡。
瘤體變化——實驗中跟蹤并記錄瘤體大小變化，同時將瘤體變化數(shù)據(jù)進行分析，參見附圖9，結果表明Immunocaspase-6對HER2陽性腫瘤生長有一定的抑制效果。
安全性鑒定——將心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織固定后，石蠟包埋，切片，進行HE染色、免疫組織化學染色和TUNEL染色，觀察Immunocaspase-6的表達和組織損傷情況，從而評價抑瘤效果。以抗caspase-6的抗體進行免疫組織化學染色，結果實驗組腫瘤組織顯示為caspase-6陽性，而治療組的其他組織及對照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織均顯示為caspase-6陰性。HE染色的結果表明實驗組的腫瘤組織中有細胞死亡的現(xiàn)象，而治療組的其他組織及對照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織細胞形態(tài)正常；TUNEL染色顯示腫瘤組織中有細胞發(fā)生凋亡。
裸鼠存活期——記錄裸鼠存活時間，進行統(tǒng)計學分析，參見附圖10，結果顯示，實驗組裸鼠存活期明顯比對照組延長，且差異顯著。Log Rank TestP＝0.0289-SPSS10.0。
□逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶靶向活性半胱天冬酶-6基因?qū)游锬Ｐ瓦M行抗腫瘤應用①攜帶immunocaspase-6基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構建及其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得pCMV/immunocaspase-6經(jīng)Xba I酶切，Klenow酶補平后再以Hind III酶切，回收基因片段。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX載體Cla I酶切，Klenow補平后再以Hind III酶切，回收載體片段。兩者連接，構建了包含immunocaspase-6基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，酶切鑒定正確。與空載體分別轉(zhuǎn)染包裝細胞PA317，G418篩選建系，收集病毒上清，病毒分別命名為Re-immunocaspase-6和Re，-70℃保存，避免反復凍融。病毒上清倍比稀釋，感染NIH3T3細胞，以G418篩選2周，計數(shù)形成的克隆數(shù)。發(fā)現(xiàn)在104倍稀釋的病毒感染后，Re-immunocaspase-6及Re組都形成了4個克隆，所以病毒滴度均為4×104cfu/mL。病毒感染體外培養(yǎng)的細胞系(HeLa，SKBr-3，PA317)24h后收集細胞，提取總RNA，進行Dot-blot，檢測到Re-immunocaspase-6感染后細胞中有immunocaspase-6基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。說明Re-immunocaspase-6能成功感染靶細胞，目的基因在靶細胞內(nèi)被表達。
②重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(Re-immunocaspase-6)感染對細胞的特異性殺傷以上得到的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SKBr-3、HeLa、PA317細胞，進行免疫熒光染色，檢測immunocaspase-6基因的表達，及其對細胞骨架和細胞核的影響，發(fā)現(xiàn)所有被Re-immunocaspase-6感染的細胞均表達目的蛋白，而只有HER2陽性腫瘤細胞SKBr-3中出現(xiàn)了明顯的細胞骨架和細胞核的改變。
③重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(Re-immunocaspase-6)的抗腫瘤應用體外分離正常人外周血淋巴細胞，擴大培養(yǎng)后，以重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(分兩組空載體對照組Re和實驗組Re-immunocaspase-6)感染細胞，再培養(yǎng)2天后收集細胞，RMPI 1640洗滌2次，以2×106/mL的濃度將細胞重懸。由尾靜脈注射(100μL/只)入荷瘤裸鼠的外周血中，1周后追加，2周處死裸鼠。同時記錄瘤體大小變化，取出瘤體及心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織。
另挑選6-8周的裸鼠，建立裸鼠模型后，由尾靜脈注射重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的正常人外周血淋巴細胞，每1周追加1次，直至裸鼠全部死亡。
瘤體積變化——實驗中跟蹤并記錄瘤體大小變化，同時將瘤體變化數(shù)據(jù)進行分析，參見附圖11，結果表明immunocaspase-6對HER2陽性腫瘤生長有一定的抑制作用。
安全性鑒定——收集心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織固定后，石蠟包埋，切片，進行HE染色、免疫組織化學染色和TUNEL染色，觀察immunocaspase-6的表達和組織損傷情況，從而評價抑瘤效果。以抗caspase-6的抗體進行免疫組織化學染色，結果實驗組腫瘤組織顯示為caspase-6陽性，而治療組的其他組織及對照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織均顯示為caspase-6陰性。參見附圖12，HE染色的結果表明實驗組的腫瘤組織中有細胞死亡的現(xiàn)象，而治療組的其他組織及對照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織細胞形態(tài)正常；TUNEL染色顯示只有實驗組的腫瘤組織中有細胞發(fā)生凋亡。
存活期變化——記錄裸鼠存活時間，進行統(tǒng)計學分析，參見附圖13，結果顯示，實驗組裸鼠存活期明顯比對照組延長，且差異顯著。Log Rank TestP＝0.0090-SPSS10.0。
□腺病毒載體攜帶靶向活性半胱天冬酶-6基因?qū)游锬Ｐ瓦M行抗腫瘤應用①攜帶immunocaspase-6基因的腺病毒載體的構建及重組腺病毒的獲得pCMV/immunocaspase-6經(jīng)Xba I酶切，Klenow酶補平后再以Hind III酶切，回收immunocaspase-6基因片段；同時，腺病毒載體pShuttleCMV以Hind III、EcoR V雙酶切后，回收載體片段，兩者連接。pShuttle/immunocaspase-6和pShuttleCMV再分別與pAdeasy-1進行細菌BJ5183內(nèi)重組，構建了腺病毒載體—pAdeasyCMV和pAdeasy/immunocaspase-6。pAdeasy/immunocaspase-6及pAdeasyCMV轉(zhuǎn)染包裝細胞HEK293，2周后出現(xiàn)明顯的細胞病理性變化，收集病毒。病毒溶液稀釋后感染HEK293細胞，以含DMEM的瓊脂糖培養(yǎng)，兩周左右出現(xiàn)明顯病毒克隆，挑取病毒克隆，擴大感染后提取病毒基因組，以地高辛標記的靶向活性caspase-6基因片段探針進行Dot-blot，鑒定為陽性后，再感染HEK293細胞，收集病毒，病毒分別命名為Ad-immunocaspase-6和Ad。擴大感染后再測定病毒滴度。計數(shù)形成的克隆數(shù)，發(fā)現(xiàn)在1012倍稀釋的病毒感染后，Ad-immunocaspase-6形成了8個克隆，病毒滴度為8×1012cfu/mL。Ad組形成了2個克隆，病毒滴度為2×1012cfu/mL。為了檢測病毒是否在包裝細胞以外的其他細胞中復制，即檢測病毒的安全性，以P15和P16引物擴增細胞基因組中包裝病毒必須的E1A基因，結果發(fā)現(xiàn)在檢測的細胞中，只有HEK293細胞內(nèi)有E1A基因。
引物序列為P155’cat att atc tgc cac gga gg 3’P165’gcc aca ggt cct cat ata gc 3’PCR反應條件為96℃變性30秒；55℃退火45秒；72℃延伸60秒。共進行20個循環(huán)。
②重組腺病毒(Ad-immunocaspase-6)體外感染對細胞的影響病毒感染體外培養(yǎng)的SKBr-3、HeLa、HEK293細胞24h后，收集細胞，提取總RNA，進行RT-PCR，擴增immunocaspase-6的部分序列，檢測到Ad-immunocaspase-6感染后細胞中有immunocaspase-6基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；對感染的細胞進行免疫熒光染色，檢測immunocaspase-6基因的表達，及其對細胞骨架和細胞核的影響，發(fā)現(xiàn)所有被Ad-immunocaspase-6感染的細胞均表達immunocaspase-6，而只有HER2陽性腫瘤細胞SKBr-3中出現(xiàn)了明顯的細胞死亡。
③重組腺病毒(Ad-immunocaspase-6)的抗腫瘤應用將收集的病毒進行稀釋(終滴度為1×109cfu/mL)，以重組腺病毒(分三組空白對照組PBS、空載體對照組Ad和實驗組Ad-immunocaspase-6)對荷瘤裸鼠進行瘤體直接注射，連續(xù)進行3次，記錄瘤體大小變化和裸鼠存活時間。2周后每組各處死1只裸鼠，取出心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、骨、腦、胃、腸及腫瘤等組織。固定后，石蠟包埋，切片，進行HE染色、免疫組織化學染色和TUNEL染色，觀察immunocaspase-6的表達和組織損傷情況，從而評價實驗效果。
瘤體積變化——實驗中跟蹤并記錄瘤體大小變化，同時將瘤體變化數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，參見附圖14，結果表明Ad-immunocaspase-6注射能抑制HER2陽性腫瘤的生長。
安全性鑒定——以抗caspase-6的抗體進行免疫組織化學染色，結果實驗組腫瘤組織顯示為caspase-6陽性，治療組的其他組織及對照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織均顯示為caspase-6陰性。參見附圖15，HE染色的結果表明實驗組的腫瘤組織中有細胞死亡的現(xiàn)象，而治療組的其他組織及對照組中包括腫瘤組織在內(nèi)的所有組織細胞形態(tài)正常。對實驗組和對照組的腫瘤組織進行TUNEL染色，結果表明Ad-immunocaspase-6治療組的腫瘤組織中顯示有細胞發(fā)生凋亡。
存活期的變化——記錄裸鼠生存時間，并對結果進行統(tǒng)計學分析，參見附圖16，結果表明Ad-immunocaspase-6治療組的裸鼠存活期明顯比對照組延長，且差異顯著。Log Rank TestP＝0.0198-SPSS10.0。
權利要求
1.一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶-6基因，其具有序列表<400>1-4之一的序列。
2.由權利要求1的基因編碼的多肽，其具有序列表<400>5-8之一的序列。
3.一種表達載體，其含有權利要求1所述的重組半胱天冬酶-6基因。
4.如權利要求2所述的多肽在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
5.一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，其特征為將權利要求1所述的重組半胱天冬酶-6基因克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過包裝細胞包裝后，分離得到逆轉(zhuǎn)錄病毒。
6.如權利要求5所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
7.一種重組腺病毒，其特征為將權利要求1所述的重組半胱天冬酶-6基因克隆入腺病毒載體，通過包裝細胞包裝后，分離得到腺病毒。
8.如權利要求7的所述的重組腺病毒在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有靶向活性的重組半胱天冬酶－6基因、由所述基因編碼的多肽、含有所述基因的載體及上述物質(zhì)在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。本發(fā)明中具有靶向活性的重組半胱天冬酶－6基因表達后，能特異性識別并結合于HER2陽性腫瘤細胞表面，通過PE轉(zhuǎn)膜結構域?qū)⒒钚詂aspase－6分子導入腫瘤細胞內(nèi)，誘發(fā)腫瘤細胞內(nèi)凋亡通路的開放，以獲得一種高效、低毒地殺傷腫瘤細胞的新方法。本發(fā)明在應用中，具有安全性、高效性和持續(xù)性等特點，可望為HER2陽性腫瘤的靶向治療提供一種新手段。
文檔編號C12N15/63GK1546662SQ20031011895
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權日2003年12月8日
發(fā)明者楊安鋼, 許彥鳴, 賈林濤, 張立紅, 于翠娟, 王立峰, 王成濟 申請人:楊安鋼