專利名稱：被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被融合或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的治療性蛋白或肽，其血清穩(wěn)定性或體內(nèi)循環(huán)半衰期被提高，轉(zhuǎn)鐵蛋白分子被修飾以減少或抑制糖基化、和/或減少或抑制鐵結(jié)合和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合。特別地，本發(fā)明包括被融合到或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的單鏈抗體。
背景技術(shù)：
天然狀態(tài)下的或者重組制備的治療性蛋白或肽通常是不穩(wěn)定的分子，具有短的血清穩(wěn)定性周期或者短的體內(nèi)循環(huán)半衰期。此外，當(dāng)這些分子被配制特別是在水溶液中用于診斷和治療目的時(shí)，通常是非常不穩(wěn)定的。
只有極少數(shù)實(shí)用辦法可以被用于延長(zhǎng)或提高治療性蛋白分子的體內(nèi)或體外穩(wěn)定性。聚乙二醇(PEG)是可以結(jié)合到蛋白質(zhì)上的物質(zhì)，從而使該蛋白質(zhì)具有長(zhǎng)期、持續(xù)的活性。如果蛋白質(zhì)活性通過(guò)結(jié)合到PEG上被延長(zhǎng)，那么就可以降低該蛋白質(zhì)的施用頻率。但是，PEG結(jié)合常常降低或破壞蛋白質(zhì)的治療活性。在有些情況下，PEG結(jié)合會(huì)降低蛋白質(zhì)的免疫原性，而在其它情況下可能提高其免疫原性。
還可以通過(guò)融合到能夠延長(zhǎng)治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期的蛋白質(zhì)上來(lái)穩(wěn)定治療性蛋白質(zhì)或肽。例如，與處于未被融合狀態(tài)下的治療性蛋白質(zhì)相比，被融合到白蛋白或抗體片段上的治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期被延長(zhǎng)，參見美國(guó)專利5，876，969和 5，766，883。
另一種血清蛋白，糖基化的人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)也已經(jīng)被用于與治療性蛋白質(zhì)一起融合，靶向呈遞到細(xì)胞內(nèi)部，或用于攜帶試劑跨越血腦屏障。通過(guò)將全長(zhǎng)Tf融合到因子上， 這些包含被糖基化的人Tf的融合蛋白已經(jīng)被用于靶向神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)或睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)跨越血腦屏障，參見美國(guó)專利5，672，683和5977，307。在這些融合蛋白中， 該分子的Tf部分被糖基化并結(jié)合兩個(gè)鐵原子，鐵原子是Tf結(jié)合到細(xì)胞上的受體所需的， 并且如這些專利的發(fā)明人所述，Tf引導(dǎo)呈遞NGF或CNTF部分跨越血腦屏障。已經(jīng)通過(guò)將 HIV-I蛋白酶靶向序列插入到糖基化轉(zhuǎn)鐵蛋白的外露表面環(huán)上，研究制備通過(guò)Tf受體靶向呈遞到細(xì)胞內(nèi)部的另一種形式的Tf融合物的可能性，已經(jīng)制備了轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白(Ali 等(1999) J. Biol. Chem. 274(34) :24066-24073)。
血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)是分子量為80，000道爾頓的單聚糖蛋白，其在循環(huán)中結(jié)合鐵，并通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到各種組織中(Aisen等(1980)Ann. Rev. Biochem. 49 357-393 ；MacGiIlivray 等(1981) J. Biol. Chem. 258 :3543-3553,美國(guó)專利 5，026，651)。 Tf是最常見的血清分子之一，包含多達(dá)約5-10 %的總血清蛋白。在酗酒個(gè)體的血液中，存在高水平的缺乏糖的轉(zhuǎn)鐵蛋白，并且這種轉(zhuǎn)鐵蛋白的半衰期(約14-17天)比被糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白(約 7-10 天)更長(zhǎng)。參見 van Eijk 等(1983)Clin. Chim. Acta 132:167-171， Stibler (1991) Clin. Chem. 37 :2029-2037(1991)，Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1) :13-27 和 Stibler 等〃 Carbohydrate-deficient consumption" , Advances in the Biosciences, (Nordmann 等編輯)，Pergamon, 1988，71，353-357)。
Tf的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被充分表征，受體結(jié)合、鐵結(jié)合及釋放以及碳酸鐵的結(jié)合的機(jī)制已經(jīng)被闡述(美國(guó)專利 5，026, 651,5, 986，067 和 MacGillivray 等(1983) J. Biol. Chem. 258(6) :3543-3546) 轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體也已經(jīng)被用于呈遞或攜帶毒性試劑到腫瘤細(xì)胞中，作為癌癥治療的方法(Baselga和Mendelsohn，1994)，而且轉(zhuǎn)鐵蛋白也被用作非病毒性基因治療載體，將DNA呈遞細(xì)胞中(Frank等1994 ；Wagner等1992)。使用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體作為進(jìn)入點(diǎn)來(lái)將蛋白質(zhì)呈遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的能力也已經(jīng)用數(shù)種蛋白質(zhì)和肽證明，包括CD4 (Walus等1996)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Pardridge等，1994)、神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Albeck等)、腸道血管(vasointestinal)肽類似物(Bickel等，1993)、 β -淀粉狀蛋白肽(Saito等，1995)，以及反義寡核苷酸(Pardridge等1995)。
但是，還沒(méi)有修飾或遺傳工程化轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白來(lái)延長(zhǎng)治療性蛋白或肽的體內(nèi)循環(huán)半衰期，或者通過(guò)減少或抑制Tf部分的糖基化或者減少或防止鐵和/或Tf受體的結(jié)合來(lái)提高生物利用度。
抗體及其結(jié)構(gòu) 在血液或其它體液中循環(huán)的抗體被稱作體液抗體，區(qū)別于被結(jié)合到其親本淋巴細(xì)胞上的“膜抗體”。術(shù)語(yǔ)免疫球蛋白通常用于指所有抗體。在人體中，所有的免疫球蛋白被分成五種，稱作IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。每個(gè)免疫球蛋白分子由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，稱作重鏈或輕鏈?！爸劓湣北幻麨間amma(Y)、alpha(a)、mu(l·!)、delta(5)和 epsilon(e)?！拜p鏈”命名為 Iambda(A)或 kappa (κ)。
天然存在的抗體由四條多肽鏈組成兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。每一條重鏈約50-70kDa，每一條輕鏈約25kDa。這些鏈通過(guò)二硫鍵連接在一起?？贵w分子的基本結(jié)構(gòu)具有字母Y的形狀。Y的每一個(gè)臂由一條輕鏈和一條重鏈的部分組成，而Y莖部分由重鏈的剩余部分組成。Y的臂和莖通過(guò)鉸鏈區(qū)連接在一起，鉸鏈區(qū)使得臂能夠活動(dòng)。
抗體的莖和連接到莖的臂部分由免疫球蛋白的恒定區(qū)構(gòu)成。這些區(qū)域具有保守的氨基酸序列，可變性低。臂的相反端是輕鏈的可變區(qū)和由100-110個(gè)氨基酸組成的重鏈，其中為三個(gè)小的非保守氨基酸序列區(qū)域或超變區(qū)。這些區(qū)域負(fù)責(zé)抗原識(shí)別和結(jié)合。
無(wú)論相連的重鏈的類型，所有輕鏈的區(qū)域結(jié)構(gòu)是相同的。每條輕鏈具有兩個(gè)區(qū)域， 八區(qū)和稱作恒定輕鏈或Q的具有相對(duì)不變化的氨基酸序列的區(qū)域。相反，重鏈具有三個(gè) (IgG、IgA、IgD)或四個(gè)(IgM、IgE)恒定區(qū)或C區(qū)，稱作ChI, Ch2，Ch3和CH4，以及一個(gè)可變區(qū)，稱作VH。可替代地，C區(qū)可以按照重鏈類型來(lái)命名；因此，Cε4是指IgE(ε)重鏈的Ch4 區(qū)。
各個(gè)可變輕鏈(Vl)和可變重鏈(Vh)區(qū)含有三個(gè)稱作互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)的超變區(qū)。 這些CDR組合在一起形成結(jié)合抗原的口袋。由于超變區(qū)中的氨基酸序列的可變性，結(jié)合位點(diǎn)的形狀和特性是變化的，該位點(diǎn)結(jié)合抗原的特異性也是變化的。
通常，當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體時(shí)，抗原的不同部分被不同的幼稚(Iiaive)B細(xì)胞識(shí)別。各種B細(xì)胞產(chǎn)生具有略微區(qū)別的結(jié)合位點(diǎn)的抗體。結(jié)果，生成抗體混合物。1977年，George Kohler和Cesar Milstein發(fā)現(xiàn)了一種獲得大量具有相同親合性的單一類型抗體的方法。 Kohler和Milstein用以制備單克隆抗體的方法包括將來(lái)自被免疫的動(dòng)物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備了大量無(wú)限增殖的雜交瘤，并選擇生產(chǎn)期望抗體的雜交瘤。
單克隆抗體是重要的研究工具，被用作治療劑。但是，單克隆抗體是昂貴的，并且難以制備。此外，單克隆抗體比較大，限制其到達(dá)靶向位點(diǎn)。
單鏈抗體 單鏈抗體(SCA)已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的對(duì)象，在診斷和治療應(yīng)用中作為替代單克隆抗體的手段。SCA是遺傳制備的蛋白質(zhì)，具有單克隆抗體的結(jié)合特異性和親合性，但是較小，使得具有更大的毛細(xì)血管滲透性。SCA優(yōu)越于單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)包括在診斷成像和治療中具有更大的組織滲透性，免疫原性問(wèn)題更少，在機(jī)體中更特異地定位于靶向位點(diǎn)，以及更容易和低成本的大量制備。
通常采用短肽接頭連接抗體的Vh和\鏈的可變區(qū)來(lái)制備SCA。用于連接這些可變區(qū)的合適接頭是使V1^nt區(qū)折疊成具有三維結(jié)構(gòu)的單一多肽鏈的接頭，該三維結(jié)構(gòu)保持完整抗體的結(jié)合特異性。對(duì)于單鏈抗體結(jié)合蛋白的理論和制備方法的描述存在于Ladner 等，美國(guó)專利 4，946，778,5, 260，203,5, 455，030 和 5，518，889，以及 Huston 等，美國(guó)專利 5，091，513( “生物合成抗體結(jié)合位點(diǎn)”"(BABS))，這些公開在此全部引入作為參考。根據(jù)上面的專利所采用的方法制備的單鏈抗原結(jié)合蛋白具有與相應(yīng)的Fab片段基本上相似的結(jié)合特異性和親合性。
Fc 區(qū) 當(dāng)抗體被暴露于蛋白質(zhì)水解酶時(shí)，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，生成多種主要片段。保留抗原結(jié)合能力的片段由抗體的Y構(gòu)象的兩個(gè)“臂”構(gòu)成，被稱作Fab (抗原結(jié)合片段)或者Fab' 2, Fab' 2表示兩個(gè)Fab臂通過(guò)二硫鍵連接。生成的其它主要片段組成Y 的單個(gè)“尾部”或中心軸，由于其容易從溶液結(jié)晶，被稱作Fc (結(jié)晶片段)。IgG、IgA、IgM和 IgD的Fc片段由各種抗體的兩個(gè)羧基末端區(qū)域的二聚體構(gòu)成(即，IgG、IgA和IgD的CH2和 Ch3，以及IgM的Ch3和Ch4)。相反，IgE的Fc由其三個(gè)羧基末端的重鏈區(qū)構(gòu)成(C ε 2，C ε 3 禾口 C ε 4)0 Fc片段由抗體生物學(xué)“活性位點(diǎn)”構(gòu)成，該活性位點(diǎn)使得抗體能夠與其它的免疫系統(tǒng)分子或細(xì)胞聯(lián)系，從而激活或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的防御功能。當(dāng)抗體區(qū)域中的活性位點(diǎn)結(jié)合到稱作Fc受體的分子上時(shí)，發(fā)生這種聯(lián)系。
Fc受體是與具有免疫球蛋白Fc區(qū)的分子活性位點(diǎn)高親合性和特異性結(jié)合的分子。Fc受體可能作為完整的膜蛋白存在于細(xì)胞外質(zhì)膜中，或者作為游離的“可溶的”分子存在，在血漿或其它體液中自由地循環(huán)。
五種抗體種類中的每一種具有多種類型的Fc受體，該受體結(jié)合到特定類型的Fc 區(qū)上，具有獨(dú)特的功能。因此，IgE的Fc的受體僅與IgE Fc區(qū)或者分離的IgE Fc片段高親合性地結(jié)合。已知存在特異于Fc受體的不同類型的種類，其識(shí)別和結(jié)合Fc區(qū)中的不同部位。例如，一些IgG Fc受體專一結(jié)合IgG的第二恒定區(qū)(Ch2)，而介導(dǎo)其它免疫功能的Fc 受體專一地結(jié)合IgG的第三恒定區(qū)(Ch3)。其它IgG Fc受體結(jié)合位于Ch2和CH3區(qū)的活性位點(diǎn)，不能結(jié)合單一的隔離的區(qū)域。
一旦被抗體Fc區(qū)活性位點(diǎn)激活，F(xiàn)c受體介導(dǎo)各種主要的免疫殺傷和調(diào)節(jié)功能。某些IgG Fc受體，例如介導(dǎo)直接殺死抗體通過(guò)其Fab臂結(jié)合的細(xì)胞(抗體依賴的細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性--(ADCC))。當(dāng)被IgG結(jié)合時(shí)，其它IgG Fc受體通過(guò)稱作吞噬作用的過(guò)程，刺激一些白細(xì)胞參與和破壞細(xì)菌、病毒、癌細(xì)胞或其它實(shí)體。位于某些稱作B淋巴細(xì)胞的白細(xì)胞上的 Fc受體調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)育成分泌抗體的血漿細(xì)胞。當(dāng)被抗原連接的IgE結(jié)合時(shí)，位于一些稱作嗜堿細(xì)胞和肥大細(xì)胞的白細(xì)胞上的Fc受體起動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)，表現(xiàn)為枯草熱和哮喘。
一些可溶的Fc受體作為血液補(bǔ)體系統(tǒng)的一部分，起動(dòng)能夠殺死細(xì)菌、病毒和癌癥細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。其它Fc受體刺激某些白血球細(xì)胞分泌強(qiáng)有力的調(diào)節(jié)的或細(xì)胞毒性的分子，在遺傳學(xué)上稱作淋巴因子，淋巴因子有助于免疫防御。這些僅僅是抗體Fc受體調(diào)節(jié)的免疫活動(dòng)的少數(shù)代表性例子。
組成抗體功能的氨基酸的大部分是決定抗體結(jié)構(gòu)的分子“支架”(scaffolding)， 一種高度規(guī)則的三維形狀。正是該支架具有正確暴露和空間朝向的抗體活性位點(diǎn)的重要功能，該位點(diǎn)由多個(gè)氨基酸簇構(gòu)成。特定活性位點(diǎn)根據(jù)其功能，可能已經(jīng)被暴露，因而能夠結(jié)合分子受體?？商娲兀囟ǖ幕钚晕稽c(diǎn)可能被隱藏，直到抗體結(jié)合到抗原上，而后支架改變其方向，并隨即暴露抗體的活性位點(diǎn)。然后，被暴露的活性位點(diǎn)結(jié)合到細(xì)胞表面上或者作為可溶分子的部分(例如補(bǔ)體)的特異Fc受體上，接著起動(dòng)特定免疫反應(yīng)。
由于抗體支架的功能是保持和固定其活性位點(diǎn)，以結(jié)合到細(xì)胞或可溶分子上，當(dāng)抗體活性位點(diǎn)作為肽被分離和合成時(shí)，具有完整的抗體分子的免疫調(diào)節(jié)功能。
取決于活性位點(diǎn)肽所結(jié)合的特定類型的Fc受體，該肽可能激活或抑制免疫功能。 如果Fc受體為被結(jié)合到Fc區(qū)的作用激活的類型時(shí)，可選擇地，如果Fc活性位點(diǎn)肽刺激受體時(shí)，發(fā)生激活。產(chǎn)生的刺激的類型包括，但是不限于，直接起作用或者間接地受抗體Fc 區(qū)-Fc受體結(jié)合調(diào)節(jié)。這種功能的例子包括，但是不限于，由特定類型的白細(xì)胞(多核形嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的吞噬作用激活；巨噬細(xì)胞活化；抗體依賴的細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性(ADCC)；天然殺傷(NK)細(xì)胞作用；B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育，以及淋巴細(xì)胞分泌淋巴因子(具有殺傷和免疫調(diào)節(jié)活性的分子)。
發(fā)明_既述 如下文的更加詳細(xì)的描述，本發(fā)明包括包含至少一種抗體或CDR片段，優(yōu)選抗體可變區(qū)的被修飾的Tf融合蛋白，其中Tf部分被遺傳工程改造來(lái)提高該分子的體內(nèi)循環(huán)半衰期或生物利用度。本發(fā)明還包括包含融合蛋白的藥物制劑和組合物，通過(guò)融合到被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上，提高抗體或CDR片段的體內(nèi)循環(huán)半衰期和生物利用度的方法，編碼被修飾的Tf融合蛋白的核酸分子等。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用被修飾的Tf融合蛋白治療患者的方法。
優(yōu)選地，被修飾的Tf融合蛋白包含被修飾來(lái)減少或防止糖基化和/或鐵和受體結(jié)合的人轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf部分。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含被連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的SCA或⑶R片段的“轉(zhuǎn)移體”(“trans-bodies”)。該轉(zhuǎn)移體可以采用不同的抗體可變區(qū)來(lái)構(gòu)建， 用于各種制藥的和診斷的應(yīng)用。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的一種或多種抗原性肽和抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體。這些轉(zhuǎn)移體不僅具有結(jié)合抗原的能力，而且能夠在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供包含一種或多種抗原結(jié)合肽的轉(zhuǎn)移體。
而且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包含被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的抗毒素的抗體。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包含被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子上的⑶R。毒素的例子包括但是不限于肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、難辨梭菌 (Clostridium difficile)禾口炭Iil芽子包桿菌(Bacillusanthracis)。
附圖簡(jiǎn)介 附

圖1顯示人(Hu)轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 3的氨基酸1-331和332-679)的比對(duì)，相似和相同部分用高亮顯示。
附圖2A-2B顯示來(lái)自不同物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白序列之間的比對(duì)(SEQ IDNO 81-87)。淡陰影相似；濃陰影相同。
附圖3顯示治療性蛋白、多肽或肽的大量Tf外露表面插入位點(diǎn)的位置。
附圖4A-4B顯示用于制備被修飾的融合蛋白的大量?jī)?yōu)選抗-TNF α的抗體的 Vh(SEQ ID NO 88-93)和 Vl(SEQ ID NO 94-44)。
附圖5顯示在存在50U/ml TNF α?xí)r，用N結(jié)構(gòu)域(N-domain) /TNF CDR以及僅N 結(jié)構(gòu)域處理WEHI-164細(xì)胞的吸收值。各個(gè)柱表示各個(gè)條件下的三個(gè)重復(fù)孔的平均值。較高的吸收值表示較高的代謝活性。
詳細(xì)描述 總體描述 本發(fā)明部分地基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)將SCA遺傳融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白、被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白，或轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的足以延長(zhǎng)分子的體內(nèi)半衰期的部分上來(lái)穩(wěn)定抗體、抗體片段、CDR區(qū)和SCA，以提高它們的體內(nèi)血清半衰期和/或活性。被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白包括被共價(jià)連接到SCA抗體或抗體片段上的轉(zhuǎn)鐵蛋白或其結(jié)構(gòu)域，其中與野生型轉(zhuǎn)鐵蛋白序列相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白被修飾以含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入或缺失。在一個(gè)實(shí)施方案中，Tf融合蛋白被工程化來(lái)減少或防止Tf或Tf結(jié)構(gòu)域中的糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Tf蛋白或Tf結(jié)構(gòu)域被修飾以顯示減少或不結(jié)合鐵或碳酸根離子，或者對(duì)Tf受體 (TfR)的親合性降低或不結(jié)合Tf受體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含被融合或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的抗體可變區(qū)的融合蛋白。特別地，本發(fā)明部分地基于使用轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白來(lái)連接至少兩個(gè)抗體的可變區(qū)，形成被修飾形式的SCA。以這種方式形成的SCA融合蛋白能夠結(jié)合目標(biāo)抗原，并且具有轉(zhuǎn)鐵蛋白的長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。
通常，用短肽連接兩個(gè)可變區(qū)來(lái)制備SCA。這種肽可以具有任何序列，通常主要是由于其三維結(jié)構(gòu)而被選擇，而不是其序列同源或生物學(xué)功能。但是，由于這種肽不是天然產(chǎn)物，會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)。與短肽不同，轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種天然存在蛋白質(zhì)，不具有抗原性。采用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為接頭形成的SCA是一種轉(zhuǎn)移體，即具有抗體活性的轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)移體在藥學(xué)上是有用的，并且容易在微生物系統(tǒng)例如酵母中制備。此外，大而可溶的轉(zhuǎn)鐵蛋白主鏈有助于溶解和穩(wěn)定連接在其上的可變區(qū)。轉(zhuǎn)移體可以采用各種可變區(qū)來(lái)制備，被用于各種藥學(xué)和診斷的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)移體，包含轉(zhuǎn)移體的治療性組合物，以及通過(guò)施用轉(zhuǎn)移體來(lái)治療、預(yù)防或緩解疾病或癥狀的方法。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體包括至少一個(gè)抗體可變區(qū)和至少一個(gè)被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的片段或變體，它們相互結(jié)合在一起，優(yōu)選通過(guò)遺傳融合(即，通過(guò)核酸翻譯來(lái)生成轉(zhuǎn)移體，其中編碼抗體可變區(qū)的全部或部分的多核苷酸在讀框內(nèi)與編碼被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的全部或部分的多核苷酸相連接)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含抗體可變區(qū)的轉(zhuǎn)移體，抗體可變區(qū)選自Vh、&或者一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。一旦抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白是轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的一部分時(shí)，可以被稱作轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的“部分”、“區(qū)域”或“部分 (moiety)，，(例如“SCA或抗體可變區(qū)部分”或者“轉(zhuǎn)鐵蛋白部分”) 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移體，其包含或者可替代地由抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白或者被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移體，其包含或者可替代地由生物活性的抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)移體，其包含或者可替代地由抗體可變區(qū)例如人源化抗體可變區(qū)的生物活性和/或治療活性變體與轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含抗體可變區(qū)以及被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物活性和/或治療活性片段的轉(zhuǎn)移體。
此外，本發(fā)明公開包含至少一個(gè)抗原性肽或免疫調(diào)節(jié)肽的轉(zhuǎn)移體。這種轉(zhuǎn)移體不僅能夠結(jié)合其抗原，而且能夠在宿主中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
除非另外定義，在此所用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。雖然任何類似或等同于在此所描述的那些方法和材料的方法和材料可以被用于實(shí)施和驗(yàn)證本發(fā)明，優(yōu)選的方法和材料被描述。
定義 如在此所用，術(shù)語(yǔ)“抗體可變區(qū)”包含一個(gè)或多個(gè)VH、Vl或⑶R區(qū)。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移體”是指具有抗體活性的轉(zhuǎn)鐵蛋白。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移體包含至少一個(gè)抗體可變區(qū)和轉(zhuǎn)鐵蛋白分子、被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段。轉(zhuǎn)移體還包含一種或多種能夠在宿主中引起免疫反應(yīng)的抗原性肽。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指由實(shí)質(zhì)上由一種或多種由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda, alpha、gamma、delta、印silon和mu恒定區(qū)的基因，以及大量免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈 MM^^J kappa Iambda0 Sljl^^ gamma> mu、alpha> delta epsilon, TSiilixiiJft^ 義免疫球蛋白的分類，分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE0 抗體可能以完整的免疫球蛋白存在，或者以各種形式的修飾物存在，包括例如， 僅含有輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段、含有可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab) ‘ 2片段、單鏈抗體(Bird 等，Science 242 :424-426(1988) ；Huston 等，Proc. Natl. Acad, ki. USA 85 :5879-5883(1988)都在此引入作為參考)，等等?？贵w抗原可以是動(dòng)物(特別是小鼠或大鼠)或者人類來(lái)源的，或者是嵌合的(Morrison等，Natl. Acad. Sci. USA81，6851-6855 (1984)在此引入作為參考)或者人源化的(Jones等，Nature 321，522-525 (1986)，和公開的英國(guó)專利申請(qǐng)#8707252，都在此引入作為參考)。如在此所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括這些不同形式。
術(shù)語(yǔ)“抗體的單鏈可變片段”(scFv)或者“單鏈抗體”(SCA)用于此是指含有通過(guò)肽接頭(L)被連接到Vh結(jié)構(gòu)域上的八結(jié)構(gòu)域的多肽，用八-L-Vh表示?？梢灶嵉拱私Y(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域的順序來(lái)獲得稱作為Vh-L-\的多肽?！敖Y(jié)構(gòu)域”或者“區(qū)域”是推定具有分散功能的蛋白質(zhì)區(qū)段，例如具有抗原結(jié)合或抗原識(shí)別功能。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“多價(jià)單鏈抗體”是指通過(guò)肽接頭共價(jià)連接的兩個(gè)或多個(gè)單鏈抗體片段?？蛇B接抗體片段來(lái)形成二價(jià)單鏈抗體，具有如下的\和Vh結(jié)構(gòu)域的順序 Vl-L-Vh-L-Vl-L-Vh ；Vl-L-Vh-L-Vh-L-Vl ；Vh-L-Vl-L-Vh-L-Vl ；或者 Vh-L-Vl-L-VL_L-Vh。單鏈多價(jià)抗體是三價(jià)或者更高價(jià)的，一個(gè)或多個(gè)抗體片段通過(guò)其它中間肽接頭被連接到二價(jià)單鏈抗體上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，\和Vh結(jié)構(gòu)域的數(shù)量是相同的。
如在此所用，“Fv”區(qū)是指含有可變重鏈(Vh)和可變輕鏈的單鏈抗體Fv區(qū)。 重鏈和輕鏈可以來(lái)源于相同的抗體，或者不同抗體從而產(chǎn)生嵌合的Fv區(qū)。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”是指抗體上負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或者“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(Ll)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)，和重鏈可變區(qū)的殘基 31-35 (HI)、50-65 (H2)和 95-102 (H3) (Kabat
SM Wii^lJ (Sequences ofProteins of Immunological Interest) ,H 5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md. (1991))禾口/ 或那些來(lái)自“超變環(huán)”的殘基(即輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32 (Li)、50-52 (U)和91-96 (L3)， 以及重鏈可變區(qū)中的殘基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96-101 (H3) ；Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987))。“架構(gòu)”(Framework)或“FR”殘基是那些不同于在此定義的超變區(qū)殘基的可變區(qū)的殘基。
本領(lǐng)域熟知，抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)是主要決定抗體特異性的抗體部分。CDR 直接與抗原表位相互作用(參見，Clark, 1986 ；Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)中，存在由三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1到CDR3)分開的四個(gè)架構(gòu)區(qū)(FRl到FR4)。架構(gòu)區(qū)(FRs)維持抗體結(jié)合部的三級(jí)結(jié)構(gòu)，抗體結(jié)合部是抗體的一部分，參與與抗原的作用。 ⑶Rs，特別是⑶R3區(qū)，更特別為重鏈的⑶R3，使抗體產(chǎn)生特異性。由于這些⑶R區(qū)特別是 CDR3區(qū)使抗體具有抗原特異性，這些區(qū)域被插入到轉(zhuǎn)移體上，使該單位具有相同的抗原特異性。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定用于合成本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的CDR區(qū)的序列。重鏈可變區(qū)是通常長(zhǎng)度為100-150個(gè)氨基酸范圍的肽。輕鏈可變區(qū)是通常長(zhǎng)度為80-130個(gè)氨基酸范圍的肽。重鏈和輕鏈可變區(qū)中的CDR序列僅包括約3-25個(gè)氨基酸序列，容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)序確定。甚至可以通過(guò)商業(yè)來(lái)源合成這種肽，例如由kripps Protein and Nucleic Acids CoreSequencing Facility 合成(La Jolla Calif·)。
在其它實(shí)施方案中，CDR區(qū)或序列可以作為肽序列文庫(kù)隨機(jī)制備，用標(biāo)準(zhǔn)分析來(lái)篩選具有期望結(jié)合特性或功能特性的CDR區(qū)或序列。在一個(gè)物種中，不同輕鏈或重鏈的構(gòu)架區(qū)的序列相對(duì)保守。如在此所用，“人架構(gòu)區(qū)”是與天然的人免疫球蛋白的架構(gòu)區(qū)實(shí)質(zhì)上相同(約85%或更高，通常約90-95%或更高)的架構(gòu)區(qū)?？贵w的架構(gòu)區(qū)是組成輕鏈和重鏈的組合架構(gòu)區(qū)，起安置(position)和排列⑶R作用。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指如下的一種或組合(a)免疫球蛋白(IgG、 IgM或其它免疫球蛋白)的\區(qū)加;(b)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的 Vl區(qū)加\區(qū)；(c)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的Vh區(qū)加Vh區(qū)；(d)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的單一 \區(qū)；(e)免疫球蛋白(IgG、IgM或其它免疫球蛋白)的單一 Vh區(qū)或者一個(gè)或多個(gè)CDR肽序列；或者(f)具有與CDR肽類似的抗原結(jié)合活性的肽。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“人源化的”是指非人的(例如鼠的)抗體的形式，是特異的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如抗體的Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或者其它抗原結(jié)合亞序列)，含有來(lái)源于非人的免疫球蛋白的最小序列。對(duì)于大部分，人源化的抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的超變區(qū)的殘基被具有期望特異性、親合性和性能的來(lái)自非人物種(供體抗體)的超變區(qū)的殘基取代，非人物質(zhì)例如小鼠、大鼠或兔子。 在有些情形下，人免疫球蛋白的Fv架構(gòu)區(qū)(FR)的殘基被相應(yīng)的非人的殘基取代。而且，人源化的抗體可能包括存在于受體抗體或供體抗體的殘基。進(jìn)行這些修飾來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體性能?？傊?，人源化抗體將包含實(shí)質(zhì)上至少一個(gè)，和通常兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中全部或?qū)嵸|(zhì)上全部超變區(qū)對(duì)應(yīng)于非人類的免疫球蛋白的那些超變區(qū)，全部或者實(shí)質(zhì)上全部FR 區(qū)是人免疫球蛋白的一致序列的那些FR區(qū)。人源化的抗體最佳地還包含至少一部分免疫球蛋白的恒定區(qū)或者結(jié)構(gòu)域(Fe)，通常為人免疫球蛋白的Fc區(qū)。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“生物活性”是指治療性分子、蛋白或肽，優(yōu)選抗體可變片段或 CDR區(qū)，在生物學(xué)范圍內(nèi)(context)(在生物體中或其體外模擬物中)執(zhí)行的功能或一整套的活性。生物活性可以包括但是不限于要求保護(hù)的融合蛋白的抗體部分的功能。如果本發(fā)明的融合蛋白或肽具有抗體的天然配對(duì)物(Counterpart)的一種或多種生物學(xué)活性，或者與被檢測(cè)的轉(zhuǎn)移體的體內(nèi)或體外分析中具有可辨別的反應(yīng)，則融合蛋白或肽被視為具有生物學(xué)活性。
如在此所用，轉(zhuǎn)鐵蛋白序列中的“相應(yīng)氨基酸”或“等價(jià)氨基酸，，是通過(guò)比對(duì)來(lái)最大化第一條轉(zhuǎn)鐵蛋白序列和至少第二條轉(zhuǎn)鐵蛋白序列之間的相同性和相似性而確定的。用于在第二條序列中確定相當(dāng)?shù)陌被岬木幪?hào)是基于用于在第一條序列中確定相應(yīng)氨基酸的編號(hào)。在某些情況下，這些短語(yǔ)被用于描述與兔血清轉(zhuǎn)鐵蛋白或者來(lái)自其它物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白的特定氨基酸相對(duì)的人轉(zhuǎn)鐵蛋白中的氨基酸殘基。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“Tf蛋白片段”或“Tf蛋白”或“Tf蛋白部分”是指包含天然Tf 蛋白或其天然突變體的至少約5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %， 95%, 96%, 97%, 98%, 99%^； 100% 的氨基酸序列。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“基因”是指與生物學(xué)功能相關(guān)的DNA的任何區(qū)段。因此，基因包括，但是不限于，編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)控序列?；蜻€可以包括未被表達(dá)的DNA 片段，例如，構(gòu)成其它蛋白的識(shí)別序列的DNA片段。基因可以從各種來(lái)源中獲得，包括從目標(biāo)來(lái)源中克隆得到，或從已知的或預(yù)測(cè)的序列信息中合成，而且包括具有期望參數(shù)的被設(shè)計(jì)的序列。
如在此所用，“異源多核苷酸”或“異源核酸”或“異源基因”或“異源序列，，或“外源的DNA區(qū)段”是指從特定宿主細(xì)胞之外的來(lái)源獲得的多核苷酸、核酸或DNA區(qū)段，或者，如果來(lái)自相同來(lái)源，則被修飾以區(qū)別于其原始形式。宿主細(xì)胞中的異源基因包括特定宿主細(xì)胞的內(nèi)在的、但是被修飾的基因。因此，該術(shù)語(yǔ)是指細(xì)胞的外源或異源的、或者與細(xì)胞同源但是存在于該宿主細(xì)胞的核酸中的該元件通常不存在的位置上的DNA區(qū)段。作為例子，被連接到人Tf序列上的酵母細(xì)胞天然信號(hào)序列是異源的。
如在此所用，“被分離的”核酸序列是指基本上不含有其它核酸序列的核酸序列， 例如通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定至少約20%純度，優(yōu)選至少約40%純度，更加優(yōu)選至少約 60%純度，甚至更加優(yōu)選約80%純度，最優(yōu)選約90%純度，和甚至最優(yōu)選約95%純度。例如，可以通過(guò)在遺傳工程加工中將核酸序列從其天然位置重新定位到其將被復(fù)制的不同位置上的標(biāo)準(zhǔn)克隆操作來(lái)獲得被分離的核酸序列?？寺〔僮骺梢园ㄇ谐头蛛x包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將該片段插入到載體分子上，和將重組載體插入到宿主細(xì)胞中，在宿主細(xì)胞中，核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆被復(fù)制。核酸序列可以是基因組的、cDNA、 RNA、半合成來(lái)源的或它們的任何組合。
如在此所用，當(dāng)DNA編碼序列被翻譯成多肽時(shí)，由于DNA編碼序列之間的讀框內(nèi)融合，兩條或多條編碼序列被認(rèn)為“被連接”或“被融合”。
如在此所用，當(dāng)涉及Tf融合時(shí)，術(shù)語(yǔ)“融合”包括，但是不限于，至少一種治療性蛋白、多肽或肽，優(yōu)選抗體可變區(qū)，被連接到Tf的N末端，被連接到Tf的C末端，被插入到Tf 中的任何兩個(gè)氨基酸之間，和/或替換一部分Tf序列，例如Tf環(huán)。
如在此所用，“被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白”用于此來(lái)指與野生型轉(zhuǎn)鐵蛋白相比，氨基酸序列具有至少一種修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白”是指被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白，減少或無(wú)糖基化，降低或不結(jié)合鐵或碳酸鹽，以及降低或不結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。
如在此所用，“被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白，，被用于此是指通過(guò)將至少一個(gè)被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子(或其片段或變體)融合到至少一個(gè)治療性蛋白分子(或其片段或變體)， 優(yōu)選抗體可變片段或CDR上形成的蛋白質(zhì)。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”或“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。除非特別限定，該術(shù)語(yǔ)包括含有與參比核酸具有類似結(jié)合特性的天然核苷酸的類似物的核酸，并且以與天然核苷酸相似的方式被代謝。除非另外指出，特定核酸序列還含蓄地包括其保守性修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及被明確指定的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼子取代可以通過(guò)生成其中一個(gè)或多個(gè)所選擇(或全部的)密碼子的第三個(gè)位置用混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基取代的序列(Batzer等(1991) NucleicAcid Res. 19 :5081 ；Ohtsuka 等(1985)J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 ；Cassol 等 (1992) ；Rossolini 等(1994)Mol. Cell. Probes 8:91-98)。術(shù)語(yǔ)核酸與基因、cDNA 和由基因編碼的mRNA互換使用。
如在此所用，當(dāng)DNA區(qū)段與另一種DNA區(qū)段處于功能性關(guān)聯(lián)時(shí)，被稱作是“被可操作地連接的”。例如，信號(hào)序列的DNA以參與融合蛋白分泌的前蛋白(pr印rotein)被表達(dá)時(shí)，則其被可操作地連接到編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA上；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子刺激序列的轉(zhuǎn)錄，則被可操作地連接到編碼序列上。一般地，被可操作地連接的DNA序列是相鄰的，并且在為信號(hào)序列或融合蛋白的情況下，為相鄰的并在讀框內(nèi)。但是，增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄被其所控制的編碼序列可以不必是相鄰的。在本文中，連接是通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)連接或在被插入到該位置上的連接物或接頭上進(jìn)行連接來(lái)完成。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指參與結(jié)合RNA聚合酶來(lái)起始轉(zhuǎn)錄的DNA的區(qū)域。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“重組體”是指已經(jīng)用基因或DNA的新組合轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或生物體。
如在此所用，靶向單位、蛋白質(zhì)、多肽或肽是指特異地結(jié)合到特定細(xì)胞類型上[正常(例如，淋巴細(xì)胞)或異常例如(癌細(xì)胞)]的分子，因而可以被用于將轉(zhuǎn)移體或化合物 (藥物或細(xì)胞毒性劑)特異地靶向該細(xì)胞。
如在此所用，“治療性蛋白質(zhì)”是指包括(induce)蛋白質(zhì)、多肽、SCA、抗體可變片段、CDR或肽或其片段或變體，具有一種或多種治療性和/或生物學(xué)活性。術(shù)語(yǔ)肽、蛋白質(zhì)和多肽在此被相互交換使用。此外，術(shù)語(yǔ)“治療性蛋白質(zhì)”是指治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)在的或天然的相關(guān)物(correlate)?！爸委熁钚浴钡亩嚯幕蚓哂小爸委熁钚缘摹钡鞍踪|(zhì)是指具有一種或多種已知的與治療性蛋白質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)的和/或治療性活性的多肽，治療性蛋白質(zhì)例如在此公開或本領(lǐng)域另外知曉的一種或多種治療性蛋白質(zhì)。作為非限制性例子，“治療性蛋白質(zhì)”是用于治療、預(yù)防或緩解疾病、癥狀或紊亂的蛋白質(zhì)。這種疾病、癥狀或紊亂可以是人或非人類動(dòng)物患有的，例如獸醫(yī)用途。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指核酸(即核酸聚合物)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。如在此所用， 術(shù)語(yǔ)“遺傳轉(zhuǎn)化”是指DNA特別是重組DNA轉(zhuǎn)移和結(jié)合到細(xì)胞中。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”是指已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或生物體。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指以確保其功能的方式被插入到生物體、宿主細(xì)胞或載體中的核酸。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”是指細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、生物體、細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物，它們的任何一種的后代，通過(guò)各種轉(zhuǎn)化方法之一接受外源的或被修飾的基因，特別是編碼被修飾的Tf融合蛋白質(zhì)的基因，其中外源的或被修飾的基因來(lái)自與接受外源的或被修飾的基因的生物體種類相同或不同的種類。
“變體” (variants or variant)是指不同于參比核酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或核酸。一般地，變體大體上是非常相似的，并且在許多區(qū)域與參比核酸或多肽相同。如在此所用，“變體”是指本發(fā)明的轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分，其序列區(qū)別于天然治療性蛋白質(zhì)，但是保留至少其一種本文別處或本領(lǐng)域另外知曉的功能的和/或治療的特性。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“載體”泛指任何編碼外源核酸的質(zhì)粒、噬菌?；虿《?。該術(shù)語(yǔ)還被解釋為包括非質(zhì)粒、非噬菌粒和非病毒的化合物，其方便將核酸轉(zhuǎn)移到病毒子或細(xì)胞中， 例如，多溶素化合物等。載體可以是適合作為將核酸或其突變體呈遞給細(xì)胞的呈遞媒介的病毒載體，或者該載體可以是適用于相同目的的非病毒載體。用于將DNA呈遞給細(xì)胞和組織的病毒和非病毒載體的例子在本領(lǐng)域是熟知的，并且被描述在，例如Ma等(1997，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 94 :12744-12746)中。病毒載體的例子包括，但是不限于，重組病毒載體、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺伴隨病毒、重組鳥痘病毒等(Cranage等1986， EMBO J. 5 :3057-3063 ； 1994年8月18日公開的國(guó)際專利申請(qǐng)WO 94/17810 ； 1994年10月 27日公開的國(guó)際專利申請(qǐng)W094/23744)。非病毒載體的例子包括，但是不限于，脂質(zhì)體、DNA 的多胺衍生物等。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“野生型”是指天然存在的多核苷酸或多肽序列。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“毒素”是指生物學(xué)來(lái)源的有毒物質(zhì)。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)”是指在B細(xì)胞或T細(xì)胞水平上提高或降低抗原特異的免疫反應(yīng)的能力。可以例如在T細(xì)胞增殖分析中，通過(guò)測(cè)定抗體生成、淋巴因子生成或T 細(xì)胞響應(yīng)來(lái)檢測(cè)免疫調(diào)節(jié)活性。特別地，除了影響T細(xì)胞反應(yīng)，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)多肽可能結(jié)合到B細(xì)胞表面的免疫球蛋白(即抗體)分子上，影響B(tài)細(xì)胞反應(yīng)。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)肽”是影響免疫反應(yīng)的肽。
如在此所用，術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”是指由恒定區(qū)組成的抗體分子的莖部。Fc區(qū)也被稱作效應(yīng)區(qū)。Fc區(qū)與免疫系統(tǒng)的其它組分相互作用，將存在細(xì)菌的信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞反應(yīng)?？贵w的Fc區(qū)是在免疫反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生不同讀出(readout)的重要區(qū)域。該區(qū)域由重鏈組成，在免疫反應(yīng)過(guò)程中改變讀出的方式將會(huì)改變抗體的Fc區(qū)的結(jié)構(gòu)。通過(guò)改變恒定區(qū)，將改變抗體的類型。該過(guò)程被稱作類別轉(zhuǎn)換(class switching)，發(fā)生在B淋巴細(xì)胞中。
單鏈抗體和轉(zhuǎn)移體 與常規(guī)抗體相比，單鏈抗體較小，可以極低的成本制備。單鏈抗體小，可能降低機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而提高治療應(yīng)用的安全性和效率。而且，單鏈抗體可以被加工成具有高度抗原性。
各種單鏈抗體(SCA)最初被發(fā)明來(lái)簡(jiǎn)化抗體篩選和生產(chǎn)。但是，由于個(gè)體小，會(huì)發(fā)生自凝聚，并且體內(nèi)半衰期短，單鏈抗體被證明具有有限的治療價(jià)值或者無(wú)治療價(jià)值。將轉(zhuǎn)鐵蛋白添加到SCA上，顯著地提高SCA的體內(nèi)半衰期、穩(wěn)定性，并且容易制備。
因此，來(lái)自SCA的組分可以被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的N末端、C末端或者N末端和C末端上(VpV1^P/或一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū))。還可以采用轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同部分或結(jié)構(gòu)域來(lái)進(jìn)行這種融合，例如N結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域。這些蛋白可以被直接融合或者采用各種長(zhǎng)度的接頭肽來(lái)融合。還可能將活性SCA的全部或部分融合在轉(zhuǎn)鐵蛋白的支架中。 在這種情況下，通過(guò)將SCA的cDNA插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白的cDNA中，在細(xì)胞中生產(chǎn)融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將兩個(gè)Vh區(qū)或兩個(gè)\區(qū)連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的兩端，或者插入轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將一個(gè) Vh區(qū)或一個(gè)\區(qū)連接到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的兩端，或者插入轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白中。通過(guò)接頭(L)將可變區(qū)相互連接，然后融合或插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白中。接頭是被共價(jià)地連接到可變結(jié)構(gòu)域上的分子，使得容易連接或插入到Tf上?？偟膩?lái)說(shuō)，接頭和Tf在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生足夠大的空間和靈活性，使得結(jié)構(gòu)域能夠形成一種構(gòu)象，在該構(gòu)象中， 結(jié)構(gòu)域能夠特異地結(jié)合其所定向的表位。此外，可以修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白，使得連接到兩個(gè)末端的可變區(qū)緊貼在一起。這種修飾包括，但是不限于，去除C末端脯氨酸和/或接近Tf的C末端的半胱氨酸環(huán)，產(chǎn)生更大的靈活性。
本發(fā)明還包括多價(jià)轉(zhuǎn)移體。具有Vh-L-Vh順序的抗體可變區(qū)可以被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白的一端，而具有\(zhòng)-L-Vj幌序的抗體可變區(qū)可以被融合到同一個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白的另一端。本發(fā)明還包括形成多價(jià)SCA的可變區(qū)的其它序列。例子包括，但是不限于，Vh-L-I和八-L-Vh,以及具有更多可變區(qū)相互連接的那些序列。還可以將可變區(qū)和接頭插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中。
可替代地，多價(jià)抗體的可變區(qū)可以通過(guò)將可變結(jié)構(gòu)域插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中來(lái)形成，而不使用任何非自然的肽接頭。通過(guò)這種方式，轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中作為接頭的部分在可變結(jié)構(gòu)域之間形成空間和靈活性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以將結(jié)合相同抗原的可變區(qū)融合到相同轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同末端。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，結(jié)合不同抗原的可變區(qū)被融合到相同的轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白的不同末端。這種轉(zhuǎn)移體能夠連接兩種不同抗原或者結(jié)合和/或激活兩種不同的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供被融合到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白上的嵌合抗體可變區(qū)。此外，該可變區(qū)可以被插入到轉(zhuǎn)鐵蛋白或被修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白分子中。
本發(fā)明包括特異地結(jié)合期望多肽、肽或表位的轉(zhuǎn)移體。如果1)轉(zhuǎn)移體具有結(jié)合活性的閾值，和/或2)不會(huì)顯著地與無(wú)關(guān)的多肽分子發(fā)生交叉反應(yīng)，則轉(zhuǎn)移體被確定是特異地結(jié)合。在某些情況下，如果轉(zhuǎn)移體結(jié)合期望多肽、肽或表位的親合性超過(guò)結(jié)合對(duì)照多肽的親合性至少10倍，則轉(zhuǎn)移體發(fā)生特異性結(jié)合。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移體具有IO6M-1或更高的結(jié)合親合性(Ka)，優(yōu)選為ΚΛΤ1或更高，更加優(yōu)選為IO8M4或更高，最優(yōu)選為IO9M4或更高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移體的結(jié)合親合性容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用標(biāo)準(zhǔn)的抗體親合性分析方法來(lái)確定， 例如 Scatchard 分析(Scatchard, G.，Ann. NY Acad. Sci. 51 :660-672,1949)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果轉(zhuǎn)移體未顯著地與無(wú)關(guān)多肽發(fā)生交叉反應(yīng)，則被確定發(fā)生特異性結(jié)合。如果采用標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡分析檢測(cè)到期望的多肽、肽或表位，但是未檢測(cè)到無(wú)關(guān)多肽，則轉(zhuǎn)移體未顯著地與無(wú)關(guān)多肽分子發(fā)生交叉反應(yīng)。在有些情況下，無(wú)關(guān)多肽是orthologs，來(lái)自相同物種的蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)家族的成員。
制備轉(zhuǎn)移體的抗體可變區(qū) 將來(lái)自許多抗體的可變區(qū)轉(zhuǎn)化成適合插入轉(zhuǎn)鐵蛋白來(lái)制備轉(zhuǎn)移體的形式。包括抗 erbB2、B3、BR96、0VB3、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白、Mik-β 1 和 PRl (分別參見 Batra 等，Mol. Cell. Biol. , 11 :2200-2205(1991) ；Batra 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :5867-5871 (1992)； Brinkmann 等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :8616-8620 (1991) ；Brinkmann φ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :547-551 (1993) ；Chaudhary 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :1066-1070(1990) ；Friedman 等’ Cancer Res. 53 :334-339 (1993) ；Kreitman 等’ J. Immunol.，149 :2810-2815(1992) ；Nicholls 等，J. Biol. Chem.，268 :5302-5308(1993)； 和 Wells 等，CancerRes. ,52 :6310-6317 (1992))。
典型地，F(xiàn)v結(jié)構(gòu)域選自本領(lǐng)域知曉的縮寫為沈-10、MOPC 315、741F8、520C9、 McPC 603、Dl. 3、鼠 phOx、人 phOx、RFL3. 8sTCR、lA6、Sel55_4、18-2-3、4-4-20、7Α4_1、 B6. 2、CC49、3C2、2c、MA_15C5/K12G。、Ox 等的單克隆抗體(參見，Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883(1988) ；Huston, J. S.等，SIM News 38(4)(副刊) 11(1988) ；McCartney, J.等，ICSU Short Reports 10 :114(1990) ；Nedelman, Μ. Α.等， J. Nuclear Med. 32(副刊):1005(1991) ；Huston, J. S.等，分子設(shè)計(jì)與建模概念和應(yīng)用 (Molecular Design and Modeling :Concepts and Applications), B 部，J. J. Langone ^m 輯，Methods in Enzymology 203:46-88(1991) ；Huston, J. S.等，單克隆抗體在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用的進(jìn)展(Advances in the Applications ofMonoclonal Antibodies in Clinical Oncology) ,Epenetos, A. A.(編輯)，倫敦，Chapman & Hall (1993) ；Bird, R. Ε.等， Science 242:423-426(1988) ；Bedzyk, W. D.等，J. Biol. Chem. 265 :18615-18620 (1990)； Colcher, D. etal.，J. Nat. Cancer Inst. 82 :1191-1197 (1990) ；Gibbs, R. A. etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4001—4004(1991) ；Milenic, D. Ε. et al. , Cancer Research 51: 6363-6371 (1991) ；Pantoliano, Μ.W. et al. , Biochemistry 30:10117-10125(1991)；Chaudhary, V. K. etal.，Nature 339 :394-397 (1989) ；Chaudhary, V. K. etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1066-1070(1990) ；Batra, J. K. etal. ， Biochem. Biophys. Res. Comm. 171 :1-6(1990) ；Batra, J. K. etal.，J. Biol. Chem. 265 :15198-15202(1990)； Chaudhary, V. K. etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :9491-9494(1990) ；Batra, J. K.等， Mol. Cell. Biol. 11 :2200-2205(1991) ；Brinkmann, U.等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 88 8616-8620(1991) ；Seetharam, S.等，J. Biol. Chem. 266 :17376-17381 (1991) ；Brinkmann, U.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89:3075-3079(1992) ；Glockshuber, R.等，Biochemistry 29 :1362-1367(1990) ；Skerra, Α.等，Bio/Technol. 9 :273-278(1991) ；Pack, P.等， Biochemistry 31:1579-1534(1992) ；Clackson, Τ.等，Nature 352:624-628(1991); Marks, J. D.等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991) ; Iverson，B. L.等，Science 249 659-662(1990) ；Roberts, V. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6654-6658(1990)； Condra, J. H.等，J. Biol. Chem. 265 :2292-2295 (1990) ；Laroche, Y. J. Biol. Chem. 266 :16343-16349(1991) ；Holvoet, P.等，J. Biol. Chem. 266 :19717-19724(1991)； Anand, N. N.等，J. Biol. Chem. 266 :21874-21879 (1991) ；Fuchs, P.等，Bio/Technol. 9 1369-1372(1991) ；Breitling, F.等，Gene 104:104-153(1991) ；Seehaus, Τ.等，Gene 114 :235-237 (1992) ；Takkinen, K. Protein Engng. 4 :837-841 (1991) ；Dreher, Μ. L.等，J. Immunol. Methods 139:197-205(1991) ；Mottez, Ε. φ, Eur. J. Immunol. 21 467-471 (1991) ；Traunecker, Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :8646-8650 (1991)； Traunecker, Α.等，EMBO J. 10 :3655-3659(1991) ；Hoo, W. F. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :4759-4763(1993))。
表1提供各種單克隆抗體，其可變區(qū)和CDR可以用于制備轉(zhuǎn)移體。
權(quán)利要求
1.包含被融合到至少一個(gè)抗體可變區(qū)上的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的融合蛋白，其中相對(duì)于野生型Tf蛋白，該Tf蛋白的糖基化減少。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含VH、\或⑶R區(qū)。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，包含至少兩個(gè)抗體可變區(qū)。
4.權(quán)利要求3的融合蛋白，包含至少Vh和\區(qū)域、Vh和Vh區(qū)或\和八區(qū)。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，包含至少兩個(gè)不同的抗體可變區(qū)。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中不同的抗體可變區(qū)特異地結(jié)合不同抗原。
7.權(quán)利要求3的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗體可變區(qū)非常接近。
8.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到兩個(gè)鄰近Tf環(huán)中。
9.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的C末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
10.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
11.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的脯氨酸殘基被缺失或者用其它氨基酸取代。
12.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中Tf的C末端的半胱氨酸環(huán)被缺失。
13.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端和C末端。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含至少一個(gè)⑶R肽。
15.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR肽特異地結(jié)合抗原。
16.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR肽來(lái)源于抗體。
17.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中CDR肽來(lái)源于肽文庫(kù)。
18.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)特異地結(jié)合腫瘤壞死因子α(TNFa)0
19.權(quán)利要求14的融合蛋白，其中⑶R特異地結(jié)合TNF。
20.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中至少一個(gè)抗體可變區(qū)包含抗體的￥11或\區(qū)的氨基末端結(jié)構(gòu)域。
21.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)CDR。
22.權(quán)利要求21的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)CDRs。
23.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的C末端。
24.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端。
25.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到Tf的至少一個(gè)環(huán)中。
26.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的親合性降低。
27.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳運(yùn)鐵蛋白(乳鐵蛋白)。
28.權(quán)利要求沈的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合TfR。
29.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白對(duì)鐵離子的親合性降低。
30.權(quán)利要求四的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合鐵離子。
31.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含至少一個(gè)防止糖基化的突變。
32.權(quán)利要求31的融合蛋白，其中Tf蛋白是乳運(yùn)鐵蛋白(乳鐵蛋白)。
33.權(quán)利要求1的融合蛋白，在存在抑制糖基化的化合物時(shí)被表達(dá)。
34.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白的C結(jié)構(gòu)域的一部分。
35.權(quán)利要求34的融合蛋白，其中橋連肽將抗體可變區(qū)連接到Tf上。
36.權(quán)利要求34的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到Tf蛋白的N和C結(jié)構(gòu)域之間。
37.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf鉸鏈區(qū)包含至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添力口。
38.權(quán)利要求37的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)選自SEQID NO :3的約殘基94到約殘基96、SEQ ID NO 3的約殘基M5到約殘基M7、SEQ IDNO 3的約殘基316到約殘基318、 SEQ ID NO 3的約殘基425到約殘基427、SEQ ID NO 3的約殘基581到約殘基582，以及 SEQ ID NO 3的約殘基652到約殘基658。
39.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述Tf蛋白基因在SEQID NO :3中的選自Asp 63、 Gly 65,Tyr 95、Tyrl88、Lys 206,His 207,His 249、Asp392、Tyr 426,Tyr 514,Tyr 517、 His 585,Thr 120,Arg 124,Ala 126、Glyl27、Thr 452,Arg 456、Ala 458 和 Gly 459 的位置上具有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。
40.權(quán)利要求25的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)取代至少一個(gè)Tf環(huán)。
41.權(quán)利要求31的融合蛋白，其中糖基化位點(diǎn)選自對(duì)應(yīng)于氨基酸N413、N611的氨基酸殘基。
42.權(quán)利要求沈或觀的融合蛋白，其中Tf在SEQID NO :3中的對(duì)應(yīng)于選自Asp 63、 Gly 65,Tyr 95、Tyrl88、Lys 206,His 207,His 249、Asp392、Tyr 426,Tyr 514,Tyr 517、 His 585,Thr 120,Arg 124,Ala 126、Glyl27、Thr 452,Arg 456、Ala 458 和 Gly 459 的氨基酸殘基上包含至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。
43.包含被融合到至少一個(gè)抗體可變區(qū)上的對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的親合性降低的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)的融合蛋白。
44.權(quán)利要求43的融合蛋白，包含至少兩個(gè)抗體可變區(qū)。
45.權(quán)利要求44的融合蛋白，包含至少Vh和Vl區(qū)域、Vh和Vh區(qū)或Vl和Vl區(qū)。
46.權(quán)利要求43的融合蛋白，包含至少兩個(gè)不同的抗體可變區(qū)。
47.權(quán)利要求46的融合蛋白，其中不同的抗體可變區(qū)特異地結(jié)合不同抗原。
48.權(quán)利要求44的融合蛋白，其中融合蛋白被改造，使得抗體可變區(qū)十分接近。
49.權(quán)利要求48的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被插入到兩個(gè)鄰近的Tf環(huán)中。
50.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的C末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
51.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中一個(gè)抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端，而一個(gè)抗體可變區(qū)被插入到鄰近的Tf環(huán)中。
52.權(quán)利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的脯氨酸殘基被缺失。
53.權(quán)利要求50的融合蛋白，其中TfC末端的半胱氨酸環(huán)被缺失。
54.權(quán)利要求49的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf的N末端和C末端。
55.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含至少一個(gè)⑶R肽。
56.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR肽特異地結(jié)合抗原。
57.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR肽來(lái)源于抗體。
58.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中CDR肽來(lái)源于肽文庫(kù)。
59.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)特異地結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)。
60.權(quán)利要求55的融合蛋白，其中⑶R特異地結(jié)合TNFα。
61.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)包含抗體的Vh或\區(qū)的氨基末端結(jié)構(gòu)域。
62.權(quán)利要求61的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)CDR。
63.權(quán)利要求62的融合蛋白，其中氨基末端結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)CDR。
64.權(quán)利要求1或43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)的血清半衰期被延長(zhǎng)，超過(guò)未被融合狀態(tài)下的抗體可變區(qū)的血清半衰期。
65.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被融合到Tf的C末端。
66.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被融合到Tf的N末端。
67.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中治療性蛋白質(zhì)或肽被插入到Tf的至少一個(gè)環(huán)中。
68.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合TfR。
69.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白對(duì)鐵離子的親合性降低。
70.權(quán)利要求69的融合蛋白，其中Tf蛋白不結(jié)合鐵離子。
71.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白的糖基化減少或未糖基化。
72.權(quán)利要求71的融合蛋白，包含至少一個(gè)防止糖基化的突變。
73.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中所述Tf蛋白包含Tf蛋白的N結(jié)構(gòu)域的一部分、橋連肽和Tf蛋白的C結(jié)構(gòu)域的一部分。
74.權(quán)利要求73的融合蛋白，其中橋連肽將治療性蛋白質(zhì)或肽連接到Tf上。
75.權(quán)利要求73的融合蛋白，其中所述治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽插入到Tf蛋白的N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域之間。
76.權(quán)利要求73的融合蛋白，其中Tf蛋白在Tf鉸鏈區(qū)具有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添力口。
77.權(quán)利要求76的融合蛋白，其中所述鉸鏈區(qū)選自約殘基94到約殘基96、約殘基245 到約殘基M7、約殘基316到約殘基318、約殘基425到約殘基427、約殘基581到約殘基 582，以及約殘基652到約殘基658。
78.權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白選自Asp63、Gly 65、Tyr 95、Tyrl88、Lys 206,His 207,His 249,Asp 392,Tyr 426,Tyr 514,Tyr 517,His 585,Thr 120,Arg 124、 Ala 126,Gly 127,Thr 452,Arg 456,Ala 458和Gly 459的位置上具有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。
79.權(quán)利要求67的融合蛋白，其中治療性蛋白或肽取代至少一個(gè)環(huán)。
80.權(quán)利要求71的融合蛋白，其中糖基化位點(diǎn)選自對(duì)應(yīng)于氨基酸N413、N611的氨基酸殘基。
81.編碼權(quán)利要求1或43的融合蛋白的核酸分子。
82.包含權(quán)利要求81的核酸分子的載體。
83.包含權(quán)利要求82的載體的宿主細(xì)胞。
84.包含權(quán)利要求81的核酸分子的宿主細(xì)胞。
85.表達(dá)Tf融合蛋白的方法，包括在表達(dá)被編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求83 的宿主細(xì)胞。
86.表達(dá)Tf融合蛋白的方法，包括在表達(dá)被編碼的融合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求84 的宿主細(xì)胞。
87.權(quán)利要求83的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
88.權(quán)利要求84的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
89.權(quán)利要求87的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
90.權(quán)利要求88的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
91.包含81的核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
92.制備Tf融合蛋白的方法，包括從權(quán)利要求91的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離融合蛋白。
93.權(quán)利要求92的方法，其中Tf融合蛋白包含乳鐵蛋白。
94.權(quán)利要求93的方法，其中融合蛋白從來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物液體中分離。
95.權(quán)利要求93的方法，其中液體是血清或乳汁。
96.治療患者中的疾病或疾病癥狀的方法，包括施用權(quán)利要求1或權(quán)利要求43的融合蛋白的步驟。
97.權(quán)利要求1或權(quán)利要求43的融合蛋白，其中Tf蛋白在蛋白質(zhì)的各端具有N末端結(jié)構(gòu)域。
98.權(quán)利要求97的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)被融合到Tf蛋白的各個(gè)N末端結(jié)構(gòu)域中。
99.權(quán)利要求1或權(quán)利要求43的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)特異性地結(jié)合毒素。
100.權(quán)利要求96的方法，其中抗體可變區(qū)結(jié)合TNF。
101.權(quán)利要求100的方法，其中該疾病選自膿毒性休克；內(nèi)毒素性休克；與細(xì)菌感染、 病毒感染、寄生蟲感染、瘤形成疾病相關(guān)的惡病質(zhì)綜合癥；自體免疫性疾病、炎癥性疾病、關(guān)節(jié)炎，以及與防止移植排斥的處理相關(guān)的副作用。
102.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Tf蛋白包含單一的N結(jié)構(gòu)域。
103.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中Tf中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被取代。
104.權(quán)利要求12a的融合蛋白，其中一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被絲氨酸取代。
105.權(quán)利要求33的融合蛋白，其中化合物是衣霉素。
106.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中融合蛋白已經(jīng)用酶處理來(lái)將部分或全部的糖類去糖基ο
107.權(quán)利要求25的融合蛋白，其中抗體可變區(qū)取代Tf環(huán)的一部分以及鄰近Tf環(huán)的一部分。
全文摘要
本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)鐵蛋白與治療性蛋白或肽優(yōu)選為抗體可變區(qū)的被修飾的融合蛋白，其血清半衰期或者血清穩(wěn)定性被提高。優(yōu)選的融合蛋白包括那些使轉(zhuǎn)鐵蛋白部分不發(fā)生或減少糖基化，結(jié)合鐵離子和/或結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的修飾。
文檔編號(hào)C07K14/705GK102268094SQ201110175090
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者霍馬揚(yáng).薩德吉, 克里斯托弗.P.普里奧爾, 安德魯.特納 申請(qǐng)人:比奧雷克西斯藥物公司