專利名稱：：修飾的人源化的抗-干擾素-18抗體的制作方法修飾的人源化的抗-干擾素-18抗體1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及免疫球蛋白領(lǐng)域，例如抗體，特別是人源化的抗體，可用于治療和診斷由人干4尤素-18介導(dǎo)的適應(yīng)癥。2.
背景技術(shù)：
：人干擾素-18(IL-18)是作為無生物活性的193個氨基酸的前體蛋白質(zhì)形式被合成的細(xì)胞因子(Ushio等人，J.Immunol.156:4274,1996)。通過例如半胱天冬酶一l或半胱天冬酶-4切割前體蛋白，釋放156個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)(Gu等人，Science,275:206,1997;Ghayur等人，Nature386:619,1997),表現(xiàn)出生物學(xué)活性，包^fe輔助刺激T細(xì)^^增殖、增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞生產(chǎn)IFN-y以及加強(qiáng)I型t輔助細(xì)胞(Thl)分化(Okamura等人，Nature378:88,1995;Ushio等人，J.Immunol.156:4274,1996;Micallef等人，Eur.J.Immunol.26:1647,1996;Koh加等人，J.Immunol.158:1541,1997;Zhang等人，Infect.Immunol.65:3594,1997;Robinson等人，Immunity7:571,1997)。此外，IL-18還是人單核細(xì)胞促炎癥介質(zhì)的有效的誘導(dǎo)劑，這些介質(zhì)包括IL-8、胂瘤壞死因子-a(TNF-a)和前列腺素E2(PGE2)(Ushio,S.等人,J.Immunol.156:4274-4279,1996;Puren,A.J.等人，J.Clin.Invest.10:711-721,1997;Podolin等人，J.Immunol.submitted,1999)。經(jīng)鑒別，以前克隆的IL-1受體相關(guān)蛋白(IL-lRrp)(Parnet等人，J.Biol.Chem.271:3967,1996)是IL-18受體的亞基(Kd=18nM)(Torigoe等人，J.Biol.Chem.272:25737,1997)。IL-18的第二個亞基表現(xiàn)出與IL-1受體附加蛋白的同源性，已命名為AcPL(得名于附加蛋白-樣)。IL-1Rrp和AcPL都是IL-18誘導(dǎo)的NF-KB和JNK活化所必需的(Born等人，J.Biol.Chem.273:29445,1998)。除NF-kB和JNK以外，IL-18信號還通過IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)、p561ck(LCK)和有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)起作用(Micallef等人，Eur.J.Immunol.26:1647,1996;Matsumoto等人，BiophysBiochem.Res.Comm.234:454,1997;Tsuji畫Takayama等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.237:126,1997)。TH1細(xì)月包生產(chǎn)促炎癥細(xì)月包因子例如IFN-y、IL-2和TNF-P(Mosmann等人，J.Immunol.136:2348,1986),涉及介導(dǎo)多種自身免疫病，包括多發(fā)性硬化(MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、胰島素依賴型糖尿病(IDDM)、炎性腸病(IBD)和牛皮癬(Mosmann和Sad,Immunol.Today17:138,1996)。因此，預(yù)期THl-促進(jìn)性的細(xì)胞因子例如IL-18的拮抗劑將抑制疾病發(fā)展。IL-18特異性單克隆抗體(mAb)可用做拮抗劑。已經(jīng)證實了IL-18在自身免疫疾病發(fā)展中的作用。相應(yīng)地，已經(jīng)證實了在疾病發(fā)生之前，IL-18的表達(dá)在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰臟和脾臟中顯著增加(Rothe等人，J.Clin.Invest.99:469,1997)。相似地，已經(jīng)顯示了在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中，IL-18的水平顯著升高了(Kawashima等人，ArthritisandRheumatism39:598,1996)。此夕卜，已經(jīng)證實了IL-18增加了小鼠實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的臨床嚴(yán)重程度。此外，還已經(jīng)證實了在雌性路易斯大鼠中，中和抗-大鼠IL-18抗血清防止了EAE的發(fā)展(Wildbaum等人，J.Immunol.161:6368,1998)。因此，IL-18是發(fā)展新的治療自身免疫的理想粑。Taniguchi等人，J.Immunol.Methods206:107描述了七種小鼠和六種大鼠的抗人IL-18單克隆抗體(mAb),其結(jié)合四種不同的抗原位點。一種小鼠mAb(#125-2H)和六種大鼠mAb抑制IL-18誘導(dǎo)的KG-1細(xì)胞的IFN-Y生產(chǎn)，大鼠mAb表現(xiàn)的中和活性比M25-2H的中和活性低10倍。蛋白質(zhì)印跡檢測證實，三種小鼠mAb,但是大鼠mAb中沒有一種，與膜結(jié)合的人IL-18強(qiáng)烈反應(yīng)。此外，還描述了利用M25-2H和大鼠mAb來檢測人IL-18的酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)。該ELISA檢測的極限是10pg/ml。歐洲專利申請EP0712931公開了兩種小鼠抗人IL-18mAb、HI(IgGl)和H2(IgM)。蛋白質(zhì)印跡檢測證實，兩種mAb都與膜結(jié)合的人IL-18反應(yīng)，而不與膜結(jié)合的人IL-12反應(yīng)。在免疫親和色語實驗規(guī)程中使用了HI來純化人IL-18,并且用在ELISA中來測量人IL-18。H2被用于放射性免疫檢測中來測量人IL-18。中和IL-18抗體可潛在地用于緩解自身免疫病和人的相關(guān)癥狀。因此，本領(lǐng)域需要高親和力的IL-18拮抗劑，例如抗人白介素18的中和單克隆抗體，其可降低Thl細(xì)胞的分化和增殖，因而降低自身免疫病和相關(guān)癥狀。本說明書全文中提及的所有參考文獻(xiàn)都通過引用明確和完整的整合到本文中。3.發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了人源化的抗白介素-18抗體，包含具有下列互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈和輕鏈CDRH1:SEQ,I.D.NO:lCDRH2:SEQ丄D.NO:2CDRH3:SEQ丄D.NO:3CDRL1:SEQ丄D.NO:4CDRL2:SEQ.I.D.NO:5CDRL3:SEQ丄D.NO:6根據(jù)本發(fā)明，提供了人源化的抗白介素-18抗體，包含具有下列互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈和輕鏈CDRH1:SEQ丄D.NO:lCDRH2:SEQ.I.D.NO:2CDRH3:SEQ丄D.NO:3CDRL1:SEQ.I.D.NO:4CDRL2:SEQ.I.D.NO:5CDRL3:SEQ丄D.NO:6其中，所述輕鏈的第71位殘基^f皮衍生CDR的供體抗體中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)殘基取代了。對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，術(shù)語"衍生"不僅意在定義所述材致。因此，"從衍生CDR的供體抗體框架中發(fā)現(xiàn)的"相應(yīng)的殘基不是必須從供體抗體框架中純化的。相似地，"從供體抗體衍生的"CDR也不是必須從供體抗體純化的。除非另外提示，CDR和框架區(qū)(FR)和氨基酸計數(shù)，都遵從在Kabat等人"Sequencesofimmunologicalinterest",NIH中提出的Kabat定義。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，其包含移植到人受體框架區(qū)上的從供體抗體衍生的CDR,所述抗-白介素18抗體包含具有在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的序列的CDR,其中所述抗-白介素18抗體的輕鏈的第71位殘基與供體抗體框架中的相應(yīng)位置中發(fā)現(xiàn)的殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，其包含具有在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的序列的CDR,所述抗體在輕鏈的第71位包含酪氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陳列的CDR的重鏈和具有在SEQIDNO:4、5和6中陳列的CDR的輕鏈，其中所述輕鏈的CDR是從供體抗體衍生的，所述供體抗體在供體抗體輕鏈的第71位具有酪氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含來自供體抗體的CDR,并且在所述人源化抗體的輕鏈的第71位具有酪氨酸，其中所述供體抗體是2C10或其框架變體(即，所述人源化的抗體包含與2C10相同的CDR,但是不同的框架，參見US專利6,706,487)。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)重鏈，其具有含有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列的CDR,和(b)輕鏈，其具有含有移植到人輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的CDR,其中所述人輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從SEQIDNO:38衍生的框架區(qū)，其中SEQIDNO:38的第71位是酪氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)重鏈，其具有允許與人IL-18特異性結(jié)合的CDR,和(b)輕鏈，其具有受體框架，并具有含有在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的CDR，并在第71位具有酪氨酸殘基。所述輕鏈的CDR優(yōu)選地位于受體框架內(nèi)的位置，這些位置對應(yīng)于在SEQIDNO:35中陳列的序列中的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的位置。所述輕鏈和/或重鏈優(yōu)選地在人類患者中是非免疫原性的。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)重鏈，其包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列的CDR,和(b)輕鏈，其包含移植到人輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的CDR,其中所述人源化的抗-白介素-18抗體的所述輕鏈?zhǔn)荏w框架區(qū)衍生自在SEQIDNO:38中陳列的序列的變體，其中所述變體在第71位包含酪氨酸，并且所述變體包含與在SEQIDNO:38中陳列的序列有75%或更高同一性的序列。優(yōu)選地，所述變體包含與在12SEQIDNO:38中陳列的序列有80%或更高的例如81%、82%、83%、84%同一性，更優(yōu)選地，85%或更高的，例如86%、87%、88%、89%的同一性，甚至更優(yōu)選地，卯％或更高的，例如91%、92%、93%、94%的同一性，更優(yōu)選地，95%或更高的，例如96%、97%、98%、99%的同一性。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)從供體抗體衍生的在SEQIDN0:1、2、3、4、5和6中陳列的序列的CDR,所述供體抗體在供體抗體的第71位含有酪氨酸；(b)人受體框架，所述受體框架在人輕鏈的第71位含有苯丙氨酸；其中所述抗-白介素18抗體在輕鏈的第71位含有酪氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)從供體抗體衍生的在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的CDR,所述供體抗體在供體抗體輕鏈的第71位含有芳香族氨基酸；(b)人受體框架，所述受體框架在輕鏈?zhǔn)荏w框架的笫71位含有與(a)部分中的芳香族氨基酸不同類型的芳香族氨基酸；其中所述抗-白介素18抗體包含從(a)部分的抗體衍生的輕鏈，其在第71位含有芳香族氨基酸。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，當(dāng)在37。C用表面等離子體共振(例如，BiacoreTM,優(yōu)選的使用Biacore3000儀器和在下文7.4.1中給出的條件)測量時，所述抗體針對結(jié)合人IL-18具有300pM的平衡常數(shù)。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，所述抗體包含在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的CDR,并且當(dāng)在37。C用表面等離子體共振(例如，Biacore,優(yōu)選的使用Biacore3000儀器和在下文7.4.1中給出的條件)測量時，所述抗體對于結(jié)合人IL-18具有300pM的平衡常數(shù)。優(yōu)選地，有關(guān)抗體結(jié)合人IL-18的平衡常數(shù)在37。C用表面等離子體共振(例如，Biacore,優(yōu)選的使用Biacore3000儀器和在下文7.4.1中給出的條件)測量時少于90pM。更優(yōu)選地，平tf常數(shù)是70pM或更少，更優(yōu)選3也是65pM、60pM、55pM或50pM或更少。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，所述抗體在37。C用表面等離子體共振(例如，Biacore,優(yōu)選的使用Biacore13T100儀器和在下文7.4.2中給出的條件)測量時，對于人IL-18表現(xiàn)出0.00021/s或更高的解離常數(shù)或解離速率(kd)。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:37中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的一個或多個殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體書1"生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述輕鏈的第71位和任選的第45、83、84、85位的一個或多個殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從SEQIDNO:37中陳列序列衍生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、93位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體4汙生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述抗-白介素-18抗體的輕鏈的第71位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:37中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、39、40、93位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述輕鏈的第71位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:37中陳列的序列書卞生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、36、39、40、71、89、91、93位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述輕鏈的第71位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:37中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、93位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體書f生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述輕鏈的第71、45、83、84、85位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)包含從供體抗體書f生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:37中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、93、39、40位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體書f生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述輕鏈的第71、45、83、84、85位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:37中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述重鏈的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架包含從在SEQIDNO:38中陳列的序列衍生的框架區(qū)，其中所述輕鏈的第71、45、83、84、85位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含重鏈和輕鏈的人源化抗-白介素-18抗體，其中所述抗體在25。C時和結(jié)合的人IL-18的解離速率(kd)與所述抗體在37。C時和結(jié)合的人IL-18的解離速率(kd)之間的比值是1:5或更少，其中所述抗體包含從供體抗體衍生的CDR和人受體框架，其中所述人受體框架的輕鏈的第71位的殘基被來自供體抗體的相應(yīng)殘基取代。優(yōu)選地使用BiacoreTMT100儀器和在下文7.4.2中給出的條件來測量解離速率。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗體，其包含選自SEQIDNO:9、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21的重鏈和選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:29的輕鏈。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗體，其包含SEQIDNO:9的重鏈和SEQIDNO:13的輕鏈，或者SEQIDNO:9的重鏈和SEQIDNO:29的輕鏈。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗體，其包含SEQIDNO:17的重鏈和SEQIDNO:13的輕鏈，或者SEQIDNO:17的重鏈和SEQIDNO:29的輕鏈。在本發(fā)明的另一方面，提供了人源化抗-白介素-18抗體，其包含SEQIDNO:21的重鏈和SEQIDNO:13的輕鏈，或者SEQIDNO:21的重鏈和SEQIDNO:29的輕鏈。16在本發(fā)明的另一方面，提供了包含本文中描述的抗-白介素-18抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供了篩選用于治療用途的抗體(特別是抑制配體和受體之間相互作用的抗體，例如抗-白介素-18抗體)的方法，所述方法包括(a)在30至45°C(優(yōu)選的37°C)測量抗體對抗體特異性結(jié)合的抗原的結(jié)合親和力(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(b)在20至25°C(優(yōu)選的25°C)測量抗體對抗體特異性結(jié)合的抗原的結(jié)合親和力(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(c)如果(a)的親和力大于(b)的親和力，優(yōu)選地，如果(a)的親和力比(b)的親和力大2倍或更多，更優(yōu)選地，4倍或更多，選擇所述抗體用于治療用途。在本發(fā)明的另一方面，提供了選擇用于治療用途的抗體(特別是抑制配體和受體之間相互作用的抗體，例如抗-白介素-18抗體)的方法，所述方法包括(a)在30至45°C(優(yōu)選的37°C)時測量抗體與抗體特異性結(jié)合的抗原之間的解離速率(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(b)在20至25°C(優(yōu)選的25°C)測量抗體與抗體特異性結(jié)合的抗原之間的解離速率(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(c)如果(a)的解離速率低于(b)的解離速率，則選擇所述抗體用于治療用途。術(shù)語"抗-白介素-18抗體，，指代本發(fā)明的抗體時意指此類能夠中和人白介素-18的生物學(xué)活性的抗體。它不排除此類抗體也可以中和非人靈長類(例如恒河猴和/或短尾猴)白介素-18的生物學(xué)活性的情況。附圖的簡要說明還將參照附圖進(jìn)一步描述發(fā)明，其中圖1顯示了溫度對H1L1和H1L2的結(jié)合速率(ka)的影響；圖2顯示了溫度對解離速率(kd)的影響；圖3顯示了溫度對平衡常數(shù)(KD)的影響；圖4A-4C顯示了來自產(chǎn)生表7所示的EC50值的一個實驗的代表性數(shù)據(jù)；17圖5顯示了四種選4奪的人源化變體結(jié)合人IL-18的EC50值；圖6顯示了選擇的人源化變體結(jié)合人IL-18的EC50值；圖7顯示了在存在50%滑液時H1L2與人IL-18的結(jié)合；圖8顯示了在KG1檢測中，對IL-18激發(fā)的IFN-y生產(chǎn)的抑制作用；圖9A和9B顯示了分別在10%和25%自體血清中，在人PBMCS供體中對LPS激發(fā)的IFN-y生產(chǎn)的抑制作用；圖IO顯示了2C10結(jié)合被WL18BP捕獲的hlL18;圖11顯示了9種人源化的變體抑制IL-18激發(fā)的在KG1細(xì)胞中釋方文IFN-y的能力；圖12顯示了Hl變體和2C10在KG1細(xì)胞中對IL-18激發(fā)的IFN-y生產(chǎn)的抑制作用；圖13顯示了取95。/o置信區(qū)間時Hl變體的IC50數(shù)據(jù)；圖14顯示了在KG1細(xì)胞中對IL-18激發(fā)的IFN-y生產(chǎn)的抑制作用；圖15顯示了在KG1細(xì)^^中對恒河猴IL-18激發(fā)的IFN-y生產(chǎn)的抑制作用；圖16顯示了使用嵌合2C10的人IL-18結(jié)合ELISA的結(jié)果；圖17顯示了使用嵌合2C10的恒河猴IL-18結(jié)合ELISA的結(jié)果；圖18A和18B顯示了分別使用H1L2和2C10,結(jié)合人IL-18結(jié)合的IL-19BP的結(jié)合ELISA的結(jié)果。4.人源化的抗體利用完整的非人類抗體治療人類疾病或障礙，其本身就具有目前已被普遍證實的潛在免疫原性問題，特別是基于抗體的重復(fù)給藥。即，患者的免疫系統(tǒng)將非人類的完整抗體識別為異己并且發(fā)起中和反應(yīng)。除了發(fā)展完全的人抗體(參見上文)以外，多年來已經(jīng)發(fā)展了各種技術(shù)來克服這些問題，這些技術(shù)一般涉及到減少完整抗體中的非人類氨基酸序列成分，但保留從接種動物(例如小鼠、大鼠或兔)獲得非人類抗體的相對簡易性。概括地說，已有兩種方法可以達(dá)到這個目的。第一種方法是嵌合抗體，一般包含與人恒定區(qū)融合的非人類(例如嚙齒類例如小鼠)的可變區(qū)。因為抗體的抗原結(jié)合位點位于可變區(qū)內(nèi)，嵌合抗體仍然保留了它對抗原的結(jié)合親和力，但獲得了人恒定區(qū)的效應(yīng)子功能，因此能夠發(fā)揮上文描述過的效應(yīng)子功能。一般利用重組DNA方法來制備嵌合抗體。分離編碼抗體的DNA(例如cDNA),用常規(guī)方法測序(例如4吏用能與編碼本發(fā)明抗體的H和L鏈的基因(例如編碼上述SEQIDNO:l、2、3、4、5和6的DNA)特異性地結(jié)合的寡核苷酸探針)。將雜交瘤細(xì)胞用作此類DNA的常見來源。如果需要表達(dá)嵌合載體，分離編碼輕鏈和重鏈的完整的成熟可變區(qū)的cDNA,將其框內(nèi)插入到合適的表達(dá)載體中，此外，所述載體還含有一般是人類來源的合適的免疫球蛋白恒定區(qū)以及信號序列、終止密碼子、啟動子、終止子和其它獲得抗體表達(dá)所需的元件。然后，將此類載體轉(zhuǎn)染到如不經(jīng)轉(zhuǎn)染則不會產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞(例如E.Coli、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)中來獲得抗體的合成?？梢酝ㄟ^用人L和H鏈的編碼序列來取代相應(yīng)的非人類(例如小鼠)的H和L恒定區(qū)來對DNA進(jìn)行修飾，參見Morrison,PNAS81,6851(1984)。第二種方法涉及制備人源化抗體，其中，通過人源化可變區(qū)減少了抗體的非人類組分。有兩種常用的人源化技術(shù)。第一種是通過CDR移植實現(xiàn)人源化。CDR在接近抗體的N末端形成環(huán)，在框架區(qū)提供的支架上形成表面?？贵w的抗原結(jié)合特異性主要是由該CDR表面的拓樸學(xué)和化學(xué)特征決定的。這些特征反過來又是由各個CDR的構(gòu)象、CDR的相對分布以及包含CDR的殘基側(cè)鏈的性質(zhì)和分布決定的。4又通過將非人類(例如小鼠)抗體(供體抗體)的CDR移植到人框架區(qū)(受體框架)和恒定區(qū)上，就可以大大降低免疫原性(參見Jones等人，(1986)Nature321:522-525和VerhoeyenM等人,(1988)Science239:1534-1536)。但是CDR移植本身可能不會獲得完全保留的抗原結(jié)合特性，人們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)如果要恢復(fù)主要的抗原結(jié)合親和力，就需要保留供體抗體中的一些框架殘基(有時稱為"回復(fù)突變")(參見，QueenC等人，(1989)PNAS86,10,029-10,033，Co,M等人，(1991)Nature351,501-502)。在此情況下，為了提供人框架區(qū)(FR),可以從數(shù)據(jù)庫中選擇與非人類供體抗體序列同源性最高(一般60%或更高)的人V區(qū)?？梢詮娜斯灿行蛄谢蛘吒魅说目贵w中挑選人FR。必要時，可以將供體抗體的關(guān)鍵殘基置換到人受體框架區(qū)內(nèi)，從而保留CDR構(gòu)象。抗體的計算機(jī)才莫型可用于協(xié)助鑒定這些結(jié)構(gòu)上重要的殘基，參見W099/48523?？蛇x地，還可以通過"表面修飾(veneermg)，，的過程實現(xiàn)人源化。人和鼠獨特的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的統(tǒng)計學(xué)分析揭示，在人和鼠的抗體中，暴露殘基的精確模式是不同的，多數(shù)單個的表面位置對很少幾個不同的殘基有強(qiáng)烈的偏好(參見，PadlanE.A.等人，(1991)Mol.Immunol.28,489-498和PedersenJ.T.等人,(1994)J.Mol,Bio.235;959-973)。因此，通過取代框架區(qū)中與通常在人抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基不同的暴露殘基，就可能降低非人Fv的免疫原性。因為蛋白質(zhì)的抗原性可能與其表面的可接近性相關(guān)，替換表面殘基可能足以使人免疫系統(tǒng)"無視，，小鼠可變區(qū)(還參見MarkGE.等人，(1994)HandbookofExperimentalPharmacology第113期ThepharmacologyofmonoclonalAntibodies,Springer-Verlag,105-134頁)。該人源化過程被稱為"表面修飾化"，因為只改變了抗體的表面而沒有干擾支持殘基。其它可選的方法包括WO04/006955中4是出的方法和Humaneering(Kalobios)的方法，其利用細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)序列上接近人類種系的抗體(Alfenito-MAdvancingProteinTherapeutics,January2007,SanDiego,California)。jt匕外，目前的人源化方法涉及在人CDR區(qū)與供體小鼠抗體CDR區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性的基礎(chǔ)上，而非基于抗體其它區(qū)域例如框架區(qū)的同源性，來選擇人受體框架。該方法也被稱為Superhumanization(EvogenixInc.;Hwang等人，(2005)Methods36:35-42)。因此，本發(fā)明涉及上文第3節(jié)提出的人源化抗體。此類抗體優(yōu)選地含有IgG同種型(例如IgGl或IgG4)在替代實施方案中，可以讓上文第3節(jié)提出的人源化抗體與非人恒定區(qū)("反相嵌合")融合，例如非人靈長類、大鼠、小鼠或兔子。當(dāng)然對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的是，在SEQIDNO:37和38中陳列的受體框架構(gòu)成了分別由VH和Vk基因編碼的免疫球蛋白氨基酸。如此，它們同時包含了框架區(qū)和受體抗體的CDR。用在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的供體CDR取代受體抗體CDR以及將獲得的序列與合適的框架4序歹'j(例如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40陳列的序列)結(jié)合，從而生產(chǎn)完整的免疫球蛋白可變區(qū)(例如，SEQIDNO:ll和SEQIDNO:15陳列的)，完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范疇。4.1其它》務(wù)飾認(rèn)為抗體的Fc區(qū)和各Fc受體(FcYR)之間的相互作用介導(dǎo)抗體的效應(yīng)子功能，包括抗體依賴性的細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體的固定、細(xì)胞吞噬作用和抗體的半衰期/消除?？梢愿鶕?jù)理想的效應(yīng)子特性對本發(fā)明抗體的Fc區(qū)進(jìn)行各種修飾。例如EP0629240Bl和EP0307434B2中詳細(xì)描述的，在Fc區(qū)進(jìn)行特定突變，使本來裂解性的抗體成為非裂解性的；或者可以在抗體中摻入補(bǔ)救受體結(jié)合表位，提高其血清半衰期(見US5739277)。目前識別的5種人Fcy受體是FcyR(I)、FcyRIIa、FcyRIIb、FcyRIIIa和新生的FcRn。Shields等人，(2001)J.Biol.Chem276,6591-6604)證實了一組公用IgGl殘基參與和所有FcyR的結(jié)合，同時FcyRII和FcyRIII還利用這組公用殘基之外的一些不同位點。將以下一組IgGl殘基改變?yōu)楸彼釙r，降低與所有FcyR的結(jié)合Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297和Pro-239。所述殘基全部位于IgG的CH2區(qū)，簇集在連接CHI和CH2的鉸鏈附近。FcyRl只利用公用IgGl殘基組進(jìn)行結(jié)合，而FcyRII和FcyRIII除了公用殘基組外還與一些獨特殘基相互作用。一些殘基的改變只減弱與FqRII的結(jié)合(例如Arg-292)或與FcyRIII的結(jié)合(例如Glu-293)。一些變體表現(xiàn)出與FcyRII或FcyRIII的改善的結(jié)合，但不影響與其他受體的結(jié)合(例如，Ser-267Ala改善與FcyRII的結(jié)合，但不影響與FcyRIII的結(jié)合)。其它變體則表現(xiàn)出與FcyyRII或FcyRIII的改良的結(jié)合，但與其他受體的結(jié)合下降(例如，Ser-298Ala提高了與FcyRin的結(jié)合，但與FcyRII的結(jié)合下降)。對于FcyRIIIa,結(jié)合最好的IgGl變體綜合了在Ser-298、Glu-333和Lys-334處的丙氨酸取代。認(rèn)為新生兒FcRn受體參與了抗體清除和跨組織的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用(參見，JunghansR.P(1997)Immunol.Res16.29-57和Ghetie等人，(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766)。決定與人FcRn直接相互作用的人IgGl殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。因此，本發(fā)明涉及具有任一項上文詳細(xì)描述的殘基改變的發(fā)明的抗體，所述改變可修飾半衰期/清除和/或改變效應(yīng)子功能(例如ADCC和/或補(bǔ)體裂解)。其他修飾包括本發(fā)明抗體的糖基化變體。已知在抗體恒定區(qū)的保守位點處抗體的糖基化對抗體功能，特別是對例如上文描述的效應(yīng)子功能有深刻的影響，參見例如Boyd等人，(1996),Mol.Immunol.32,體，其中增加、取代、刪除或者修飾了一或多個碳水化合物部分。引入天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-x-蘇氨酸基序，產(chǎn)生了用于碳水化合物部分的酶促附連的潛在位點，因此可用于操縱抗體糖基化。在Raju等人，(2001)Biochemistry40,8868-8876中，利用卩-l,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和/或a-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶通過再半乳糖糖基化和/或再唾液酸化，提高了TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。認(rèn)為增加末端唾液酸化能夠延長免疫球蛋白的半衰期。與多數(shù)糖蛋白一樣，抗體通常是以糖型混合物的形式產(chǎn)生的。在真核細(xì)胞，特別是在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)抗體時，這種混合物尤其明顯。已經(jīng)開發(fā)了多種方法來制備指定的糖型，參見Zhang等人，Science(2004),303,371,Sears等人，Science,(2001)291,2344,Wacker等人，(2002)Science,29817卯，Davis等人，(2002)Chem.Rev.102579,Hang等人，(2001)Acc.Chem.Res34,727。因此，本發(fā)明考慮了涉及多種如本文所述的治療性(單克隆)抗體(可以是IgG同種型，例如IgGl),所述抗體包含指定數(shù)量(例如7或以下，例如5或以下，例如2或1個)的所述抗體或抗原結(jié)合片段的糖型。本發(fā)明其它的實施方案包括與非蛋白性多聚體(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亞烷基(polyoxyalkylene))偶聯(lián)的本發(fā)明的治療用抗體或其抗原結(jié)合片段。使蛋白質(zhì)與PEG偶聯(lián)是已有技術(shù)，可用于提高蛋白質(zhì)半衰期、降低蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性。已經(jīng)采用完整抗體以及Fab，片段研究了不同分子量和形式(線形或分支)的PEG修飾的用途，參見KoumenisI.L.等人，(2000)IntJ.Pharmaceut198:83-95。5.制備方法可以在轉(zhuǎn)基因生物中生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，這些轉(zhuǎn)基因生物例如是山羊(參見Pollock等人，(1999),J.Immunol.Methods231:147-157)、雞(參見MorrowKJJ(2000)GenetEng.News20:1-55)、小鼠(見Pollock等人，同上)或植物(見DoranPM,(2000)Curr.OpinionBiotechnol.11,199-204，MaJK-C(1998),Nat.Med.4;601-606,BaezJ等人，BioPharm(2000)13:50-54,StogerE等人；(2000)PlantMol.Biol.42:583-590),。也可以通過化學(xué)合成來生產(chǎn)抗體。但是本發(fā)明的抗體通常是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的。分離編碼抗體的多核苷酸，將其插入可復(fù)制載體(例如質(zhì)粒)用于進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增)或在宿主細(xì)胞中表達(dá)。一個有效的表達(dá)系統(tǒng)是谷氨酸合成酶系統(tǒng)(例如LonzaBiologies出售的)，尤其是當(dāng)宿主細(xì)胞是CHO或NSO的時候(見下文)。利用傳統(tǒng)程序(例如寡核苷探針)可以方便地對編碼抗體的多核苦酸進(jìn)行分離和測序?？捎玫妮d體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微染色體，其中質(zhì)粒是代表性的實施方案。一般來說，此類載體還包括與輕鏈和/或重鏈多核苷酸可操縱地連接的信號序列、復(fù)制起點、一或多個標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列，從而有利于表達(dá)?？梢詫⒕幋a輕4連和重鏈的多核苷酸插入分離的載體，并同時或先后引入(例如通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔或轉(zhuǎn)導(dǎo))同一宿主細(xì)胞，或者如果需要，可以在上述轉(zhuǎn)導(dǎo)前將重鏈和輕鏈插入相同的載體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是由于遺傳密碼的冗余性，文中公開的多核苦酸的替代多核苷酸序列也可以編碼本發(fā)明的多肽。5.1信號序列可以以帶有異源信號序列的融合蛋白形式來生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，所述信號序列在成熟蛋白質(zhì)的N末端具有特異性切割位點。宿主細(xì)胞可以識別和加工信號序列。對于原核宿主細(xì)胞，信號序列可以是堿性磷酸酶、青霉素酶或者熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)序列。對于酵母菌分泌，信號序列可以是酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列(見如W090/13646)。在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中，可獲得的是病毒分泌前導(dǎo)序列(例如單純皰滲病毒gD信號)和天然免疫球蛋白信號序列(例如人的Ig重鏈)。通常，信號序列與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸連接在同一讀碼框內(nèi)。5.2復(fù)制起點本領(lǐng)域熟知的復(fù)制起點含有適合多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的pBR322、適合多數(shù)酵母菌的質(zhì)粒以及適合多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的各種病毒復(fù)制起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或者BPV。通常，整合的哺乳動物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點成分，除非需要在E.Coli中載體增殖。但是SV40ori含有早期啟動子，所以可以纟皮使用。5.3選擇標(biāo)記典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素(例如氨卡青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)或其他毒素的抗性，或者(b)互補(bǔ)營23養(yǎng)缺陷型或提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒有的營養(yǎng)物，或者(C)兩者的結(jié)合。選擇的原理可涉及使不含有載體的宿主細(xì)胞停止生長。那些成功地轉(zhuǎn)化了編碼本發(fā)明治療用抗體的基因的細(xì)胞，由于共同遞送的選擇標(biāo)記所賦予的例如藥物抗性而存活。一個實例是DHFR-選擇系統(tǒng)，其中，轉(zhuǎn)化子是從DHFR陰性的宿主菌株中產(chǎn)生的(例如參見，Page和Sydenham1991Biotechnology9:64-68)。在該系統(tǒng)中，DHFR基因與本發(fā)明的抗體多核苷酸序列被共同遞送，然后通過撤除核苷酸來選擇DHFR陽性細(xì)胞。如果需要，還可以使用DHFR的抑制劑氨甲蝶呤來選擇DHFR基因擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子。通過將DHFR基因可操作地連接到本發(fā)明的抗體編碼序列或其功能性衍生物，DHFR基因的擴(kuò)增可獲得所需要的目標(biāo)抗體序列的共同擴(kuò)增。CHO細(xì)胞特別適合該DHFR/氨曱喋呤選擇，使用DHFR系統(tǒng)擴(kuò)增和選擇宿主細(xì)胞的方法也是本領(lǐng)域普遍已知的，參見KaufmanR丄等人，J.Mol.Biol.(1982)159,601-621,關(guān)于綜述，參見WernerRG,NoeW,KoppK,SchluterM,"Appropriatemammalianexpressionsystemsforbiopharmaceuticals",Arzneimittel誦Forschung.48(8):870-80,1998Aug。其它的實例是谷氨酸合成酶表達(dá)系統(tǒng)(LonzaBiologies)。適于在酵母中使用的選擇基因是trpl基因，參見Stinchcomb等人，Nature282,38,1979。5.4啟動子操作地連接在一起。用于原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、P-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性^疇酸酶、色氨酸和雜合啟動子，例如Tac。適于在酵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的啟動子包括3-磷酸甘油激酶或者其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、己糖激酶、丙酮酸脫歡酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油變位酶和葡萄糖激酶。可誘導(dǎo)的酵母啟動子包括醇脫氫酶2、同型細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和負(fù)責(zé)氮代謝或者麥芽糖/半乳糖利用的酶。用于在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的啟動子包括RNA聚合酶II啟動子，包括病毒啟動子，例如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒(特別是立即早期基因啟動子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、肌動蛋白、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和早期或晚期猴病毒40;以及非病毒啟動子例如EF-la(Mizushima24和NagataNucleicAddsRes199018(17):5322)。啟動子的選擇可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的相容性。5.5增強(qiáng)子元件合適時(例如用于在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時)，可以使用與啟動子元件可操縱地相連在載體中的增強(qiáng)子元件。合適的哺乳動物增強(qiáng)子序列包括來自球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、胎蛋白和胰島素的增強(qiáng)子元件?？蛇x地，可以使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子元件，例如SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、多瘤病毒增強(qiáng)子、桿狀病毒增強(qiáng)子或者小鼠IgG2a座位(參見W004/009823)。一^:此類增強(qiáng)子在載體上位于啟動子上游的位置，-f旦也可以位于任何位置，例如在非翻譯區(qū)或多聚腺苷酸信號的下游。增強(qiáng)子的選擇和放置可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的相容性。5.6多聚腺苷化/終止在真核系統(tǒng)中，多聚腺苷化信號可操作地與編碼本發(fā)明抗體的多聚核苷酸連接。此類信號一般位于開放閱讀框的3，端。在哺乳動物系統(tǒng)中，非限制性的信號實例包括從生長激素、延伸因子-1a和病毒(例如SV40)基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)衍生的信號。在酵母系統(tǒng)中，多聚腺苷化/終止信號包括自磷酸甘油激酶(PGK)和乙醇脫氬酶1(ADH)基因衍生的信號。在原核系統(tǒng)中一般不需要多聚腺苷化信號，取而代之一般使用更短和更清晰的終止子序列。多聚腺普化/終止信號的選擇可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的相容性。5.7用于提高產(chǎn)量的其它方法/元件除了上述內(nèi)容，還可以使用其它特征來提高產(chǎn)量，包括染色體重建元件、內(nèi)含子和宿主細(xì)胞特異性密碼子修飾?？梢赃m應(yīng)宿主細(xì)胞的密碼子偏愛來修飾本發(fā)明抗體的密碼子用法，從而提高轉(zhuǎn)錄和/或產(chǎn)品產(chǎn)量(例如:HoekemaA等人，MolCellBiol19877(8):2914陽24)。密碼子的選擇可以基于與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的相容性。5.8宿主細(xì)月包用于克隆或表達(dá)編碼本發(fā)明抗體的載體的合適的宿主細(xì)胞是原核、酵母或高等真核細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞包括真細(xì)菌，例如腸桿菌科，如埃希氏菌屬(例如E.coli(例如:ATCC31446;31537;27325))、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、變形菌屬、沙門氏菌屬如鼠傷寒沙、門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙、雷氏菌屬長口津占質(zhì)沙、雷氏菌(Serratiamarcescans)和志賀氏菌屬，以及芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.lichemformis)(參見，DD266710)、假單胞桿菌如銅綠假單胞桿菌(P.aemginosa)和鏈霉菌。酵母宿主細(xì)胞有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、克魯維酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC16045、12424、24178、56500)、耶氏酵母(yarrowm)(EP402226)、巴斯德畢赤酵母(Pichmpastons)(EP183070;還參見Peng等人，J.Biotechnol.108(2004)185-192)、念珠菌(Candida)、里氏木霉(Trichode腿reesia)(EP244234)、青霉菌(Penicillin)、彎頸霉(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus),例如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.mger)。雖然本發(fā)明特別考慮真核和酵母宿主細(xì)胞，但一般地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是脊推動物細(xì)胞。合適的脊推動物宿主細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞，例如COS-l(ATCCNo.CRL1650)、COS-7(ATCCCRL1651)、人胚胎腎細(xì)胞系293、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)(ATCCCRL.1632)、BHK570(ATCCNO:CRL10314)、293(ATCCNO.CRL1573)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO(例如CHO-Kl,ATCCNO:CCL61)、DHFR-CHO細(xì)胞系(例如DG44,參見Urlaub等人，(1986)同上)，特別是那些適合懸浮培養(yǎng)的CHO細(xì)胞系、小鼠支持細(xì)胞(Sertolicell)、猴腎細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(ATCCCRL-1587)、HELA細(xì)胞、犬腎細(xì)胞(ATCCCCL34)、人肺細(xì)胞(ATCCCCL75)、HepG2和骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞，如NSO(參見US5807715)、Sp2/0、Y0。因此,本發(fā)明一個實施方案提供了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含編碼本文所述治療用抗體的重鏈和/或輕鏈的載體。一般此類宿主細(xì)胞包含編碼輕鏈的第一載體和編碼重鏈的第二載體。還可以進(jìn)一步改造或調(diào)試此類宿主細(xì)胞，從而修飾本發(fā)明抗體的質(zhì)量、功能和/或產(chǎn)量。非限制性的實例包括表達(dá)特定修飾(例如糖基化)的酶和蛋白質(zhì)折疊伴倡。265.9細(xì)力包培養(yǎng)方法可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法培養(yǎng)用編碼本發(fā)明治療用抗體的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。可以將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)角瓶、搖瓶、滾瓶或中空纖維系統(tǒng)中，但是對于大規(guī)模生產(chǎn)，優(yōu)選攪拌罐反應(yīng)器或袋式反應(yīng)器(例如WaveBiotech,Somerset,NewJerseyUSA)進(jìn)4亍懸浮培養(yǎng)。一般利用例如分散器、擋板或低剪切攪拌翼將攪拌罐改造成適應(yīng)通氣。對于鼓泡塔和氣升式反應(yīng)器，可以用空氣或氧氣泡直接通氣。當(dāng)宿主細(xì)胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中時，優(yōu)選在培養(yǎng)基中補(bǔ)充細(xì)胞保護(hù)劑(例如PluronicF-68),保護(hù)細(xì)胞免受通氣過程造成的損傷。根據(jù)宿主細(xì)胞的特點，貼壁依賴性細(xì)胞系可使用微載體作為生長基質(zhì)，或者使細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)(常見情況)。宿主細(xì)胞，特別是脊推動物宿主細(xì)胞的培養(yǎng)，可以運(yùn)用多種操作模式，例如補(bǔ)料分批、重復(fù)分批培養(yǎng)(參見Drapeau等人，(1994)cytotechnology15:103-109)、持續(xù)單批培養(yǎng)或者灌流培養(yǎng)。雖然可以在含有血清(如胎牛血清(FCS))的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞，但是，優(yōu)選地在合成的無血清培養(yǎng)基(例如Keen等人，(1995)Cytotechnology17:153-163中公開的)或可商購的培養(yǎng)基(例如ProCHO誦CDM或UltraCHO(CambrexNJ,USA),)中培養(yǎng)此類宿主細(xì)胞，如果需要，還可以補(bǔ)充必要的能量源如葡萄糖和合成生長因子如重組胰島素。宿主細(xì)胞的無血清培養(yǎng)要求這些細(xì)胞適應(yīng)在無血清的條件下生長。一種適應(yīng)方法是在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此類宿主細(xì)胞，然后重復(fù)地將80%的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，使宿主細(xì)胞學(xué)習(xí)適應(yīng)無血清條件(參見例如ScharfenbergK等人，(1995)inAnimalCelltechnology:Developmentstowardsthe21stcentury(BeuveryE.C.等人編著)，619-623頁，KluwerAcademicpublishers)?？梢岳酶鞣N技術(shù)從培養(yǎng)基中回收和純化分泌到培養(yǎng)基中的本發(fā)明抗體，從而提供適合所需用途的純化程度。例如，本發(fā)明的治療用抗體用于治療人類患者的用途通常要求，與含有治療性抗體的培養(yǎng)基相比，用還原性SDS-PAGE測定時具有至少95%的純度，更常見的要求98%或99%的純度。在第一個例子中，通常利用離心去除培養(yǎng)基中的細(xì)胞殘片，隨后利用例如微濾、超濾和/或深層過濾進(jìn)行上清液的澄清化步驟?？蛇x地，可以在不離心的條件下，利用微濾、超濾或深層過濾收獲27抗體。還可使用多種其他技術(shù)，例如透析、凝膠電泳和層析技術(shù)(例如羥基磷灰石層析(HA)、親和層析(任選地涉及親和標(biāo)記體系如多聚組氨酸)和/或疏水相互作用層析(HIC,參見US5429746)。在一個實施方案中，在多個澄清化步驟之后，利用蛋白A或G親和層析捕獲本發(fā)明抗體，隨后是進(jìn)一步的層析步驟如離子交換和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、大小排阻層析以及疏酸銨沉淀。通常，還使用各種去除病毒的步驟(例如用DV-20濾膜進(jìn)行納米過濾等)。經(jīng)過這些步驟，提供了純化的(通常是單克隆的)制品，其包含至少10mg/ml或更多(例如100mg/ml或更多)的本發(fā)明抗體，從而構(gòu)成了發(fā)明的一個實施方案。通過超速離心可以產(chǎn)生100mg/ml或更高的濃度。適合的此類制品基本上不含有聚集形式的本發(fā)明抗體。細(xì)菌體系特別適合表達(dá)抗體片段。這些片段位于胞內(nèi)或周間質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以提取不溶性周間質(zhì)蛋白，并重新折疊成活性蛋白質(zhì)，參見Sanchez等人，(1999)J.Biotechnol.72,13-20和CupitPM等人，(1999)LettApplMicrobiol,29,273-277。6.藥物組合物上文描述的本發(fā)明抗體的純化制劑(特別是單克隆制劑)，可以被摻入到藥物組合物中，用于治療上文概述過的人類疾病和紊亂。通常此類組合物還包含藥學(xué)上可接受的(即，惰性的)載體，所述載體是可接受的藥學(xué)實踐已知且要求的，參見例如RemingtonsPharmaceuticalScience,第16版，(1980)Mack出版公司。此類載體的實例包括用適宜緩沖液緩沖到pH5-8的滅菌載體，例如鹽水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。注射(例如通過靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或門靜脈內(nèi))或持續(xù)flr注的藥物組合物合適地不含可見顆粒物，并可包含0.1ng-100mg抗體，通常5mg-25mg抗體。制備這類藥物組合物的方法是本領(lǐng)域熟知的。在一個實施方案中，藥物組合物的每單位劑量形式含有0.1ng-100mg本發(fā)明的治療用抗體，任選地還具有4吏用說明?？梢詢龈?冷凍干燥)本發(fā)明的藥物組合物，用于在給藥前根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或顯而易見的方法進(jìn)行重建。當(dāng)發(fā)明實施方案包含本發(fā)明抗體的IgGl同種型時，可以向藥物組合物中加入銅鰲合劑，如檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)或EDTA或組氨酸，從而降低銅介導(dǎo)的該同種型抗體的降解程度，參見EP0612251。一般根據(jù)經(jīng)驗決定本發(fā)明抗體給藥的有效劑量和治療方案，依賴于患者的年齡、體重和健康狀況以及治療的疾病或障礙。這些影響因素在主治醫(yī)生的考慮內(nèi)。在例如Smith等人，(1977)Antibodiesinhumandiagnosisandtherapy,RavenPress,NewYork中可發(fā)現(xiàn)對選擇合適劑量的指導(dǎo)，但一般在lmg至1000mg之間。在一個實施方案中，治療患有RA的人類患者的劑量方案是每周或每兩周皮下給予100mg左右(例如，在50mg至200mg之間)的本發(fā)明抗體(或其抗原結(jié)合片段)。本發(fā)明的組合物還可以用于預(yù)防性用途。根據(jù)所治療的疾病和障礙，可以將包含治療有效量的本發(fā)明抗體的藥物組合物與有效量的另一種藥劑同時、分別或先后使用，所述藥劑是例如抗炎劑如NSAID、氨曱蝶呤、布西拉明(bucillamine)、乙硫羥酸鈉，或者一種或多種抗-TNFa治療，例如Enbrel(依那西普)、RemicadeTM(英夫利昔單抗)、Humim(阿達(dá)木單抗)和/或CDP870。本發(fā)明的抗體可以與有效量的抗-TNFa受體抗體聯(lián)合使用，參見DavisMW等人，(2000)AnnRheumDis59(Suppl1):41-43。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以與有效量的針對以下物質(zhì)的試劑聯(lián)合使用IL-1/IL-lR(例如KmeretTM)、CTLA4曙lg、IL曙6(參見Choy等人，(2002)Ann.Rheum.Dis61(suppl1):54)、IL-8、IL-15、VEGF、IL-17、IL-18(參見Taylor等人，(2001)Curr.Opin.Immunol.13:611-616)、抗-ICAM和/或抗-CD4抗體，針對MMP家族的成員(如MMP-l、2、3和/或13)的試劑。發(fā)明的抗體還可以與摘除已知在炎癥過程涉及的細(xì)胞的試劑聯(lián)合使用，例如CD20陽性的B細(xì)胞，使用Mabthera(利妥昔單抗)。其它與本發(fā)明抗體結(jié)合的治療還包括血管生成抑制療法，例如整合素(xVJ33的拮抗劑、Kringle1-5(參見S謹(jǐn)ariwallaP等人，(2003),ArthritisResTher5:R32-R39)、可溶性Flt-l(參見Miotla等人，(2000)Lab.Invest.80:1195-1205)、抗-COX-2試劑或抗-OSM試劑(如抗-OSM抗體)，參見WO2005/095457,其完整內(nèi)容通過引用^皮整合到本文中，并可神皮讀者查閱。按照慣例，本發(fā)明還應(yīng)考慮這樣的藥物組合物，其包含本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合片段和其它藥品，并且任選地與使用說明一起構(gòu)成的試劑盒。這些組合在治療關(guān)節(jié)疾病/病癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中或許是特別有用的。7.臨床用途本發(fā)明的抗體可用于治療IL-18介導(dǎo)的疾病，例如自身免疫病。特別提及的是多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸病(IBD)和牛皮癬。因此，本發(fā)明還包括治療患有應(yīng)答hIL-18中和作用的疾病(例如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、IBD、牛皮癬)的人類患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的本發(fā)明抗體，特別是具有在SEQIDNO:9中陳列的序列的重鏈和在SEQIDNO:13中陳列的序列的輕鏈的抗體。還提供了本發(fā)明抗體在生產(chǎn)用于治療一種(或多種)上述疾病/障礙的藥物中的用途。表A<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>7.舉例說明下列實施例例舉了本發(fā)明的各個方面。所有一般的克隆、連接和其它重組DNA技術(shù)都根據(jù)Maniatis等人，Molecularcloning(Alaboratorymanual),ColdSpringHarborLaboratory,或Sambrook等人，MolecularCloning(Alaboratorymanual),ColdSpringHarborLaboratory中的一般教導(dǎo)實施。本文中使用的載體系統(tǒng)和其它分子生物學(xué)方法都被公開在WO2005/095457中，其完整內(nèi)容通過引用被整合到本文中，并且讀者可專門查閱。7.1克隆雜交瘤可變區(qū)親代大鼠抗體2C10是在US專利6706487中陳列的。讀者可以專門查閱該文件。在上述7>開的大鼠V區(qū)的基礎(chǔ)上，連接人IgGl或kC區(qū)，設(shè)計嵌合抗體2C10c。在重鏈和輕鏈構(gòu)建體上引入通用的免疫球蛋白信號序列和翻譯起始密碼子ATG。設(shè)計HindIII和BsiWI限制性內(nèi)切酶位點來框出VL結(jié)構(gòu)域，并且允許將其克隆到已經(jīng)含有人Qc區(qū)(SEQIDNO:36)的哺乳動物表達(dá)載體中。設(shè)計HindIII和Spel限制性內(nèi)切酶位點來框出VH結(jié)構(gòu)域，并且允許將其克隆到已經(jīng)含有人ylC區(qū)(SEQIDNO:34)的哺乳動物表達(dá)載體中。這導(dǎo)致在2C10Vh區(qū)的框架4(Kabat殘基107和108)與已公開的序列有2個氨基酸的改變，如在SEQIDNO:33中所示的。通過PCR使用重疊的寡核苷酸來構(gòu)建整個編碼序列，并克隆到上文概述的表達(dá)載體中。經(jīng)過序列驗證后，在CHO細(xì)胞中表達(dá)嵌合抗體。通過在rProteinA瓊脂糖上親和層析來從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化所生產(chǎn)的抗體。在體外結(jié)合檢測中評估2C10的嵌合抗體，證實其與親代大鼠2C10具有可比較的效價。通過在ELISA中測定結(jié)合人或恒河猴IL-18的EC50值(圖16和17),或在KG-1生物檢測中測定對IFN-y釋放的抑制作用(參見圖15),來實現(xiàn)上述評估。7.2人源化7.2.1輕鏈的人源化策略對于2C10大鼠可變輕鏈序列，選擇與大鼠2C10可變輕鏈序列具有64%同一性(包括CDR)的人種系受體框架(FJGV1D-12-1,SEQIDNO:38)。種系V區(qū)在電腦模擬中與合適的FR4結(jié)合，在此情況下，J區(qū)k2小基因(KabatVol.II)基于序列相似性(SEQIDNO:40)?；谛蛄斜容^和對抗體功能的可能的影響，產(chǎn)生了三種人源化變體。構(gòu)建體Ll是大鼠CDR(使用Kabat定義)直接移植到上文選定的人受體框架上。構(gòu)建體L2在Ll的基礎(chǔ)上具有第71位殘基的一處額外回復(fù)突變。構(gòu)建體L3在L2的基礎(chǔ)上在第45、83、84和85位殘基處具有4處額外32的回復(fù)突變。參見表l。表l:產(chǎn)生的人源化VL變體的概述構(gòu)建體受體/模板框架4立于aa弁處的回回復(fù)突人受體原始大鼠復(fù)突變(Kabat)變總數(shù)框架序列LlF一IGV1D-12-1/J2無——SEQ.I.D.NO:38L2Ll711FYL245KQ83FE84AG85TD7.2.2重鏈的人源化對策對于2C10大鼠可變重鏈序列，選擇與大鼠2C10可變重鏈序列具有59%同一性(包括CDR)的人種系受體框架(Fp_IGHVl-f_2,SEQIDNO:37)。種系V區(qū)在電腦才莫擬中與合適的FR4結(jié)合，在此情況下，JH6小基因(KabatVol.il)基于序列相似性(SEQIDNO:39)?；谠摽蚣墚a(chǎn)生了三種人源化變體。H1是大鼠CDR(使用Kabat定義)的移植物，在第27、28、29和93位殘基處具有4個額外的回復(fù)突變。這允許在緊挨親代(即，供體)抗體的CDR1上游罕見的氨基酸序列，其可以構(gòu)成部分CDR(參見C"othia的定義)。H2在Hl的基礎(chǔ)上具有第39和40位殘基的2處額外回復(fù)突變。H3在H2的基礎(chǔ)上在第36、71、89和91位殘基處具有另外4處額外的回復(fù)突變。參見表2。表2:產(chǎn)生的人源化Vh變體的概述構(gòu)建體受體/模板框架4立于aa^處的回回復(fù)突人受體原始大鼠復(fù)突變(Kabat)變總數(shù)框架序列HIFp—lGHVl-f—2274YESEQ丄DNO:3728TI29S93ATH2m396QR40ARH3H23610WF71EA89VT91YF7.32C10C的人源化通過PCR擴(kuò)增和重疊的寡核苦酸重新構(gòu)建人源化的V區(qū)。引物包含用于克隆到哺乳動物表達(dá)載體的限制性酶切位點和用于分泌的人免疫球蛋白信號序列。使用HmdIII和Spel將人源化的V區(qū)作為Hl、H2和H3克隆到含有人y1恒定區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體中，使用HindIII和BsiWI作為LI、L2和L3克隆到含有人k恒定區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體中。其產(chǎn)生了人源化重鏈變體的人IgG同種型和人源化輕鏈變體的人k同種型。7.3.1表達(dá)人源化的重鏈和輕《連抗體組合以一式四份瞬時地轉(zhuǎn)染CHOKl細(xì)胞。檢測上清液的抗體濃度，然后通過比較2C10大鼠-人嵌合體，用于體外結(jié)合檢測。按如下方式實施所有9種變體的大規(guī)才莫瞬時表達(dá)每個培養(yǎng)瓶，在8ml培養(yǎng)基(OptiMEM/glutamax/5%FBS)中混合51.4叱輕鏈質(zhì)粒和8.6^g重鏈質(zhì)粒以及240]Lig轉(zhuǎn)染液體(在WO2006/053783,實施例13中描述了該液體，其通過引用全文整合到本文中)，并將該混合物施用于兩瓶T175培養(yǎng)瓶的幾乎匯合的CHOKl細(xì)胞上，在典型的組織培養(yǎng)條34件下維持72小時。還在多克隆CHO細(xì)胞系統(tǒng)中，以mg量級表達(dá)所述抗體，使用搖瓶并使用FPLC和蛋白A進(jìn)行純化。7.4體外結(jié)合才全測7.4.1Biacore分析利用蛋白A捕獲HBS-EP緩沖液(BiacoreTM)中的抗體，在BiacoreTM3000儀器上進(jìn)行人源化2C10抗體的BiacoreTM動力學(xué)分析。簡而言之，通過伯胺偶聯(lián)將蛋白A固定在CM5芯片上，利用生產(chǎn)商推薦的實驗規(guī)程，達(dá)到密度約2000-4000共振單位(RU，s)。然后，讓人源化抗體經(jīng)過蛋白A表面，捕獲水平為約200-500RU，s,經(jīng)過一段時間的穩(wěn)定后，將IL18(人的或恒河猴的)以確定的濃度通過捕獲的抗體表面，獲得結(jié)合的感應(yīng)譜。利用酸性洗脫條件再生，從蛋白A表面完全去除捕獲的抗體，而不會顯著降低表面的結(jié)合容量。所有曲線都雙倍參考了緩沖注射液以代替IL18,利用在BiaEva14.1中的全球普適的參數(shù)將數(shù)據(jù)擬合到1:1結(jié)合模型。解離速率評級實驗也是利用相同的蛋白A捕獲方法建立的，但是只使用了單個的IL18濃度(10nM)。同時也使用與動力學(xué)分析相同的結(jié)合^t型擬合數(shù)據(jù)，由于報告解離速率使用一種分析物濃度，該值更適合用于排序而不是給出確切的動力學(xué)測量，作為將選擇何種抗體將;故進(jìn)一步研究的方法。在25。C時的初始結(jié)果指示，所有的構(gòu)建體具有與大鼠2C10親代抗體相似的人IL18結(jié)合親和力。然而，當(dāng)在37。C進(jìn)行解離速率評定實驗時，Ll構(gòu)建體比L2和L3表現(xiàn)差，可見增加的解離速率(表3a和3b)。表3a:人抗-IL18抗體的Biacore分析的動力學(xué)參數(shù)，在25。C時檢觀'J?？贵wkaKdKD(pM)2C102.55e6(7e4)3.5e-5(4.2e-6)13.9(2.2)H1L11.4e64.7e-533.2H1L21.3e6(1.4e5)3.85e-5(1.5e隱5)30.3(8.7)H1L31.25e6(2.1e4)2.8e-5(5.7e-6)22.5(7.2)H2L11.03e6(1.0e5)3.35e-5(Ue-5)33.5(13.4)H2L21.4e6(1.4e5)2.8e陽5(0.0)20.1(1.8)35<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>數(shù)據(jù)兩次實驗的結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。表3b:Biacore檢測與蛋白A捕獲的人源化抗-IL18抗體結(jié)合的人IL18的解離速率評級，在37。C時^r測。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>數(shù)據(jù)一次實驗的結(jié)果。不僅在37X:時表現(xiàn)差，Ll構(gòu)建體結(jié)合恒河猴IL18的親和力在25°C時也同樣不佳(表4a)?；谶@些觀察結(jié)果，在37。C詳細(xì)研究選定抗體與人和恒河猴IL-18的結(jié)合。表4b中顯示的人IL-18的數(shù)據(jù)是六次獨立測定的平均值(和標(biāo)準(zhǔn)偏差)。恒河猴IL-18的數(shù)據(jù)顯示了H1L2和H1L3的兩次使用的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，而H3L2和H3L3的數(shù)據(jù)則來自單次實驗。該數(shù)據(jù)相對較高的標(biāo)準(zhǔn)偏差可能是在37。C時進(jìn)行該實^驗的結(jié)果。Ll構(gòu)建體表現(xiàn)相對較差的事實是令人驚訝的，考慮到Ll和L2構(gòu)建體之間的差異僅在于用苯丙氨酸取代輕鏈第71位酪氨酸的回復(fù)突變。酪氨酸和苯丙氨酸都是芳香族氨基酸，因此在37°C(而非25°C)時，在Biacore系統(tǒng)中觀察到框架結(jié)構(gòu)中這一細(xì)微的改變產(chǎn)生明顯的結(jié)果(對于結(jié)合親和力)是預(yù)料之外的。表4a:Biacore檢測與人源化抗體構(gòu)建體結(jié)合的恒河猴IL-18的動力學(xué)參數(shù)，在25。C時檢測。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>數(shù)據(jù)一次實驗的結(jié)果。表4b:Biacore檢測與人源化抗體構(gòu)建體結(jié)合的恒河猴IL-18的動力學(xué)參數(shù)，在37"C時檢測。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>選擇變體HIL1、H1L2和H1L3用于下節(jié)7.4.2中的進(jìn)一步分析。7.4.2Biacore分析T100數(shù)據(jù)使用T100BiacoreTM儀器進(jìn)一步表征了一些變體抗體。由于使用了可以減小高溫下緩沖液影響的內(nèi)聯(lián)脫氣儀，該儀器在靈敏度、溫度控制和基線在高溫下的穩(wěn)定性方面比BiacoreTM3000更有優(yōu)勢。它還提供了增強(qiáng)的軟件，例如自動數(shù)據(jù)分析。方法基本上與上述7.4.1節(jié)使用的方法相同；將蛋白A通過伯胺偶聯(lián)以2000-6000RU，s的密度固定在CM5芯片上。在HBS-EP(Biacore)中運(yùn)行。捕獲抗IL-18抗體的密度在100-500RUs之間，讓人IL-18以16-0.0625nM的濃度通過該捕獲表面，而雙基準(zhǔn)則使用0nM濃度(即，只注射捕獲抗體的緩沖液)。每次注射IL18后，通過柔和的酸性洗脫液(10mM甘氨酸，pH1.5注射兩次)來再生。該再生步驟/人蛋白A表面去除了捕獲的抗體(以及因此去除了所有結(jié)合其上的IL18)。再生不會顯著改變蛋白A表面結(jié)合以后的抗體峰的能力，允許另一次捕獲事件的發(fā)生。使用T100儀器內(nèi)置的分析軟件，利用1:l結(jié)合模型分析獲得的結(jié)合曲線。在所示溫度下運(yùn)行。在15。C、20°C、25°C、32。C和37。C下分析與H1L1和H1L2的結(jié)合在不同的溫度下利用上述方法進(jìn)行實驗。圖l顯示了溫度對結(jié)合速率(ka)的影響，同時圖2顯示了對解離速率(kd)的影響，圖3顯示了對平衡常數(shù)(KD)的影響。表5詳細(xì)描述了用于繪制這些圖使用的動力學(xué)值。表5:從溫度變化實驗獲得的動力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>H1L23.37e64.22e-512.532H1L13.48e61.64e-447.2H1L24.51e68.57e國518.937H1L16.30e63.36e畫453.3H1L25.89e61.31e-422.3數(shù)據(jù)來自單次實驗。數(shù)據(jù)顯示了測試的兩種抗體的結(jié)合速率在測試的溫度范圍內(nèi)相似，H1L2—般具有更快的結(jié)合速率，直到37。C的最終值之前，此時H1L1具有更快的結(jié)合速率。然而，解離速率顯示出更大的差異，在15°C、20°C、25。C時兩種抗體具有相似的解離速率，但是在32°。和37。C時開始背離，觀察到H1L1更快的解離速率。總平衡常數(shù)(其是kd/ka的函數(shù))反映了這些變化，并且提示H1L1和H1L2之間的差異主要在通過解離速率(kd)定義的抗體/IL18復(fù)合體的穩(wěn)定性方面。在25。C和37。C下分析與H1L1、H1L2、H1L3和嵌合2C10的結(jié)合按上述進(jìn)行實驗。表6詳細(xì)描述了獲得的動力學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)由平衡常數(shù)KD定義的結(jié)合，在25。C和37。C時，H1L2都是比H1L1更好的抗體，但是，動力學(xué)參數(shù)顯示，在25。C時，H1L2具有比H1L1更好的結(jié)合速率(ka)。而在37。C時，位置被顛倒了，指示在37。C時觀察到的H1L2更好的結(jié)合是由于解離速率(kd)的原因，指示使L2區(qū)別于Ll的突變賦予了在更高溫度下的IL18-抗體復(fù)合體增加的穩(wěn)定性。39表6:在25。C和37。C下，與H1L1、H1L2、H1L3和嵌合2C10與人IL18結(jié)合的動力學(xué)在25t:時的人IL18在37。C時的人IL18<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>數(shù)據(jù)是多個獨立數(shù)據(jù)集合的平均值，顯示了平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)獲得的、在25。C和37。C運(yùn)行的H1L1和H1L2的值。7.4.3在IL18結(jié)合ELISA中評估2C10人源化變體利用不同批次的純化抗體，進(jìn)行了至少6次所有9種人源化變體的ELISA。圖4A-4C顯示了來自一次實驗的典型數(shù)據(jù)，所述實驗是表7中所示的產(chǎn)生EC50值排名的實驗。使用2.5|ig/ml的16D10(非中和性小鼠單克隆抗體)將人IL-18固定在NuncMaxisorp96孔平板上，來捕獲5ng/ml的重組人IL-18。將不同抗-IL-18人源化抗體添加到各種稀釋液中。利用抗人IgGFc特異性過氧化物酶綴合物(SigmaA0170)檢測結(jié)合的人源化抗體。表7:2C10人源化變體的增加的EC50值(以[昭/ml]表示)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>所有的標(biāo)準(zhǔn)誤差都在0.001和0.002之間。所有變體的能力都表現(xiàn)得非常接近2C10嵌合體，提示人源化作用只產(chǎn)生了很少的能力喪失。雖然通過這些檢測的若干次重復(fù)而產(chǎn)生的EC50值確實產(chǎn)生了變體的排序，但是，僅ELISA并不能產(chǎn)生這些變體之間的清楚的區(qū)別(參見表7和圖4A-4C)。利用Biacore(參見7.4.1和7.4.2)獲得了變體的一些區(qū)別，其導(dǎo)致在一些利用人和恒河猴IL18的獨立重復(fù)的實驗中4個被檢查的變體更接近了(表8,圖5[人]和6[恒河猴])。表8:4個選定的人源化變體與人IL-18結(jié)合的六次獨立重復(fù)實一驗的EC50值實驗實驗實驗實驗實驗實驗均值SE1/11/22/12/23/13/22C10c0.0150.0160.0130.0110.0200.0200.01580.004H1L20.0290.0300.0210.0250.0240.0270.02600.003H1L30.0270.0250.0290.0280.0290.0270.02750.002H3L20.0320.0300.0260.0180.0250.0220.02550.005H3L30.0350,0280.0180.0210.0250.0250.02530.0067.4.4在IL-18結(jié)合ELISA中評估2C10人源化H1變體用三種人源化H1變體H1L1、H1L2和H1L3進(jìn)行ELISA,在室溫和37。C時，評估其在人血清和封閉溶液(PBS0.05%TWEEN和1%BSA(w/v))中與人IL-18的結(jié)合。將人源化抗體變體以2.5pg/ml固定在NuncMaxisorp96孑L平板上。在室溫和37。C時，在人血清和封閉溶液中，進(jìn)行對5ng/ml的重組人IL-18的捕獲。添加抗IL-18小鼠單克隆抗體16D10。利用抗小鼠k過氧化物酶綴合物(SerotecMCA1291P)檢測結(jié)合的小鼠抗體。表9中顯示了從研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生的典型EC50值。表9:在室溫和37。C下，2C10人源化H1變體的EC50值EC50(ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)誤差室溫孵育存在血清時2C10嵌合體7.2960.358H1L110.1890.512H1L29.7910.471H1L38.9890.411在封閉緩沖液中2C10嵌合體3.8140.068H1L13.3150.136H1L23.5520.079H1L33.7900.133在37t:孵育存在血清時2C10嵌合體10.1401.254H1L112.0690.740H1L29.7910.471H1L311.4381.861在封閉緩沖液中2C10嵌合體3.7940.114H1L13.4300.104H1L23.4040.145H1L33.3340.222通過改變進(jìn)行人IL-18結(jié)合步驟的溫度，在該;險測中從室溫到37°C，三種人源化H1變體的能力不受影響。當(dāng)人血清中存在抗體時觀察到較低的結(jié)合信號。7.4.5在37。C時評估人源化H1變體抗體的穩(wěn)定性42測定三種人源化H1變體H1L1、H1L2和H1L3，在37。C下的人血清和磷酸鹽緩沖鹽水中為期14天的儲存穩(wěn)定性。將抗體稀釋至50pg/ml，在37。C孵育0、1、4、6、8和14天的時間后，通過IL-18結(jié)合ELISA檢測穩(wěn)定性。對于IL-18結(jié)合ELISA,將16D10(非中和性小鼠單克隆抗體)固定在NuncMaxisorp96孔平板上，來捕獲5ng/ml的重組人IL-18。在37。C孵育時程的不同時間點上添加抗-IL-18人源化抗體。利用抗-人IgGFc特異性過氧化物酶綴合物檢測結(jié)合的人源化抗體?；谠谠摍z測模式下所述抗體與人IL-18結(jié)合的能力，延長暴露在37。C溫度下0、1、4、6、8和14天沒有影響人源化H1抗體變體的結(jié)合能力。7.5存在滑液時H1L2與人IL18的結(jié)合將500ng/ml至0ng/ml范圍的重組人IL18摻入到50%人滑液中，實施ELISA。然后將該溶液中含有的IL-18用于用H1L2抗體包^皮的Maxisorp96孔平板(Nunc)的孔中。然后，通過生物素化的抗IL-18抗體(D045-6，MBL)和抗生物素蛋白鏈菌素-HRP檢測結(jié)合的IL-18。滴定50%滑液(SF)中的重組人IL18產(chǎn)生了與滴定緩沖液中的重組人IL18幾乎相同的曲線，僅在半最大值上存在輕微的偏移。參見圖7。這證實了即使存在50%人SF,抗體也具有結(jié)合hIL-18的能力，所述條件更接近地模擬了抗體在治療性場景中將遇到的結(jié)合環(huán)境。7.5.1存在IL18結(jié)合蛋白(IL18bp)時與IL18的結(jié)合使用BiacoreTM技術(shù)(BiacoreTM3000)和ELISA確定當(dāng)存在人IL18bp時，H1L2是否仍然能夠結(jié)合人IL18。IL18bp具有與IL18的高親和力，作為IL-18功能的天然抑制劑而起作用(圖8、圖9A和B、表10和表11)。Biacore檢測簡而言之，通過伯胺偶聯(lián)將蛋白A以約4000共振單位(RU，s)的密度固定在CM5芯片表面上。然后，將濃度為3|xg/ml的重組Fc-IU8結(jié)合蛋白(R&DSystems)以10^1/分鐘的流速通過1分鐘；導(dǎo)致捕獲約1400RU，s的IL-18結(jié)合蛋白。然后，將濃度為30nM的IL18以lOpl/分鐘的流速通過捕獲的IL18結(jié)合蛋白表面5分鐘。此后，將濃度為10nM的大鼠2C10親代抗體以30pl/分鐘的流速通過IL18結(jié)合蛋白/IL18表面3分鐘。IL18上被2C10抗體識別的表位將干擾與IL18結(jié)合蛋白相互作用的位點，則其后應(yīng)該不可見任何結(jié)合信號。圖IO證實了2C10結(jié)合已經(jīng)被hlL-18BP捕獲的hlL-18,指示2C10和hlL-18BP的結(jié)合位點是不重疊的。表10:IL-18BP對IFNy分泌類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜細(xì)胞的影響樣品，IL國18BP狀態(tài)對照IL-12IL國18IL-12+IL-18RA1-ND0.63ND1.63+ND0.29ND0.13RA2-ND0.85ND0.70+ND0.10ND0.10RA3-ND1.06ND1.62+ND0.32ND0.40ELISA檢測在直接結(jié)合ELISA中測試了人源化H1L2或2C10大鼠MAb與結(jié)合在捕獲IL18BP上的人IL18的結(jié)合，所述ELISA中重組人IL18bp-Fc融合蛋白(R&DSystems#119-BP)以0.5(ig/ml被包一皮在NuncMaxisorp平板上。將重組人IL18(內(nèi)部試劑)以100ng/ml添加到封閉緩沖液(含有1%w/vBSA)中。添加濃度范圍在0.5ng/ml至1]ig/ml的純化抗體。用抗-人k輕鏈的特異性HRP綴合物(Sigma)或抗-大鼠IgGHRP檢測結(jié)合的抗體。圖18A和B舉例說明了獲得的結(jié)果。7.6體外生物測定7.6.1人源化構(gòu)建體在中和KG-1細(xì)月包系IL18應(yīng)激IFN-y釋方文中的活性該檢測測量了特異性地針對IL-18的抗體的中和活性，并且基于IL-18-介導(dǎo)的KG-1細(xì)胞中的IFNi釋放。KG-1(ATCC#CCL-246)是組成型表達(dá)功能性IL-18受體的人骨髓單核細(xì)胞系，因而應(yīng)答外源性IL-18激發(fā)。測定了全部九種人源化變體對KG-1細(xì)胞中人IL18激發(fā)的IFN-y幹放的抑制能力(表12和附圖11)。表12:利用所有九種人源化變體在KG-1生物片企測中中和重組人IL18的IC50值抗體IC50H1L10.071H1L20.033H1L30.027H2L10.145H2L20.054H2L30.046H3L10.027H3L20.035H3L30.0342C10(1)0.0422C10(2)0.039對于4種優(yōu)選的人源化變體還至少實施了6次重復(fù)實驗，所述優(yōu)選的變體在BiacoreTM檢測中表現(xiàn)出與重組的人和恒河猴IL18的最佳親和力。圖8舉例說明了四種優(yōu)選的人源化變體和H1L1的代表性結(jié)果，表13概括了這些檢測的結(jié)果，上述檢測均使用從CHOela細(xì)胞衍生的相同蛋白質(zhì)批次的材料。45表13:在使用4或5種選定的人源化變體的KG-1生物^r測中中和重組人IL18的IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在比較H1L1和其它人源化變體的情況下，H1L1表現(xiàn)出比測試的其它四種人源化構(gòu)建體以及2C10親代MAb更低的效^介。用四種優(yōu)選的單克隆抗體還實施了進(jìn)一步的分析，比較了對人IL18激發(fā)的KG-1細(xì)胞釋放IFN-y的抑制能力2C10和從2C10衍生的人源化變體(H1L1、H1L2和H1L3)。在96孔平板中實施KG-1生物測定，通過在37。C和5%C02中孵育50ng/ml的重組人IL-18和不同濃度的特異性IL18的抗體(從2昭/ml至7.8ng/ml，二倍稀釋)或陰性的同種型對照(Synagis,抗-RSV抗體)，然后每孔添加3.105KG-1細(xì)胞。最終將平板在37t、5%C02中孵育20-24小時。收獲上清液，利用商購的人IFNyELISA試劑盒(BiosourceAHC4432;AHC4539)測定IFNy產(chǎn)量。已經(jīng)實施了三種實驗。根據(jù)陰性對照將對IL-18激發(fā)的IFNy生產(chǎn)的抑制結(jié)果歸一化。統(tǒng)計分析的目標(biāo)是獲得在針對任何Synagis應(yīng)答調(diào)整后，對每種實驗的每種mAb的IC50估計值。然后在統(tǒng)計學(xué)上分析IC50估計值，產(chǎn)生具有95%置信區(qū)間(即，統(tǒng)計學(xué)似然范圍)的每種mAb的IC50綜合估計值。最終使用鄧奈特氏檢驗(Dunnett，stest)將每種人源化變體與2C10進(jìn)行回顧比較。圖12舉例說明了代表性的實^r。表14和圖13顯示了在95%置信區(qū)間下對每種單克隆抗體的IC50的綜合估計值，以及在p值和置信區(qū)間下與大鼠2C10的％變化。表14:在KG-1生物測定中IL18激發(fā)的IFNy生產(chǎn)的中和作用的IC50值單克隆抗平均IC50^g/ml%變化vs2C10Dunncttp體(95%CI)(95%CI)值2C100.095(0.071,0.127)--H1L10.352(0.264,0.470)269.4(117.2,528.2)0扁1H1L20.154(0.112,0.211)61.5(-7.6，182.0)0.0968H1L30.164(0.121,0.221)71.6(-0.4,195.8)0.0519H1L1的效價在統(tǒng)計學(xué)上顯著地低于2C10(p<0.001)。其它人源化變體則未顯著地區(qū)別于2C10,雖然H1L3與2C10的比較位于界限上。7.6.2H1L2在中和激發(fā)的人PBMC中IFN々釋放的活性用重組人IL18和抗-CD3抗體激發(fā)來自三個供體的人PBMC,并添加所研究的四種選定的人源化抗體變體的稀釋梯度。每個供體都包括了親代2C10抗體和IL18bp作為比較。對于三個供體中的兩個，IL18和抗-CD3的激發(fā)是失敗的，沒有檢測到任何IFN-Y。在余下的供體中，低濃度時的結(jié)果差異很大，但是通過添加各種抗-IL18抗體，包括人源化變體，都可以實現(xiàn)對IL18誘導(dǎo)的IFN-Y生產(chǎn)的完全抑制。參見圖14。還用LPS激發(fā)的人PBMC進(jìn)行實驗，所述激發(fā)也導(dǎo)致IL18的產(chǎn)生和相關(guān)的IFNy釋放。LPS以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)IFNy產(chǎn)生，以1嗎/ml的固定濃度添加2C10親代單克隆抗體完全抑制了該激發(fā)作用，指示所述效應(yīng)是IL18介導(dǎo)的，并且可以中和內(nèi)源性IL18(未顯示數(shù)據(jù))。在全血中也可以證實該效果，但是2C10的抑制效應(yīng)雖然還是劑量依賴性的，但是卻較不明顯(數(shù)據(jù)未顯示)。圖9舉例說明了3個獨立供體和用親代大鼠單克隆2C10、HlL2和IL18bp抑制的實驗結(jié)果。供體1和3產(chǎn)生了相似的結(jié)果，而供體2對LPS激發(fā)沒有表現(xiàn)出IFNy釋放(未顯示)。當(dāng)存在添加了〉1pg/ml抗體或IL18bp的10%或25%的人血清時，可以完全抑制IL18介導(dǎo)的IFNy釋放。在10ng/ml及以上就已經(jīng)可以觀察到抑制作用，表11顯示了存在10%或25%的人血清時該抑制作用的IC50值。表ll:在存在人血清時，利用2C10、H1L2和IL18bp抑制LPS-激發(fā)的IFNy釋放的IC50值，所述釋放是由內(nèi)源性IL18中和作用導(dǎo)致的<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>7.6.3與IL18直系同源物結(jié)合的才既述利用ELISA和Biacore以及KG-1細(xì)胞生物測定檢驗了抗體與來自其它物種的IL18的結(jié)合。這首先利用親代2C10和嵌合2C10c對恒河猴/短尾猴進(jìn)行，但是采用一些人源化變體重復(fù)。利用Biacore和ELISA測試了親代2C10與豬、小鼠和大鼠IL18的結(jié)合，測試了4種最佳的人源化變體與恒河猴/短尾猴和狗IL18的結(jié)合。用恒河猴/短尾猴IL18和三種單克隆抗體、2C10嵌合體和代表性的人源化變體H3L3,實施KG-1生物測定?？紤]到所有人源化變體的相似性，它也可能代表產(chǎn)生的其它變體，包括H1L2(參見表15,圖8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如預(yù)期，比較來自所有四種抗體的CD光譜的形狀，顯示了它們的結(jié)構(gòu)是高度P折疊的，并且具有基本相同的構(gòu)造。CD揭示了，在4°C-37°C的溫度范圍內(nèi)，三種抗體(H1L1、H1L2、H1L3)的二級結(jié)構(gòu)沒有表現(xiàn)出任何顯著的改變。但是，在該溫度范圍內(nèi)，2C10抗體嵌合體在結(jié)構(gòu)上確實表現(xiàn)出輕微的減少。這與下表16中給出的熱穩(wěn)定性趨勢是一致的。表16:IL18抗體的熱變性抗體H1L1H1L2H1L3嵌合體Tm73°C70。C67。C65°C丁111=變性/解鏈溫度H1L1、H1L2和H1L3在遠(yuǎn)高于37°C的條件下也明顯地是穩(wěn)定的，在體溫下沒有任何變性的信號。因此，它們在熱穩(wěn)定性上的差異在正常體溫和環(huán)境溫度下不太可能賦予任何差異性優(yōu)勢。權(quán)利要求1、人源化的抗-白介素-18抗體，包含具有下列互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重鏈和輕鏈CDRH1SEQ.I.D.NO1CDRH2SEQ.I.D.NO2CDRH3SEQ.I.D.NO3CDRL1SEQ.I.D.NO4CDRL2SEQ.I.D.NO5CDRL3SEQ.I.D.NO6。2、人源化的抗白介素-18抗體，包含具有下列CDR的重鏈和輕鏈CDRH1:SEQ丄D.NO:lCDRH2:SEQ丄D.NO:2CDRH3:SEQ.I.D.NO:3CDRL1:SEQ丄D.NO:4CDRL2:SEQI.D.NO:5CDRL3:SEQ丄D.NO:6其中用在衍生CDR的供體抗體中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)殘基取代了所述輕鏈的第71位殘基。3、人源化的抗-白介素-18抗體，包含移植到人受體框架區(qū)上的從供體抗體衍生的CDR,所述抗-白介素18抗體包含具有在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的序列的CDR,其中所述抗-白介素18抗體的輕鏈的第71位殘基與在供體抗體框架中的相應(yīng)位置中發(fā)現(xiàn)的殘基相同。4、人源化的抗-白介素-18抗體，包含在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的序列的CDR,所述抗體在所述輕鏈的第71位包含酪氨酸。5、人源化的抗-白介素-18抗體，包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陳列的CDR的重鏈和具有在SEQIDNO:4、5和6中陳列的CDR的輕鏈，其中所述輕鏈的CDR是/人一種供體抗體衍生的，在該供體抗體的輕鏈的第71位具有酪氨酸。6、人源化的抗-白介素-18抗體，包含來自供體抗體的CDR并且在所述人源化抗體的輕鏈的第71位處包含酪氨酸，其中所述供體抗體是2C10或其框架變體(即，人源化抗體包含與2C10相同的CDR,但是不同的框架，參見US專利6,706,487)。7、人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)重鏈，其具有含有移植到人重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列的CDR,和(b)輕鏈，其具有含有移植到人輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的CDR，其中所述人輕鏈?zhǔn)荏w框架包含SEQIDNO:38并且其中SEQIDNO:38的第71位是酪氨酸。8、人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)重鏈，其包含具有在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列的CDR,和(b)輕鏈，其包含具有在移植到人輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的CDR,其中所述人源化的抗-白介素-18抗體的所述輕鏈?zhǔn)荏w框架是在SEQIDNO:38中陳列的序列的變體，其中所述變體在第71位包含酪氨酸，并且其中所述變體與具有在SEQIDNO:38中陳列的序列的框架具有75%或更高的同一性。9、人源化的抗-白介素-18抗體，所述抗體包含(a)從供體抗體衍生的在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的序列的CDR,所述供體抗體在供體抗體第71位含有酪氨酸；(b)人受體框架，所述受體框架在人輕鏈第71位包含苯丙氨酸；其中，抗-白介素18抗體在輕鏈第71位包含酪氨酸。10、人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)從供體抗體衍生的在SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的CDR，所述供體抗體在供體抗體輕鏈第71位包含芳香族氨基酸；(b)人受體框架，所述受體框架在輕鏈?zhǔn)荏w框架第71位包含與(a)部分中的芳香族氨基酸不同類型的芳香族氨基酸；其中所述的抗-白介素18抗體包含從(a)部分的抗體衍生的輕鏈，該輕鏈在第71位具有芳香族氨基酸。11、人源化的抗-白介素-l8抗體，當(dāng)在37。C用表面等離子體共振(例如，BmcoreTMT100)測量時，所述抗體針對人IL-18表現(xiàn)出90pM或更大的結(jié)合親和力(KD)。12、人源化的抗-白介素-18抗體，所述抗體包含SEQIDNO:l、2、3、4、5和6中陳列的CDR,當(dāng)在37。C用表面等離子體共振(例如，BmcoreTMT100)測量時，所述抗體針對人IL-18表現(xiàn)出90pM或更大的結(jié)合親和力(KD)。13、人源化的抗-白介素-18抗體，當(dāng)在37。C用表面等離子體共振(例如，BiacoreTMT100)測量時，針對與人IL-18的結(jié)合，所述抗體表現(xiàn)出0.0002(1/s)或更低的解離速率(kd)。14、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重鏈的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的一個或多個殘基與所述供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中所述輕鏈的第71位以及任選的第45、83、84、85位的一個或多個(例如，全部)殘基與所述供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。15、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重鏈的第27、28、29、93位的一個或多個殘基與所述供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中，所述抗-白介素-18抗體的輕鏈的第71位的殘基與所述供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。16、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重鏈的第27、28、29、39、40、93位的殘基與所述供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中所述輕鏈的第71位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。17、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重《連的第27、28、29、36、39、40、71、89、91、93位的殘基與所述供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中所述輕鏈的第71位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。18、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w片匡架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重鏈的第27、28、29、93位的一個或多個殘基與所述供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中所述抗-白介素-18抗體的輕《連的第71、45、83、84、85位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。19、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重鏈的第27、28、29、93、39、40位的殘基與所述供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體衍生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中所述抗-白介素-18抗體的輕鏈的第71、45、83、84、85位的殘基與所述供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。20、人源化的抗-白介素-18抗體，該抗體包含(a)包含從供體抗體衍生的CDR的重鏈，所述CDR具有移植到重鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:l、2和3中陳列的序列，所述重鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:37中陳列的序列，其中所述重鏈的第27、28、29、93、39、40、36、71、89、91位的殘基與供體抗體重鏈中的相應(yīng)殘基相同；(b)包含從供體抗體書f生的CDR的輕鏈，所述CDR具有移植到輕鏈?zhǔn)荏w框架上的在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列，所述輕鏈?zhǔn)荏w框架具有在SEQIDNO:38中陳列的序列，其中所述抗-白介素-18抗體的輕鏈第71、45、83、84、85位的殘基與供體抗體輕鏈中的相應(yīng)殘基相同。21、人源化的抗-白介素-18抗體，包含選自SEQIDNO:9、SEQIDNO:17、SEQIDNO:21的重鏈和選自SEQIDNO:13、SEQIDNO:29的輕鏈。22、人源化的抗-白介素-18抗體，包含SEQIDNO:9的重鏈和SEQIDNO:13的輕鏈，或者SEQIDNO:9的重鏈和SEQIDNO:29的輕鏈。23、人源化抗-白介素-18抗體，包含SEQIDNO:17的重鏈和SEQIDNO:13的輕鏈，或者SEQIDNO:17的重鏈和SEQIDNO:29的輕鏈。24、人源化抗-白介素-18抗體，包含SEQIDNO:21的重鏈和SEQIDN〇:13的輕鏈，或者SEQIDNO:21的重鏈和SEQIDNO:29的輕鏈。25、人源化的抗-白介素-18抗體，包含(a)重鏈，其具有允許與人IL-18特異性結(jié)合的CDR,和(b)輕鏈，其包含具有含有在SEQIDNO:4、5和6中陳列的序列的CDR的受體框架，并且在第71位具有酪氨酸殘基。26、包含重鏈和輕鏈的人源化的抗-白介素-18抗體，其中，在25。C時所述抗體和人IL-18的結(jié)合的解離速率(kd)與在37。C時所述抗體和人IL-18的結(jié)合的解離速率(kd)之間的比值是1:5(或1:小于5),其中所述抗體包含從供體抗體衍生的CDR和人受體框架，并且其中所述人受體框架輕鏈的第71位的殘基被所述供體抗體的相應(yīng)殘基取代了。27、根據(jù)權(quán)利要求26的人源化的抗體，其中CDR具有在SEQ丄D.NO:1、2、3、4、5和6中陳列的序列。28、根據(jù)權(quán)利要求26或27的人源化的抗體，其中所述人受體框架的輕鏈的第71位的殘基是芳香族氨基酸，優(yōu)選地是苯丙氨酸，并且在所述供體抗體中的相應(yīng)殘基是不同類型的芳香族氨基酸，優(yōu)選酪氨酸。29、藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項的抗-白介素-18抗體和藥學(xué)上可接受的載體。30、根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項的抗-白介素-18抗體在生產(chǎn)用于治療自身免疫病例如多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸病(IBD)和牛皮癬的藥物中的用途。31、權(quán)利要求31在生產(chǎn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。32、權(quán)利要求1至28中任一項的抗體，用于治療自身免疫病例如多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸病(IBD)和牛皮癬。33、治療患有自身免疫病例如多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、炎性腸病(IBD)和牛皮癬的人類患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項的抗體。34、生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項的抗體的方法，所述方法包括在允許表達(dá)所述抗體的條件下，培養(yǎng)用包含編碼所述抗體的多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。35、權(quán)利要求34的方法，其中所述條件包括在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。36、權(quán)利要求34或35的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。37、權(quán)利要求36的方法，其中所述宿主細(xì)胞是CHO或NSO。38、權(quán)利要求37的方法，其中在用所述多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化前，所述CHO細(xì)胞是DHFR-CHO細(xì)胞。39、篩選用于治療用途的抗體(特別是抑制配體和受體之間相互作用的抗體，例如抗-白介素-18抗體)的方法，所述方法包括(a)在'30至45°C(優(yōu)選的37°C)的溫度下測量抗體對抗體特異性結(jié)合的抗原的結(jié)合親和力(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(b)在20至25°C(優(yōu)選的25°C)的溫度下測量抗體對抗體特異性結(jié)合的抗原的結(jié)合親和力(使用例如BmcoreTM表面等離子體共振)；(c)如果(a)的親和力大于(b)的親和力，優(yōu)選地，如果(a)的親和力比(b)的親和力大2倍或更多，更優(yōu)選地，4倍或更多，則選擇所述抗體用于治療用途。40、篩選用于治療用途的抗體(特別是抑制配體和受體之間相互作用的抗體，例如抗-白介素-18抗體)的方法，所述方法包括(a)在30至45°C(優(yōu)選的37°C)的溫度下測量抗體與抗體特異性結(jié)合的抗原的解離速率(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(b)在20至25°C(優(yōu)選的25°C)的溫度下測量抗體與抗體特異性結(jié)合的抗原的解離速率(使用例如BiacoreTM表面等離子體共振)；(c)如果(a)的解離速率低于(b)的解離速率，則選擇所述抗體用于治療用途。全文摘要本發(fā)明公開了人源化的抗-IL-18抗體、生產(chǎn)方法和用該抗體治療的方法。還公開了使用例如樣品表面等離子共振的篩選方法來鑒別具有治療潛力的抗體。文檔編號C07K16/24GK101454343SQ200780018859公開日2009年6月10日申請日期2007年5月23日優(yōu)先權(quán)日2006年5月25日發(fā)明者I·柯比,J·H·艾利斯,P·A·漢布林,V·格爾馬謝夫斯基申請人:葛蘭素集團(tuán)有限公司